發酵型海帶酒的研制及其抗氧化性的研究

陳美齡 金芳園 鄧尚貴

摘要[目的]研制發酵型海帶酒，提高海帶的綜合利用率。[方法] 以海帶提取液為研究對象，用3種發酵劑及其兩兩混合對海帶提取液進行發酵制酒，采用定量描述分析（QDA）對海帶酒進行感官評定，篩選出最優發酵劑，然后通過正交試驗對海帶提取液工藝進行優化，最后測定發酵酒的抗氧化性。[結果]試驗表明，海帶本身攜帶的自然菌群對發酵酒的品質沒有顯著的影響；最佳發酵劑為混合菌（安琪提供的釀酒曲和葡萄酒果酒專用酵母SY）。海帶提取液的最佳工藝參數為提取溫度90 ℃、浸泡時間3 h、料液比1∶20 g/ml。6種不同的菌種后發酵25 d的發酵酒的抗氧化性都較高。[結論] 研究可提高海帶的附加值，為海帶資源的開發利用開辟新的途徑。

關鍵詞海帶；發酵酒；酵母菌；抗氧化性

中圖分類號S986.1文獻標識碼A文章編號0517-6611（2015）34-078-03

海帶作為一種天然傳統食品，營養價值很高。海帶中的碳水化合物含量高于普通蔬菜好幾倍，其中的海帶多糖含量較高，目前己發現褐藻糖膠、褐藻淀粉及巖藻聚糖硫酸酯3種多糖。海帶中纖維、蛋白含量也很高，且必需氨基酸的模式符合聯合國糧食及農業組織（FAO）標準模式。海帶同時也含有豐富的礦物質和維生素，且脂肪酸為不飽和脂肪酸居多。

海帶不僅有著豐富的營養物質，而且藥用價值也較高。近年來，海藻中的次生代謝物質，如萜類、甾醇類、大環內酯類和酚類等已成為研究的熱點，特別是多酚類物質因其所具有的抗氧化特性而備受矚目[1-3]。最近幾年，科學家們研究發現，對于癌癥的治療和預防，海帶也有著重要的作用[4]。

但我國對海帶資源的開發利用還非常有限。海帶酒是海帶的一種深加工產品，可提高海帶的附加值，為海帶資源的利用開辟新途徑。海帶發酵酒的研究已有少數中文報道，外文還未見報道。劉秀河等報道了海帶汁的提取、酶解、酸解條件及發酵的最佳工藝研究[5]；王克明報道了多元混菌固定化發酵海藻保健酒的制備工藝優化的研究[6]；田寶蘭報道了海帶酒制作工藝、海帶酒在發酵過程中功能性成分含量的變化及海帶酒的澄清及穩定性的研究[7]。

筆者以海帶提取液為研究對象，用3種發酵劑及其兩兩混合對海帶提取液進行發酵制酒，并對不同菌種發酵的海帶酒進行抗氧化性的初步研究。

1材料與方法

1.1材料

海帶干貨和蔗糖，浙江舟山華之友超市提供，陰涼干燥處保存；

由安琪酵母股份有限公司提供的發酵菌，

①釀酒曲配料為：酵母、根霉α淀粉酶、葡糖淀粉酶、植物酶；

②甜酒曲配料為：根霉菌、米粉；

③葡萄酒果酒專用酵母SY 配料為：酵母、乳化劑；

其他化學試劑均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

主要儀器：

HH4型電熱恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司；

BS110S電子天平，北京賽多利斯儀器系統有限公司；

UV2800紫外可見分光光度計，尤尼柯（上海）儀器有限公司；

LD2X40BI型立式電熱壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；

HWS270恒溫恒濕培養箱，寧波東北儀器有限公司；

UPKII60L超純水機，成都優普超純科技有限公司。

1.2方法

1.2.1海帶酒的發酵制備。

發酵菌株是發酵酒釀造的重要因素，對酒的感官特性有很大的影響。因此，選擇優良的發酵劑是海帶酒發酵的重要環節。海帶本身攜帶的自然菌群也會參與發酵過程，為了考察海帶本身攜帶的自然菌群對海帶發酵酒的影響，該試驗分別以滅菌后的海帶提取液和不滅菌的海帶提取液為原料，接種6種發酵劑進行海帶酒的制備，并對其成品海帶酒進行感官評定，分析海帶本身攜帶的自然菌群對海帶酒的影響，并篩選出最優的發酵劑。

1.2.1.1海帶提取液的制備。干制海帶→剪碎→不徹底清洗（干制海帶表面的白色附著物的有效成分為甘露醇，徹底清洗后會使其流失）→加水浸泡（1∶25 g/ml）→搗碎機再次搗碎→加水至1 000 ml→90 ℃水浴鍋水浴4 h（期間要不斷攪拌）。

1.2.1.2發酵。將200 ml海帶提取液倒入250 ml的錐形瓶中，在高壓滅菌鍋中121 ℃，20 min滅菌，冷卻到室溫后分別接種6組發酵劑，每組3個平行，依次為果酒曲、甜酒曲、釀酒曲、甜酒曲和釀酒曲的混合菌種、果酒曲和釀酒曲的混合菌種、甜酒曲和果酒曲的混和菌種，然后依次加入5%的蔗糖提供外源碳源，放置于 37 ℃的生化培養箱中進行主發酵。主發酵5 d結束后放置于4 ℃冰箱進行后發酵。此次試驗后發酵15 d后對其進行感官評定（將3個平行組同時倒入一個容器中，混勻）。用不滅菌的海帶提取液為原料進行相同的操作。

1.2.2感官評定試驗方法。

1.2.2.1感官評定方法。

由經過感官品評訓練的12名品評員組成評定小組，對海帶發酵酒的感官特性指標逐項進行打分。全部品評員評價結束后，收集每個品評員的評價結果，進行數據分析，采用QDA圖表示[8]。

1.2.2.2評分標尺的建立。

數字標尺可以在感官檢驗中量化品評結果，包括運用在感官、態度、喜好性等感官評價中。該試驗采用9點的數字標度為評分標尺，由1、2、3、4、5、6、7、8、9這9個數字把感官特性的強度由弱到強劃分，以此建立海帶發酵酒的感官分析評分尺度表。

1.2.2.3描述詞匯表的建立。

感官品評員對各自的海帶酒樣品進行品評，然后記錄并討論出能反映海帶發酵酒產品的色澤、澄清度、酒味、海帶味、甜味、風格感官特性的6個詞匯作為定量描述分析法的描述詞匯，并給出詞匯的定義。其中第6個詞匯的品評結果很大程度上受到前5個詞匯結果的影響。

1.2.3海帶提取液參數優化正交試驗。

海帶提取液是影響海帶發酵酒品質的一個關鍵因素，故在這個試驗中主要是對海帶提取液的工藝參數的優化。

正交試驗：在選出最佳發酵劑的前提下，優化原料海帶提取液的提取工藝參數，以感官評定的結果為指標，確定最佳料液比、浸提時間及水浴溫度。其因素與水平見表1。

表1海帶提取液提取的因素與水平

水平因素浸提溫度（A）∥℃浸提時間（B）∥h料液比（C）∥g/ml

15011∶20

27031∶25

39051∶30

1.2.4海帶酒抗氧化性的測定。

1.2.4.1清除 DPPH 自由基的能力測定[9]。

稱取海帶提取液 1 ml及1×10-4 mol/L DPPH 溶液1 ml 加入同一試管中搖勻后，在室溫下密閉靜置30 min，對照組1為1 ml 95%的乙醇和1 ml的樣品，對照組2為1 ml的蒸餾水和1 ml的DPPH，其他步驟一樣。于 535 nm波長下測定吸光度。依次記為A1、A2、A3 。調零組為95%的乙醇，根據下列公式計算每種提取液對 DPPH 自由基的清除率。

清除率=[A3-（A1-A2 ）/A3]×100%

1.2.4.2清除羥自由基的能力測定[9]。

取濃度為 0.75 mmol/L 鄰二氮菲溶液 1 ml于試管中，依次加入 0.20 mol/L 磷酸緩沖液（pH 7.4）2 ml、蒸餾水1 ml，混合均勻，加入濃度為 0.75 mmol/L 的 硫酸亞鐵溶液1 ml，混勻，加入1 ml的0.12%的 H2O2，37 ℃水浴 90 min，于波長536 nm 處測其吸光度Ap；其余條件相同，用 1 ml 蒸餾水代替 1 ml H2O2 為Ab ；用樣品溶液代替1 ml 的蒸餾水為As。

樣品對羥自由基清除率=（As-Ap ）/（Ab-Ap ）×100%

1.2.4.3超氧陰離子自由基體系[10]。

取pH 8.2的TrisHCl緩沖液5 ml，分別加入0.25 ml 試樣和0.10 ml 鄰苯三酚溶液，混勻后于25 ℃水浴中反應15 min，后使用1 cm的比色皿，以蒸餾水做空白對照，在波長320 nm處時測吸光度Ai，并測定本底扣除水解自身的干擾，計算清除率。

清除率的計算公式：

超氧陰離子自由基清除率（% ）=A0[（Ai-Aj）/A0]×100%

式中，A0 為空白的平均吸光度，Ai為試樣的吸光度值，Aj為樣液本底的吸光度值。

2結果與分析

2.1海帶本身攜帶的自然菌群對發酵的影響及菌種的優選

以滅菌后的海帶提取液為原料，接種6種發酵劑制備海帶酒，對這6種海帶酒進行感官評定，其感官評定QDA圖如圖1、2所示。

注：圖中的釀+果=釀酒曲+果酒曲；釀+甜=釀酒曲+甜酒曲；果+甜=果酒曲+甜酒曲。

圖1不同菌種發酵的海帶酒（滅菌）感官特性QDA圖

注：圖中的釀+果=釀酒曲+果酒曲；釀+甜=釀酒曲+甜酒曲；果+甜=果酒曲+甜酒曲。

圖2不同菌種發酵的海帶酒（不滅菌）感官特性QDA圖

由圖1和圖2可以看出，海帶提取液滅菌與不滅菌最后發酵得到的海帶酒的澄清度是有明顯差距的，而其他感官指標都是比較相近的，總體的風味相差較小，可知海帶本身攜帶的菌種對試驗沒有明顯的影響，因此后續試驗均以不滅菌的海帶提取液為原料進行發酵試驗。試驗總體平均值都在4～7，說明各感官評定最后的評分結果都不是很大，處于適中。從圖1和圖2的第6個綜合因素風格的得分，可以較明顯地得出最優發酵菌為釀酒曲和果酒曲的混合菌種。圖1各組試驗在澄清度上顯著高于圖2得分，分析其原因可能是：在海帶提取的過程中有部分的膠類物質被提出，但是經過高溫高壓滅菌后其膠類物質被分解，使得提取液的稠度下降，密度減小，一些溶液中的固體顆粒沉淀致提取液變得澄清透明。

圖1和圖2在色澤因素上得分都處于5～6，呈乳黃色和微黃色，呈乳黃色的海帶酒主要是由果酒酵母發酵而成，因為果酒酵母中的配方有乳化劑，賦予酒香氣和濁度。酒味這個因素相差的比較大，原因是使用的3種發酵劑菌種不同，作用的機理不同：甜酒曲主要用于制作甜酒釀，故發酵的酒其甜度會較其他2種菌要甜的多。釀酒曲主要是生產白酒的菌種，其發酵的酒，酒精度數會相對較高。果酒曲是發酵果蔬類的菌種，其發酵的酒精度數不會很高，并且會帶有點甜味。

評定員要參考以上5個因素的評定并結合自身的偏好，在第6個因素風格上給樣品綜合打分評定。這個分數是較為重要的，因為該試驗的目的是制作出一類較符合大眾口味的海帶酒，由圖1和圖2可以得出最優發酵劑是釀酒曲和果酒曲的混合菌種，釀酒曲能夠釀造酒精度較高的酒，而果酒曲在風味和口味上作出貢獻，這2種菌的混合菌種發酵的海帶酒較符合大眾的口味。

2.2海帶提取液參數優化正交試驗

3因素3水平的海帶提取液正交試驗結果及分析見表2。最優發酵劑釀酒曲和果酒曲的混合菌種發酵制得的9種海帶酒感官評定QDA圖見圖3。

由表2中的R值可以看出，影響海帶酒品質的主要因素是海帶提取液浸提溫度和浸提時間，料液比的影響不顯著。正交試驗優化的參數組合為A3B3C1，即浸提溫度為90 ℃、浸提時間5 h、料液比為1∶20 g/ml。結合圖3，可以明顯看出提取液6、8、9發酵的海帶酒感官評定較好，其參數分別是：提取溫度90 ℃、浸提時間3 h、料液比1∶20 g/ml；提取溫度70 ℃、浸提時間5 h、料液比1∶30 g/ml；提取溫度90 ℃、浸提時間5 h、料液比1∶25 g/ml。綜合考慮，為了節約時間，最適提取液參數為溫度90 ℃、時間3 h、料液比1∶20 g/ml。 由圖3還可以看出，不同的提取條件對澄清度和甜味的影響不顯著，對于色澤和風格的影響最大，酒味和海帶味次之。

2.36種菌種發酵海帶酒的抗氧化性

以最適提取條件下（溫度90 ℃、時間3 h、料液比1∶20 g/ml）獲得的海帶提取液為原料，不滅菌直接添加6種發酵劑制備海帶酒，后發酵25 d進行抗氧化性的測定，結果見表3。從表3中的清除羥自由基、超氧陰離子自由基、DPPH 自由基的能力測定結果可知，這6種海帶酒的抗氧化性均比較高。根據文獻研究，海帶中還有多酚類物質，多酚具有抗氧化性，并且海帶多糖也有抗氧化性。結合文獻，分析該試驗的6種海帶酒抗氧化性高的原因，很可能是由于海帶酒中的多酚類物質及海帶多糖的作用。