赭曲霉毒素A無毒ELISA檢測

裘雪梅 朱立鑫 劉敏等

摘要[目的]研究赭曲霉毒素A毒素的替代ELISA檢測。[方法]采用噬菌體展示技術篩選赭曲霉毒素A模擬表位，得到赭曲霉毒素A（OTA）模擬表位序列為IR（V）PMV（L）XX （X為任意氨基酸），化學合成法體外合成OTA 模擬表位肽，通過化學交聯法將OTA模擬表位肽與BSA連接，做成無毒抗原，建立無毒OTA 間接競爭ELISA檢測方法，同樣通過化學交聯法將OTA多肽-BSA與HRP 相聯，建立OTA無毒直接競爭ELISA檢測方法。[結果]OTA多肽-BSA間接競爭ELISA檢測50%抑制濃度（IC50）為5 ng/ml，OTA多肽-BSA-HRP一步直接競爭ELISA檢測法IC50為2.5 ng/ml，二步直接競爭ELISA檢測法IC50為2 ng/ml。[結論]OTA模擬表位多肽能用于代替OTA毒素作為檢測抗原使用，并建立無毒ELISA檢測方法。

關鍵詞赭曲霉毒素A；模擬表位；ELISA檢測

中圖分類號S188文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2015）31-035-03

Research of Ochratoxin A Nontoxic ELISA

QIU Xuemei， ZHU Lixin， LIU Min et al

（School of Life Science， Jiangxi Science & Technology Normal University， Nanchang， Jiangxi 330013）

Abstract [Objective] To research the ELISA detection based on Ochratoxin A（OTA）mimic epitope. [Method] Screening the OTA mimic epitope from random phage display peptide library， and chemical synthesis was used to get the OTA mimic epitope， then synthesize OTA poly peptideBSA and OTA poly peptideBSAHRP， establish the methods of indirect and indirect competive ELISA. [Result] The IC50 of OTA poly peptideBSA indirect competive ELISA is 5 ng/ml， the IC50 of OTA poly peptideBSAHRP one step direct competive ELISA is 2.5 ng/ml， the IC50 of OTA poly peptideBSAHRP two step direct competive ELISA is 2 ng/ml. [Conclusion] OTA poly peptide based on OTA mimic epitope can be used to replace OTA toxin， and can establish nontoxin ELISA.

Key words Ochratoxin A； Mimic epitope； ELISA detection

赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）是曲霉屬和青霉屬的某些菌種產生的有毒次級代謝產物，易蓄積于組織中[1-2]，屬于烈性的腎臟和肝臟毒素[3-5]。OTA還具有強的致癌、致畸和致突變性[6-7]。產OTA毒素的菌株廣泛存在于自然界中，在各種農作物、食品、飼料、人類及動物的組織和血液中均能檢測到OTA的污染，對人類健康構成重大威脅[8-9]。

高效液相色譜法（HPLC）等理化分析檢測方法可以精確地進行定性和定量分析[10-12]，由于所需設備昂貴、操作復雜以及對樣品純度有較高的要求，導致檢測成本高、周期長，無法滿足大批量樣本快速篩查的需要。酶聯免疫吸附分析方法（ELISA）由于具有較高的靈敏度和特異性，對樣品的純度要求不高，且操作簡單，特別適合大批量樣本的檢測，因而被廣泛應用于OTA的快速檢測[13]。

由于常規的ELISA分析方法是建立在以標記OTA或偶聯OTA為競爭抗原基礎上的有毒檢測體系，為此，筆者在成功以噬菌體隨機肽庫展示技術篩選OTA的模擬表位的基礎上[14-15]，體外人工合成OTA模擬表位肽，以OTA模擬表位替代毒素標準品，建立無毒ELISA檢測方法。

1材料與方法

1.1試劑與儀器

OTA單克隆抗體、兔二抗為江西科技師范大學食品安全檢測實驗室制備；赭曲霉毒素A（OTA）、匙眼貝血藍蛋白（KLH）、牛血清白蛋白（bovine serum albumen BSA）、N[γ馬來酰亞胺丁酰氧]琥珀酰亞胺酯（GMBS）、氮羥基琥珀酸（Nhydroxysuccinimide NHS）、ε氨基己酸、福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑和羊抗小鼠酶標二抗、OTA標準品為Sigma產品，單克隆抗體分型試劑盒為圣克魯斯生物技術（上海）有限公司產品，兔抗鼠IgG：HRP酶標二抗為經科宏達生物技術有限公司產品，3，3′，5，5′四甲基聯苯胺（TMB）為上海生工產品，其余為國產分析純。UV205紫外分光光度計，日本島津；微量移液器，芬蘭Labsystems公司；K185紫外透射反射儀、酶標儀，芬蘭Labsystems公司。

1.2試驗方法

1.2.1OTA模擬表位多肽的化學合成。根據OTA模擬表位多肽的氨基酸序列，采用化學合成法合成OTA模擬表位多肽。

1.2.2OTA 單克隆抗體的制備。OTA 單克隆抗體的制備采用細胞融合法，具體步驟為：第4次免疫間隔28 d后，尾靜脈注射人工抗原0.05 mg/只，3 d后，取脾細胞在50% PEG融合劑作用下與對數期生長的SP2/O雜交瘤細胞融合。經HAT選擇培養液培養7 d后，換HT培養基培養，取雜交瘤細胞培養上清進行陽性克隆篩選，以OTA 人工抗原為檢測抗原，建立間接競爭ELISA方法，篩選分泌抗OTA單克隆抗體的雜交瘤細胞。陽性細胞經有限稀釋法亞克隆 3次均為100%陽性后，建立細胞系并凍存。并將雜交瘤細胞接種于提前接種降植烷的BALB/c 小鼠腹腔，制備腹水，經辛酸-硫酸銨沉淀法純化單抗。最后用單克隆抗體分型試劑盒進行分型鑒定。

1.2.3OTA多肽BSA的化學合成。

OTA多肽與BSA的連接采用多功能試劑GMBS進行。反應原理：將GMBS 與適量的BSA 在中性至堿性條件下使得GMBS的羰基與BSA分子側鏈中的氨基發生反應，然后去除未反應的GMBS。

1.2.4OTA多肽BSA。利用“1.2.3”方法中合成的OTA多肽BSA，與HRP相聯。

1.2.5OTA多肽BSA間接競爭ELISA檢測方法的建立。

棋盤滴定確定最佳的包被抗原和抗體工作濃度：OTA多肽BSA為檢測抗原，用PBS稀釋至不同稀釋度（1、2、4 μg/ml），4 ℃ 包被過夜，5%脫脂牛奶封閉后用PBST洗滌4次，加入PBS稀釋的抗體（1∶1 600，1∶3 200，1∶6 400，1∶12 800，1∶25 600，1∶51 200，1∶102 400），取陰性血清作陰性對照，PBS作空白對照。每孔100 μl，37 ℃ 1 h后洗滌4次，加入兔抗鼠IgG：HRP酶標二抗（100 μl/孔）；37 ℃作用1 h后，洗滌4次。3，3′，5，5′四甲基聯苯胺（TMB）顯色，2 mol/L H2SO4終止反應，測定450 nm波長吸光值（A值），根據A值選擇最佳包被抗原的濃度，然后選擇A值等于1.0～1.5抗體的稀釋倍數作為工作濃度。

根據確定的最佳包被抗原和抗體工作濃度建立基于OTA模擬表位的無毒間接競爭ELISA的標準曲線：檢測抗原（OTA多肽BSA）4 ℃ 包被過夜，35%脫脂牛奶封閉。加入50 μl溶于35%甲醇PBS的OTA（0，0.1，10，50，100，200，500，1000 ng/ml）和抗體50 μl，混勻。37 ℃ 1 h后，PBST洗滌4次，加入酶標二抗（100 μl/孔）；37 ℃作用1 h后，洗滌4次。TMB顯色，2 mol/L H2SO4終止反應，測A值，每個濃度測定4次，取平均值。計算各濃度的結合率，制作標準曲線。

1.2.6OTA多肽BSAHRP一步直接競爭ELISA檢測法。

棋盤滴定確定最佳的包被抗原和抗體工作濃度：包被兔二抗20 μg/ml，4 ℃ 包被過夜，5%脫脂牛奶封閉后用PBST洗滌4次，加入PBS稀釋的OTA多肽BSAHRP （1∶500，1∶1 000，1∶2 000，1∶4 000，1∶8 000，1∶16 000，1∶32 000）50ul，PBS稀釋的OTA單克隆抗體（1∶1 000，1∶ 2 000，1∶4 000，1∶8 000，1∶16 000，1∶32 000，1∶64 000）50 μl，取陰性血清作陰性對照，PBS作空白對照，37 ℃ 0.5 h后洗滌4次，加入TMB顯色10 min，2 mol/L H2SO4 50 μl終止反應，測定450 nm波長吸光值（A值），根據A值選擇最佳包被抗原的濃度，然后選擇A值等于1.0左右的抗體的稀釋倍數作為工作濃度。

根據確定的最佳包被抗原和抗體工作濃度建立基于OTA模擬表位的一步法無毒直接競爭ELISA的標準曲線：包被兔二抗20 μg/ml，4 ℃ 包被過夜，5%脫脂牛奶封閉后用PBST洗滌4次，同時加入30 μl OTA 標準品（0，0.25，050，100，200，500，1000 ng/ml），30 μl OTA多肽BSAHRP，以及40 μl OTA 單克隆抗體，37 ℃ 0.5 h后洗滌4次，加入TMB顯色10 min，2 mol/L H2SO4 50 μl終止反應，測定450 nm波長吸光值（A值），制作標準曲線。

1.2.7OTA多肽BSAHRP 二步直接競爭ELISA檢測法。棋盤滴定確定最佳的包被抗原和抗體工作濃度，步驟參照“1.2.6”的方法。根據確定的最佳包被抗原和抗體工作濃度建立基于OTA模擬表位的二步法無毒直接競爭ELISA的標準曲線：包被兔二抗20 μg/ml，4 ℃ 包被過夜，5%脫脂牛奶封閉后用PBST洗滌4次，加入100 μl OTA 單克隆抗體，37 ℃ 0.5 h，PBST洗滌4次，加入50 μl OTA 標準品（0， 0.5，10，20，50，100，200 ng/ml），50 μl OTA多肽BSAHRP， 37 ℃ 0.5 h后PBST洗滌4次，加入TMB顯色10 min，2 mol/L H2SO4 50 μl終止反應，測定450 nm波長吸光值（A值），制作標準曲線。

2結果與分析

2.1單克隆抗體的制備

經細胞融合，篩選到一株分泌抗OTA單克隆抗體的雜交瘤細胞株（8G4），經 3次亞克隆后，全部克隆為陽克隆。將上述細胞株連續培養及凍存后復蘇，其分泌的抗體效價穩定不變。

2.2 OTA多肽BSA間接競爭ELISA檢測標準曲線

經棋盤滴定確定的最佳ELISA分析條件：包被抗原（OTA多肽BSA）濃度為2 μg/ml，抗體工作濃度為1∶102 400，酶標二抗工作濃度為1∶3 000，滴定結果見表1。OTA多肽BSA間接競爭ELISA檢測標準曲線見圖1，50%抑制濃度（IC50）為5 ng/ml。

2.3OTA多肽BSAHRP一步直接競爭ELISA檢測標準曲線

經棋盤滴定確定的最佳ELISA分析條件：OTA抗體工作濃度為1∶16 000，OTA多肽BSAHRP工作濃度為1∶8 000，酶標二抗工作濃度為1∶3 000，結果見表2。OTA多肽BSAHRP一步直接競爭ELISA檢測標準曲線見圖2，50%抑制濃度（IC50）為2.5 ng/ml。

2.4OTA多肽BSAHRP二步直接競爭ELISA檢測標準曲線

經棋盤滴定確定的最佳ELISA分析條件：OTA抗體工作濃度為1∶16 000，OTA多肽BSAHRP工作濃度為1∶8 000，酶標二抗工作濃度為1∶3 000。OTA多肽BSAHRP二步直接競爭ELISA檢測標準曲線見圖3，50%抑制濃度（IC50）為2 ng/ml。

3討論

通過研究OTA模擬表位多肽替代OTA毒素進行ELISA檢測，獲得體外合成OTA模擬表位多肽的ELISA檢測的理論數據，與通過載體構建并表達OTA模擬表位多肽建立的OTA無毒ELISA檢測法進行對比研究（通過分子生物學方法，應用PC89噬菌粒載體，將赭曲霉毒素A的模擬表位導入至M13噬菌體的主要衣殼蛋白pⅧ上，并引入了腸激酶切割位點，通過單克隆抗體結合及DNA測序驗證，獲得了在N末端高密度表達模擬表位的重組噬菌體；再以其為競爭抗原，建立了新的競爭酶聯免疫吸附檢測ELISA方法）[16-17]，用以

研究基于OTA模擬表位的無毒ELISA檢測方法的最佳方案，為安全、有效、快速檢測食品及飼料中的OTA污染提供可靠依據，也為諸如黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素M1等真菌毒素的檢測提供新的技術手段。

在進一步試驗中，還將對每種方法進行評價，重點對OTA多肽BSAHRP一步法及二步法直接競爭ELISA

檢測方法進行比對，就該試驗而言，一步法時間短，IC50稍高，而兩步法時間比一步法多0.5 h，但IC50比一步法低，同時這2種方法都具有靈敏、快速檢測的特點。

43卷31期裘雪梅等赭曲霉毒素A無毒ELISA檢測

參考文獻

[1]

DOHNAL V，DVORAK V，MALIR，F et al.A comparison of ELISA and HPLC methods for determination of ochratoxin A in human blood serum in the Czech Republic[J].Food Chem Toxicol，2013，62：427-431.

[2] MEULENBERG E P.Immunochemical methods for ochratoxin A detection：A review[J].Toxins （Basel），2012，4（4）：244-266.

[3] SOLFRIZZO M，GAMBACORTA L，LATTANZIO V M，et al.Simultaneous LC-MS/MS determination of aflatoxin M1，ochratoxin A，deoxynivalenol，de-epoxydeoxynivalenol，alpha and beta-zearalenols and fumonisin B1 in urine as a multi-biomarker method to assess exposure to mycotoxins[J].Anal Bioanal Chem，2011，401（9）：2831-2841.

[4] WU J，TAN Y，WANG Y，et al.Occurrence of ochratoxin A in grain and manufactured food products in China detected by HPLC with fluorescence detection and confirmed by LC-ESI-MS/MS[J].Mycopathologia，2012，173（2/3）：199-205.

[5] KAWAMURA O，SATO S，KAJLL H，et al. A sensitive enzyme-linked immunoassay of ochratoxin A based on monoclonal antibodies[J].Toxicon，1989 27：887-897.

[6] BALL W J，WANG Z，MALIK B，et al.Selection of peptidic mimics of digoxin from phage-displayed peptide libraries by anti-digoxin antibodies[J].J Mol Biol，2000，301：101-115.

[7] THIRUMALA K，MILLER J S，REDDY G，et al.Phage-displayed peptides that mimic aflatoxin B1 in serological reactivity[J].Journal of applied microbiology，2001，90：330-336.

[8] JAE H P，WON C P，YOO J K，et al.Development of an enzymelinked immunosorbent assayfor the organophosphorus insecticide cyanophos[J].Bull Korean Chem Soc，2002，23：605-610.

[9] HELMS B A，REULEN S W，NIJHUIS S，et al.High-affinity peptide-based collagen targeting using synthetic phage mimics：From phage display to dendrimer display[J].J Am Chem Soc，2009，26；131（33）：683-685.

[10] YIP Y L，SMITH G，WARD R L.Comparison of phage pIII，pVIII and GST as carrier proteins for peptide immunisation in Balb/c mice[J].Immunol Let，2001，79（3）：197-202.

[11] WEICHEL M，JAUSSI R，RHYNER C，et al.Display of E.coli alkaline phosphatase pIII or pVIII fusions on phagemid surfaces reveals monovalent decoration with active molecules[J].Open Biochem，2008；2：38-43.

[12] LIU R R，XU L，QIU X M，et al.An immunoassay for aflatoxin B1 using a recombinant phage as a non-toxic conjugate[J].Journal of food safety，2012，32（3）：318-325.

[13] LIU R R，YU Z，HE Q H，et al.An immunoassay for ochratoxin A without the mycotoxin[J].Food Control，2007，18（7）：872-877.

[14] HE Q H，XU Y H，HUANG Y H，et al.Phage-displayed peptides that mimic zearalenone and its application in immunoassay[J].Food chemistry，2011，126（3）：1312-1315.

[15] LAI W H，FUNG D Y C，XU Y et al.Development of a colloidal gold strip for rapid detection of ochratoxin A with mimotope peptide[J].Food control，2009，20（9）：791-795.

[16] 陳興龍，徐玲，劉仁榮，等.絲狀噬菌體pⅧ展示系統表達赭曲霉毒素A模擬表位應用研究[J].衛生研究，2012，44（5）：814-818.

[17] 劉仁榮，徐玲，裘雪梅，等.基于赭曲霉毒素A模擬表位的無毒素ELISA方法[J].食品與機械，2010（6）：47-50.