PEG10表達(dá)與原發(fā)性肝癌預(yù)后相關(guān)性分析

張海 胡亞華 朱艷莉 常城 李丹 余力群

·論 著·

PEG10表達(dá)與原發(fā)性肝癌預(yù)后相關(guān)性分析

張海 胡亞華 朱艷莉 常城 李丹 余力群

目的 檢測(cè)PEG10在原發(fā)性肝癌（PHC）組織中表達(dá)的情況，探討其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系及對(duì)肝癌預(yù)后的臨床意義。方法 應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法（SP法）檢測(cè)58例PHC患者肝組織中PEG10的表達(dá)情況，并分析PEG10與PHC臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果 58份PHC標(biāo)本中44份PEG10陽性，其中“+”16份、“++”13份和“+++”15份。平均隨訪時(shí)間為40.5m，至隨訪結(jié)束時(shí)共有23例（39.7％）患者死亡；所有患者中位生存時(shí)間為31m，PEG10表達(dá)為“-”、“+”、“++”、“+++”的中位生存時(shí)間分別為57、34、27和15m，不同PEG10表達(dá)組間生存率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）；PEG10在女性、晚期病例、術(shù)前AFP＞200ng/mL、微血管侵犯、低分化肝癌患者腫瘤組織中表達(dá)更高（P＜0.05），而與患者年齡、腫瘤直徑、病因無關(guān)（P＞0.05）；早期復(fù)發(fā)病例中PEG10陽性比例明顯高于陰性（P＜0.05），而晚期復(fù)發(fā)病例組間無明顯差異（P＞0.05）。PEG10預(yù)測(cè)PHC復(fù)發(fā)的診斷特異度77.5％，敏感度為38.9％，準(zhǔn)確率為65.5％，多因素COX模型中AJCC分期、微血管侵犯、病因和PEG10表達(dá)是影響PHC預(yù)后的危險(xiǎn)因素（P＜0.05），其中PEG10陽性的HR達(dá)6.724。結(jié)論 PEG10對(duì)PHC預(yù)后具有很好的評(píng)估價(jià)值，但是其特異性高而敏感性不高，需要聯(lián)合其他指標(biāo)作出綜合評(píng)價(jià)。

PEG10；原發(fā)性肝癌；復(fù)發(fā)

原發(fā)性肝癌（primary hepatic carcinoma，PHC）是一種高侵襲性惡性腫瘤，由于晚期診斷、腫瘤復(fù)發(fā)和化療藥物耐受等多種風(fēng)險(xiǎn)因素的共同作用，PHC總體預(yù)后相對(duì)較差，辨別預(yù)后不良的患者并進(jìn)行及時(shí)的干預(yù)是提高PHC生存率最有效的方法之一［1］。印跡基因父系表達(dá)基因10（paternally expressed gene 10，PEG10）于2001年首次由 Ono發(fā)現(xiàn)后受到學(xué)界高度關(guān)注，研究表明，PEG10基因的高表達(dá)與腫瘤特別是肝癌發(fā)生關(guān)系密切［2］。本研究采用免疫組化技術(shù)檢測(cè)PHC組織中PEG10的表達(dá)，并分析其與預(yù)后的相關(guān)性，為臨床決策提供更多依據(jù)。

資料和方法

一、研究對(duì)象

選擇2009年2月至2012年11月期間在黃石市中心醫(yī)院肝膽外科擇期行肝癌根治性切除術(shù)的患者，入選標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≤70周歲，性別不限；②腫瘤組織完整切除（指術(shù)后1m影像學(xué)檢查無病灶殘留，同時(shí)手術(shù)切緣病理學(xué)陰性），術(shù)后病理組織學(xué)確診為PHC，術(shù)前術(shù)后均未進(jìn)行放、化療及免疫治療；③了解研究?jī)?nèi)容、愿意配合隨訪并簽署知情同意書。收集患者性別、年齡、腫瘤直徑、美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）分期、分化程度、微血管侵犯、AFP和病因等資料。患者術(shù)后每3個(gè)月復(fù)診1次，根據(jù)需要進(jìn)行體格檢查、影像學(xué)或活體組織檢查，生存期從手術(shù)之日起開始計(jì)算，終止日期為死亡期或末次隨訪日期，截止時(shí)間為2014年12月31日。

二、主要試劑

鼠源性PEG10單克隆抗體，由上海基因科技有限公司生產(chǎn)，按1∶400的體積濃度進(jìn)行稀釋；SP免疫組織化學(xué)染色試劑盒、濃縮型DAB試劑盒均購自北京綠源大德生物科技有限公司。

三、標(biāo)本制備

采用SP法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，石蠟包埋手術(shù)標(biāo)本制成4μm厚切片，抗原修復(fù)采用高壓熱修復(fù)法，在沸水中加入0.01mol/L的檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0），將玻片置于金屬染色架上緩慢加壓30min，蓋上不銹鋼鍋蓋但不鎖定，10min后除去熱源，置入涼水中。鼠源性PEG10單克隆抗體室溫下孵化30min，免疫組化染色SP法檢測(cè)各標(biāo)本組織中PEG10的表達(dá)，操作步驟嚴(yán)格參照試劑盒說明書。以胎盤蛻膜組織切片作陽性對(duì)照，以磷酸鹽緩沖液代替抗體做陰性對(duì)照。

四、檢測(cè)方法

PEG10陽性表達(dá)由兩位高年資的病理科醫(yī)師分別進(jìn)行判斷，PEG10抗原陽性反應(yīng)表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的棕黃色顆粒，按染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞數(shù)占腫瘤細(xì)胞總數(shù)的百分比綜合計(jì)分。每張切片隨機(jī)采集10個(gè)具有代表性的視野以半定量的方法計(jì)算陽性表達(dá)率，根據(jù)胞質(zhì)或胞膜有棕黃色顆粒染色強(qiáng)度分為無色（-）為0分，淡黃色（+）為1分，棕黃色（++）為2分，棕褐色（+++）為3分；陽性細(xì)胞數(shù)：小于總數(shù)的5％（-）計(jì)為0分，5％～25％（+）為1分，26％～50％（++）為2分，大于50％（+++）為3分。染色強(qiáng)度得分與陽性細(xì)胞數(shù)得分相乘，0分計(jì)為陰性（-），1～3分計(jì)為弱陽性（+），4～5分計(jì)為中度陽性（++），≥6分計(jì)為強(qiáng)陽性（+++）［3］。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，其中PEG10蛋白表達(dá)與PHC臨床病理學(xué)特征采用χ2檢驗(yàn)，組間生存情況分析采用Kaplan-Meier分析，不同生存曲線的差異性檢驗(yàn)用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)（Log-rank test）；運(yùn)用多因素COX模型綜合評(píng)價(jià)和權(quán)衡各因素對(duì)預(yù)后生存的影響，均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、一般情況

共收集手術(shù)標(biāo)本58份，PEG10陽性44份（75.9％），其中“+”16份、“++”13份和“+++”15份；隨訪時(shí)間為5～68m，中位隨訪時(shí)間為40.5m，至隨訪結(jié)束時(shí)共有23例（39.7％）患者死亡。

二、PHC組織中PEG10表達(dá)與生存時(shí)間的關(guān)系

所有患者中位生存時(shí)間為31m，PEG10“-”、“+”、“++”、“+++”患者中位生存時(shí)間分別為57、34、27和15m，不同PEG10表達(dá)組間生存率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=40.114，P=0.000），PHC患者生存時(shí)間隨PEG10表達(dá)強(qiáng)度增加而逐漸下降，見表1和圖1。

表1 不同PEG10表達(dá)與生存時(shí)間的關(guān)系

三、PEG10與PHC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

PEG10在女性、晚期病例、術(shù)前AFP＞200ng/mL、微血管侵犯、低分化肝癌患者腫瘤組織中表達(dá)更高（P＜0.05），而與患者年齡、腫瘤直徑、病因相關(guān)性較小（P＞0.05）；早期復(fù)發(fā)病例（≤2y）中PEG10陽性比例明顯高于陰性（P＜0.05），而晚期復(fù)發(fā)病例組間無明顯差異（P＞0.05），見表2。

圖1 不同PEG10表達(dá)與PHC總生存率的關(guān)系

表2 PEG10表達(dá)與PHC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

四、PEG陽性對(duì)PHC復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)價(jià)值

以 PEG10陽性（包括+、++和+++）預(yù)測(cè)PHC復(fù)發(fā)，診斷特異度77.5％，敏感度為38.9％，陽性預(yù)測(cè)值43.75％，陰性預(yù)測(cè)值為73.8％，準(zhǔn)確率為65.5％（Kappa值為0.217，P=0.824）。

五、COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析

對(duì)可能影響原發(fā)性肝癌預(yù)后的9個(gè)相關(guān)因素：患者年齡、性別、腫瘤直徑、AJCC分期、分化程度、微血管侵犯、AFP、病因和PEG10的表達(dá)引入多因素COX模型，結(jié)果顯示，AJCC 分期、微血管侵犯、病因和PEG10的表達(dá)是影響PHC預(yù)后的因素（P＜0.05），其中PEG10表達(dá)HR達(dá)6.724，見表3。

表3 PHC臨床病理特征與生存時(shí)間的多因素COX 回歸分析

討論

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的血清腫瘤標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)，對(duì)惡性腫瘤的早期診斷、疾病發(fā)展以及預(yù)后監(jiān)測(cè)提供了幫助。PEG10基因定位于人類染色體7q21，主要編碼一種與反轉(zhuǎn)錄病毒gagpol蛋白具有高度同源性的蛋白質(zhì)［4］。PEG10基因具有更高的肝癌組織特異性，在相應(yīng)的癌旁組織、正常肝組織中以及其他非肝臟來源的腫瘤細(xì)胞中均不表達(dá)。基礎(chǔ)研究表明，PEG10基因可能存在特異性調(diào)控肝臟細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，上調(diào)PEG10的表達(dá)能促進(jìn)癌前組織向癌組織發(fā)展，而沉默PEG10表達(dá)可以抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)［5］。因此，通過抑制PEG10的表達(dá)，有可能成為抑制PHC發(fā)生和發(fā)展的治療手段，使PEG10具有作為肝癌診斷標(biāo)志物和基因治療新靶點(diǎn)的雙重潛力［6］。

國(guó)內(nèi)外有多項(xiàng)研究表明［7-11］，PEG10表達(dá)與PHC性別、年齡、分化程度、疾病分期等因素相關(guān)。Bang等［12］納入了218例PHC術(shù)后患者進(jìn)行隨訪，發(fā)現(xiàn)PEG陽性是生存時(shí)間的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（HR=2.041）。本組病例中PEG陽性表達(dá)與女性、晚期病例、術(shù)前AFP＞200ng/mL、微血管侵犯、低分化肝癌相關(guān)，而且PEG10是PHC術(shù)后早期復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素，PEG10的表達(dá)強(qiáng)度與中位生存期呈明顯的負(fù)相關(guān)，PEG10表達(dá)用于早期復(fù)發(fā)和生存時(shí)間的預(yù)測(cè)具有可行性。血清AFP是臨床最常用的PHC診斷和檢測(cè)工具，也是判斷預(yù)后和檢測(cè)復(fù)發(fā)的重要指標(biāo)，Cucchetti等［13］認(rèn)為AFP＞60ng/mL是肝癌根治術(shù)后復(fù)發(fā)的高危因素，但由于AFP在肝炎、肝硬化等疾病中也有升高，且有一定的假陽性率，而且PHC患者中只有60％～70％的患者會(huì)出現(xiàn)AFP升高，對(duì)于腫瘤體積較小的患者陽性率更低至33％～65％。同時(shí)AFP的預(yù)測(cè)效能與濃度相關(guān)，當(dāng)術(shù)后AFP≤20ng/mL時(shí)，目前尚無有效的生物學(xué)指標(biāo)進(jìn)行療效檢測(cè)，Bang［12］的研究表明，在AFP≤20ng/mL時(shí)，PEG10依然與復(fù)發(fā)率明顯相關(guān)。因此對(duì)于AFP陰性的患者，PEG10將可成為有效的檢測(cè)指標(biāo)。

值得注意的是，本研究中PEG陰性的患者仍有3例出現(xiàn)早期復(fù)發(fā)，8例晚期復(fù)發(fā)，PEG10診斷效能總體偏低（特異度77.5％、敏感度38.9％、準(zhǔn)確性65.5％），原因除了與本研究樣本量偏少外，影響PHC預(yù)后的因素很多，單獨(dú)某一個(gè)因素的預(yù)測(cè)價(jià)值通常不高。吳鳳霞［14］對(duì)AFP、CK19、PEG10、IQGAP1進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，單項(xiàng)檢測(cè)血清腫瘤標(biāo)志物可能會(huì)出現(xiàn)漏診，聯(lián)合兩個(gè)或多個(gè)標(biāo)志物檢測(cè)可能會(huì)彌補(bǔ)這個(gè)缺點(diǎn)。

綜上所述，PEG10在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起調(diào)控作用，其表達(dá)強(qiáng)度可以反映腫瘤的分化程度及腫瘤的侵襲性，對(duì)PHC預(yù)后具有很高的評(píng)估價(jià)值，但是其特異性高而敏感性不高，所以不能獨(dú)立使用，需要聯(lián)合其他指標(biāo)作出綜合評(píng)價(jià)。

1 Schütte K，Schulz C，Link A，et al.Current biomarkers for

hepatocellular carcinoma：Surveillance，diagnosis and prediction of prognosis.World J Hepatol，2015，7：139-149.

2 Lux H，F(xiàn)lammann H，Hafner M，et al.Genetic and molecular analyses of PEG10 reveal new aspects of genomic organization，transcription and translation.PLoS One，2010，5：e8686.

3 陳錕，解新，孫和國(guó)，等.父系表達(dá)基因10蛋白在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及臨床意義.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2011，8：2951-2953.

4 劉瑤，廖躍光，黃才斌，等.肝細(xì)胞癌組織中PEG10、SIAH2的表達(dá)及其意義.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2012，28：371-377.

5 林昀，張?jiān)汽悾浚?PEG10基因在肝癌組織中高表達(dá)的分子機(jī)制及其功能的研究.腫瘤，2013，33：28-35.

6 高燕，張厚德，林菊生，等.人肝癌父系表達(dá)基因10的遺傳印記狀態(tài).中華肝臟病雜志，2010，18：894-899.

7 Liu DC，Yang ZL，Jiang S.Identification of PEG10 and TSG101 as carcinogenesis， progression， and poor-prognosis related biomarkers for gallbladder adenocarcinoma.Pathol Oncol Res，2011，17：859-866.

8 Saad Y，El-Serafy M，Eldin MS，et al.New genetic markers for diagnosis of hepatitis C related hepatocellular carcinoma in Egyptian patients.J Gastrointestin Liver Dis，2013，22：419-425.

9 Dong H，Zhang H，Liang J，Digital karyotyping reveals probable target genes at 7q21.3 locus in hepatocellular carcinoma.BMC Med Genomics，2011，4：60.

10 Tsuji K，Yasui K，Gen Y，et al.PEG10 is a probable target for the amplification at 7q21 detected in hepatocellular carcinoma.Cancer Genet Cytogenet，2010，198：118-125.

11 Rich N，Singal AG.Hepatocellular carcinoma tumour markers：current role and expectations.Best Pract Res Clin Gastroenterol，2014，28：843-853.

12 Bang H，Ha SY，Hwang SH，et al.Expression of PEG10 Is Associated with Poor Survival and Tumor Recurrence in Hepatocellular Carcinoma.Cancer Res Treat，2015，F(xiàn)eb 13 （Epub ohead of print）.

13 Cucchetti A1，Piscaglia F，Caturelli E，et al.Comparison of recurrence of hepatocellular carcinoma after resection in patients with cirrhosis to its occurrence in a surveilled cirrhotic population.Ann Surg Oncol，2009，16：413-422.

14 吳鳳霞.血清腫瘤標(biāo)志物AFP、CK19、PEG10和IQGAP1在肝癌中表達(dá)的研究.河南大學(xué)，2014.

The correlation analysis between expression of PEG10 and prognosis of primary hepatic carcinoma

ZHANG Hai，HU Ya-hua，ZHU Yan-li，CHANGCheng，LI Dan，YU Li-qun.Ceatral Hospital of Huangshi，Huangshi 435000，China

Objective To detect the expression of PEG10 in primary hepatic carcinoma（PHC）tissues，to explore its relationship between clinical pathological parameters and prognosis of PHC.Methods The expression of PEG10 was detected by immunohistochemical（SP method）in 58 carcinoma tissues of PHC patients in our hospital.The relationship between PEG10 and clinical pathological characteristics or prognosis of PHC was analyzed.Results Among 58 specimens，44 were tested positive for PEG10，including 16 of＂+＂，13 of＂++＂and 15 of＂+++＂.The average follow-up was 40.5 months，and 23 cases（39.7％）dead by the end of follow-up.The median survival time was 31 months for all cases.And 57 months，34months，27months，15months for PEG10＂-＂，＂+＂，＂+ +＂，＂+ + +＂groups，respectively.The survival rate in different groups had significant differences（P=0.000）.Levels of PEG10 in the female，advanced tumor，preoperative alpha fetal protein（AFP）＞200ng/mL，microvascular invasion and poorly differentiated tumors cases were higher（P＜0.05），while had no relation with age，tumor diameter or etiology（P＞0.05）.Among early recurrent cases，ratio of PEG10-positive was higher than that of PEG10-negative（P＜0.05），however，which showed no significant difference in late recurrent groups（P＞0.05）.The specificity，sensitivity and accuracy rate of PEG10 in prediction of PHC recurrence was 77.5％，38.9％ and 65.5％，respectively.AJCC stage，microvascular invasion，etiology and PEG10 expression were risk factors for PHC recurrence by multivariate COX analysis（P＜0.05），in which PEG10 positive HR was 6.724.Conclusion PEG10 can effectively predict the prognosis of PHC with a high specificity but low sensitivity，which should be conjunct with other indicators to make a comprehensive evaluation.

PEG10；Primary hepatic carcinoma；Recurrence

2015-03-24）

（本文編輯：賴榮陶）

2013-2014年度湖北省衛(wèi)生廳科研指導(dǎo)性項(xiàng)目（JX6C-48）

435000 湖北黃石 湖北理工學(xué)院附屬黃石中心醫(yī)院消化內(nèi)科（張海，胡亞華，朱艷莉，常城，余力群），科教科（李丹）通信作者：胡亞華，Email：33575296@qq.com