重組人銅鋅超氧化物歧化酶在大腸桿菌中的表達研究

王嵐，劉新，張帆，肖純凌

（1.遼寧省環境污染與微生態重點實驗室，遼寧沈陽 110034；2.沈陽醫學院基礎醫學院病原生物學教研室；3.沈陽醫學院基礎醫學院臨床醫學專業2011級2班）

重組人銅鋅超氧化物歧化酶在大腸桿菌中的表達研究

王嵐1，2，劉新1，2，張帆3，肖純凌1*

（1.遼寧省環境污染與微生態重點實驗室，遼寧沈陽 110034；2.沈陽醫學院基礎醫學院病原生物學教研室；3.沈陽醫學院基礎醫學院臨床醫學專業2011級2班）

目的：構建人銅鋅超氧化物歧化酶（hCu，Zn-SOD）原核表達載體并誘導其表達，純化及鑒定目的蛋白，為其臨床應用奠定基礎。方法：根據已報道的hCu，Zn-SOD基因序列，采用RT-PCR技術從外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）中獲得SOD cDNA序列。將所得的PCR產物插入原核表達載體pET22b（+）中，重組質粒經酶切、PCR及測序鑒定正確后，將其轉化至大腸桿菌Rosseta（DE3），通過異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl thiogalactoside，IPTG）誘導表達出目的蛋白，經鎳固定金屬親和層析純化。采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD生物學活性。結果：序列分析表明SOD基因成熟肽編碼區含有465 bp與GenBank（X02317）中已報道序列一致的SOD核苷酸。經IPTG誘導表達，十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分析顯示表達的目的蛋白分子量約為19 kD，免疫印跡分析顯示其與商品化的His-tag抗體呈特異性反應，但主要以包涵體形式表達，可溶性蛋白表達量很少。經Ni2+-NTA瓊脂糖純化獲得SDSPAGE電泳下單一條帶。可溶蛋白酶活力為460 U/ml（SOD的酶比活力為630 U/mg）。結論：在大腸桿菌中獲得了人源SOD的高效表達，為研究其生物學功能及廣泛應用奠定了基礎。

超氧化物歧化酶；大腸桿菌；表達

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是體內抗氧化物酶系的主要成員之一，廣泛存在于自然界的動物、植物以及一些微生物體內，由蛋白質和金屬離子組成。1938年Mann等［1］首次從牛紅細胞中得到一種含銅蛋白-血銅蛋白，1969年MeCord等［2］發現此蛋白能夠使超氧陰離子自由基O2-發生歧化反應，證實其具有清除生物體內氧自由基的特異性生物活性，因而將其定名為SOD并受到廣泛重視，已被美國FDA批準為安全的基因工程受體生物。因此，本研究擬將人源SOD基因克隆并表達于大腸桿菌中，以提高其表達量，不僅有著重要的理論意義，而且具有重要的實用價值。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑 大腸桿菌E.coli DH5a菌株由中國醫科大學提供，Rosseta（DE3）感受態菌株購自北京康為世紀科技有限公司；原核表達質粒pET22b（+）由沈陽化工學院研究所提供；限制性核酸內切酶EcoR I，Hind III及T4 DNA連接酶（美國Promega公司）；Trizol試劑（美國Invitrogen公司）；鎳離子親和層析柱（英國Amersham Pharmacia Biotech公司）；質粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒（日本Takara公司）；SOD活性測定試劑盒（黃嘌呤氧化酶法）購自南京建成生物工程研究所。

1.2 寡核苷酸引物設計與合成 根據GenBank（X02317）的hCu，Zn-SOD的cDNA序列，設計編碼該基因片段的5′和3′端寡核苷酸引物，引物序列P1：5′-CGGAATTC TTGGGCGATCCCAATTAC-3′（劃線部分為HindⅢ酶切位點）。委托大連寶生物工程公司合成。

1.3 RT-PCR擴增及測序 Trizol試劑從經IL-2刺激的人外周血單個核細胞中提取總RNA，RT-PCR得到hCu，Zn-SOD基因雙鏈DNA，PCR參數：98℃5 min；98℃30 s，59℃30 s，72℃15 s，循環次數30次；72℃5 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收PCR產物，將純化后PCR產物克隆至表達載體pET22b（+），構建的重組質粒pET22b-SOD轉化至感受態細菌E.coli DH5a，經過抗性篩選、酶切鑒定、PCR鑒定，初篩陽性克隆菌株。委托大連寶生物工程公司測序。

1.4 表達菌株的構建 提取測序正確的重組質粒pET22b-SOD，轉化至感受態細胞Rosseta（DE3），抗性篩選陽性克隆，提取質粒酶切鑒定。

1.5 pET22b-SOD的誘導表達 挑選4個重組菌單菌落分別接種于2 ml LB液體培養基37℃，160 r/min振搖過夜，次日以1∶100接種于5 ml LB液體培養基中37℃，230 r/min異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl thiogalactoside，IPTG）培養至吸光度600值為0.6，加入終濃度為0.1 mmol/L IPTG，0.1 mmol/L ZnSO4，0.1 mmol/L CuSO4，于37℃ GCCACCATGGCGACGAAGGCCGTG-3′（劃線部分為EcoRⅠ酶切位點）；P2：5′-CCAAGCTT誘導表達4 h，4℃12 000 r/min IPTG離心15 min收集菌體，溶于1 ml PBS中，用超聲儀300 W超聲1 h，13 000 r/min離心15 min，取上清，沉淀加入10倍體積8 mol/L尿素溶解，各取30 μl進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS-PAGE）分析。

1.6 可溶性SOD表達條件優化 對轉化重組質粒pET22b-SOD的DE3菌株進行小誘條件摸索，特別是不同誘導溫度（37℃、20℃）及不同誘導時間，用SDS-PAGE分析結果。

1.7 Western blotting分析 將上述37℃對照組和處理組裂解上清及沉淀，同時將20℃過夜誘導對照組和處理組樣品裂解上清及沉淀，各取20 μl進行Western blotting驗證。

1.8 目的蛋白純化和復性 按照上述最佳誘導條件培養50 ml工程菌后，超聲破碎收集上清液（400 W，破5 s，停5 s，反復30個循環），4℃12 000 r/min離心20 min后獲得蛋白的包涵體。將蛋白包涵體用變性裂解緩沖液重懸，鎳凝膠親和層析純化目的蛋白，洗脫的蛋白采用氧化型/還原型谷胱甘肽體系進行復性。

1.9 表達產物生物活性測定 收集復性、濃縮后的目的蛋白溶液，測定總體積并使用BCA蛋白測試試劑盒測定蛋白含量。利用SOD活性測定試劑盒（黃嘌呤氧化酶法）測定重組蛋白的生物學活性。

2 結果

2.1 hCu，Zn-SOD基因的克隆及測序結果 RTPCR擴增結果見圖1。1.5%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，在約465 bp處有與預期大小一致的DNA條帶，測序結果（DNA序列測序號ccs2370）與GenBank（X02317）報道一致，見圖2。

圖1 SOD的RT-PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳

圖2 重組質粒pET22b-SOD中SOD基因的測序結果比對

2.2 重組表達質粒鑒定 構建獲得的重組質粒同時進行PCR并經EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切后均產生預期大小的目的片段，見圖3、4。

圖3 pET22b-SOD菌落PCR結果

2.3 重組蛋白的表達 將重組表達質粒轉化至Rosseta（DE3）后，小誘條件摸索：結果表明SOD在無誘導情況下即可表達，且主要以包涵體形式（沉淀）存在，見圖5。

為驗證目的蛋白是否表達，并提高可溶性蛋白的表達量。將上述37℃對照組和處理組裂解上清及沉淀，同時將誘導溫度降至20℃，過夜誘導對照組和處理組樣品裂解上清及沉淀，各取20 μl進行Western blotting驗證，結果表明pET22b-SOD最佳表達條件為：0.1 mmol/L IPTG，0.1 mmol/L ZnSO4，0.1 Mmol/L CuSO4，20℃過夜誘導，可溶性蛋白表達量較37℃有所提高，見圖6。

圖5 pET22b-SOD 37℃誘導表達結果

圖6 Western blotting檢測不同溫度誘導下SOD的表達

2.4 鎳凝膠純化目的蛋白 經超聲破碎離心后獲得的包涵體用變性裂解緩沖液重懸，使包涵體變性可溶。包涵體溶解后的上清液，用鎳親和層析柱純化，將上清液過濾后，與親和層析介質充分結合，宿主菌Rosseta（DE3）多數雜蛋白因不與Ni2+結合用1×Binding Buffer沖洗時直接從柱中流出，再分別以含20 mmol/L、100 mmol/L和200 mmol/L咪唑的Eluting Buffer洗脫其余雜蛋白，重組蛋白由于具有His-tag，與Ni2+-螯合親合柱的結合力最強，在咪唑濃度達到500 mmol/L時被洗脫，見圖7。

圖7 SDS-PAGE分析親和層析純化SOD表達產物的結果

2.5 表達蛋白SOD含量及生物活性測定 將經親和層析純化后的重組蛋白液收集到透析袋中，浸入6 mol/L尿素復性液中，同時加入還原/氧化型谷胱甘肽（reduced/oxidized glutathione，GSH/ GSSG），經過逐步降低尿素濃度，最后用PBS透析得到含有生物活性的目的蛋白。BCA蛋白測試試劑盒測定純化蛋白含量為0.73 mg/ml，經SOD檢測試劑盒利用黃嘌呤氧化酶法（羥胺法）測定可溶性蛋白酶的活性，得出可溶蛋白酶活力達460 U/ml（SOD的酶比活為630 U/mg）。

3 討論

近幾十年，SOD一直是國內外學者研究的熱點，其研究大多集中于從動物血液或臟器中提取SOD，由于含有各種難以消除的病毒及外源污染，歐盟已于1999年頒布法令，禁止從動物血液中提取的SOD用于人類。而從植物中提取SOD的方法往往受到原材料的制約，且成本較高。微生物具有原料便宜易得，可大規模生產的優勢，因而，近些年很多學者都致力于用微生物發酵生產SOD的研究［3］。目前，國內外在微生物SOD的菌種選育、發酵工藝、分離提純、生理學研究、基因克隆表達及SOD應用方面都取得一定的研究進展［4-5］。

大腸桿菌基因克隆表達系統成熟完善，繁殖迅速、培養簡單、操作方便、遺傳穩定，本研究將人銅鋅SOD基因克隆并表達于大腸桿菌中，雖然獲得高效表達，但主要以包涵體形式表達，可溶性蛋白表達量很少。原因可能是大腸桿菌表達外源基因存在以下問題：（1）缺乏對真核生物蛋白的修飾加工系統；（2）內源性蛋白酶降解空間構象不正確的異源蛋白；（3）細胞周質內含有較多的內毒素。在商業應用中很多的蛋白產物是真核基因編碼，并且具有高級的三、四級結構，要求翻譯后加工為正確的折疊形式或者糖基化蛋白等。由于大腸桿菌細胞的分子環境和折疊機制等與真核細胞具有很大的差異，所以在應用大腸桿菌系統表達真核基因時有必要利用代謝工程或進化的方法改造細胞，解決大腸桿菌表達系統的局限性，提高產物的活性［6］。

由于受到（1）半衰期短；（2）相對分子質量大，不易透過細胞膜；（3）口服時易受胃蛋白酶分解；（4）體內特異性等因素的限制，SOD很難作為藥用酶廣泛應用于臨床中［7］。因此，希望在不久的將來能合成出具有精確活性中心結構、熱力學穩定的和動力學惰性的模擬物，從而使SOD作為一種高效、安全的功能因子在產業中擁有廣泛的實用前景。

［1］MannT，Keilin D.Haemocuprein and hepatocuprein，copper-protein compounds of blood and liver in mammals［J］.Proc R Soc B，1938，126（844）：303-315.

［2］MeCord JM，Irwin F.Superoxide dismutase：an enzymatic function for erythrocuprein（hemocuprein）［J］.J Biol Chem，1969，244：6049-6055.

［3］張欣.超氧化物歧化酶（SOD）及其研究進展［J］.內蒙古石油化工，2010，（16）：14-15.

［4］王素芳，蔣琳蘭，趙樹進.微生物超氧化物歧化酶的研究進展［J］.藥物生物技術，2002，9（6）：378-380.

［5］楊明琰，張曉琦.微生物產超氧化物歧化酶的研究進展［J］.微生物學雜志，2004，24（1）：49-51.

［6］戎晶晶，刁振宇，周國華.大腸桿菌表達系統的研究進展［J］.藥物生物技術，2005，12（6）：416-420.

［7］馬曉麗.超氧化物歧化酶的研究進展［J］.山西職工醫學院學報，2010，20（1）：83-86.

Expression of Recombinant Human Superoxide Dismutase in Escherichia coli

WANG Lan1，2，LIU Xin1，2，ZHANG Fan3，XIAO Chunling1*
（1.Key laboratory of Environmental Pollution and Microecology，Shenyang 110034，China；2.Department of Pathogenic Biology，Shenyang Medical College；3.Grade 2011 Class 2，Shenyang Medical College）

Objective：To construct human copper zinc superoxide dismutase（hCu，Zn-SOD）prokaryotic expression vector and to purify and identify in order to lay the foundation of clinical application.Methods：RT-PCR technology was used to amplify SOD cDNA according to the reported sequence of hCu，Zn-SOD gene derived from peripheral blood mononuclear cells（PBMC）.The resulting PCR product was inserted into the prokaryotic expression vector pET22b（+）.The recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli Rosseta（DE3）after verifing by enzyme digestion，PCR and sequencing identification.The target protein was expressed by IPTG induction and purified by nickel affinity immobilized metal chromatography.The biological activity of SOD was determined by xanthine oxidase method.Results：Sequence analysis showed that 465 bp nucleotide in mature peptide encoding region was consistent with SOD sequence reported in GenBank（X02317）.After induced by IPTG and SDS-PAGE electrophoresis analysis，the recombinant protein was expressed and molecular weight was about 19 kD.But soluble protein expression was rarely and mainly in the form of inclusion body expression.The recombinant protein was purified by Ni2+-NTA agarose.Biological activity of soluble protease was 460 U/ml（SOD specific activity was 630 U/mg）.Conclusion：High expression of human SOD is obtained from Escherichia coli，which laid the foundation for the study on its biological functions and wide application.

superoxide dismutase（SOD）；Escherichia coli；expression

Q786

A

1008-2344（2015）02-0070-04 doi：10.3969/j.issn.1008-2344.2015.02.002

2015-02-07

沈陽醫學院科技開發轉化基金項目（No.20146069）

王嵐（1976—），女（漢），副教授，醫學博士.研究方向：院內感染細菌耐藥機制研究.E-mail：wanglan1123@ aliyun.com

肖純凌（1964—），女（漢），教授，博士.研究方向：大氣污染與微生態.E-mail：xiaochunling@symc.edu.cn