3種鱧屬魚類ITS序列及系統進化分析

朱樹人 孟慶磊 朱永安等

摘要[目的]闡明烏鱧、斑鱧、月鱧核基因序列（ITS）的遺傳變異情況，并用ITS序列研究鱧屬系統進化關系。[方法]利用PCR擴增3種鱧的ITS，經克隆、拼接得到ITS全長后進行分析。[結果]烏鱧、斑鱧和月鱧ITS全序列長度為902、 927、902或903 bp。3種鱧ITS的G+C含量較高，約占72%。3種鱧之間核苷酸差異明顯大于種內，明顯的差異性ITS片段可以鑒別3種鱧。采用NJ和ML方法建立的進化樹都表明烏鱧和斑鱧的遺傳距離最近，而烏鱧和月鱧遺傳距離最遠。[結論]該研究為鱧屬的分類鑒定、系統進化關系以及種間雜交提供基礎資料。

關鍵詞烏鱧；斑鱧；月鱧；ITS序列；親緣關系

中圖分類號S961.6文獻標識碼A文章編號0517-6611（2015）31-047-03

Analysis on ITS Sequences and Phylogenetic Relationship of Three Kinds of Channa

ZHU Shuren1，2，3， MENG Qinglei1， ZHU Yongan1 et al

（1.Shandong Provincial Key Laboratory Freshwater Genetics and Breeding， Shandong Freshwater Fisheries Research Institute， Jinan，Shandong 250017； 2.Key Laboratory of Freshwater Aquatic Genetic Resources Gertificated by Ministry of Agriculture， Shanghai Ocean University， Shanghai 201306； 3.Department of Biology， East China Normal University， Shanghai 200241）

Abstract [Objective] The aim was to examine sequence variation in the internal transcribed spacer （ITS） isolates from Channa argus， C. maculata and C. asiatica， and to reconstruct their phylogenetic relationship using ITS sequences. [Method]The ITS sequences were amplified from each sample and the amplicons were cloned and spliced the full length of ITS sequences.[Result] The full length of ITS sequences of C. argus， C. maculata and C. asiatica were 902， 927， 902 or 903 bp. The content of G+C （about 72%） was higher than A+T. For three species of snakehead， interspecific differences were significantly greater than the intraspecific differences. The obvious difference of ITS fragments could identify three species of snakehead. Based on NJ and ML method， phylogenetic analysis showed that C. argus and C. maculata had the lowest genetic distance， while C. argus and C. asiatica had the highest genetic distance. [Conclusion]The results of this study could be useful for classification， phylogenetic relationship and interspecific hybrids of Channa.

Key words Channa argus； C. maculata ； C. asiatica； ITS sequences； Phylogenetic relationship

真核生物的核糖體都有3種rRNA，即18S rRNA、5.8S rRNA 和28S rRNA。這3種rRNA 基因都是以串聯重復形式存在，編碼這些rRNA的基因都按一定順序排列在DNA上。ITS包括ITS1和ITS2，分別位于18S rRNA與5.8S rRNA，5.8S rRNA 和28S rRNA之間。由于ITS1和ITS2進化速度較快，兩者廣泛應用于魚類物種的鑒定，特別用于分類較相似的魚類之間[1-4]?？梢愿鶕蘒TS兩邊rRNA 具有很高的保守性，設計引物擴增ITS序列片段。

筆者對我國較為常見的烏鱧、斑鱧、月鱧種間的分子遺傳距離和進化關系進行研究，旨在促進對其種內遺傳多樣性的認識，為分析鱧屬種間雜交提供借鑒。

1材料與方法

1.1材料

3種鱧屬魚類樣本于2013年5～10月份采集。烏鱧樣本采集于山東微山湖，斑鱧和月鱧都采自廣東。每種鱧采集5尾，樣本均采自水上作業的漁民或附近的水產品市場，剪取少量胸鰭，保存于無水乙醇中，貼好標簽放置于4 ℃冰箱備用。

1.2DNA提取

將胸鰭組織從乙醇中取出，充分漂洗晾干并剪碎，采用標準的酚-氯仿法提取基因組DNA。取2 μl DNA用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并稀釋到合適濃度用于PCR擴增。

1.3PCR擴增及測序

PCR擴增引物參照通用引物，均由上海生工生物工程有限公司合成，上游引物NSF1787F（5′CCGTA GGTGA ACCTG CGG3′）和下游引物FishLSU5Rev（5′TTAAA TTCAG CGGGT TGTCT3′）[5]。

PCR反應體系為20 μl，包含10×PCR buffer 2 μl，10 mmol/L dNTP 0.5 μl，25 mmol/L Mg2+ 2.4 μl，10 umol/L 引物NSF1787F 、FishLSU5′Rev各 1 μl，Taq（5 U/μl） 0.1 μl，DNA模板 2 μl，其他用 ddH2O 補充。PCR擴增程序采用降落PCR，94 ℃預變性3 min，然后是35個循環，每個循環包括94 ℃變性40 s，退火40 s（初始溫度為64 ℃，每次循環降0.5 ℃，降至61 ℃），72 ℃延伸1.5 min，最后72 ℃再延伸10 min。

PCR產物經電泳檢測純化、回收、克隆后由上海邁浦生物科技有限公司進行測序。

1.4數據分析

利用Clustal X（1.83）[6]對序列進行對位排列，并結合人工校正。通過MEGA5.0軟件[7-8]分析序列的堿基組成、變異位點，同時采用Kimura雙參數法計算種間的遺傳距離。在遺傳距離分析的基礎上，以鱸形目魚類圓花鰹（Auxis rochei，Genbank AB193743）為外群，采用Kimura 2parameter模型，Bootstrap估算重復次數1 000次，采用NJ法（Neighborjoining）和ML法（Maximum Likehood）構建系統進化樹。

2結果與分析

2.1陽性克隆鑒定結果

ITS基因序列陽性克隆提取質粒后進行PCR鑒定（圖1），得到約1 200 bp的條帶，與基因組PCR結果完全一致，表明克隆已經成功。

2.2序列測定結果

采用雙向測序，經過拼接后得到了完整的核糖體ITS序列（包括部分18S rRNA、ITS1、5.8S rRNA、ITS2和部分28 S rRNA序列）。經過NCBI上的Blast程序在GenBank基因數據庫中進行同源比對，發現測得的ITS序列與許多魚類的核糖體保守區域具有很高的同源性，其中與鱸形目魚類的同源性最高，證明測得序列的正確性（圖2）。烏鱧和斑鱧測得的ITS序列片段大小在1 200～1 300。把克隆測得ITS序列向Genbank進行了提交。樣品ITS序列登錄號如下：WL1，KJ451597；WL2，KJ451598；WL3，KJ451599；WL4，KJ451600；WL5，KJ451601；BL1，KJ451602；BL2，KJ451603；BL3，KJ451604；BL4，KJ451605；BL5KJ451606；YL1，KJ451607；YL2，KJ451608；YL3，KJ451609；YL4，KJ451610；YL5，KJ451611。

2.4系統發育關系分析

根據烏鱧、斑鱧和月鱧ITS全序列，利用MEGA 5.05軟件計算它們之間的遺傳距離，采用Kimura2雙參數模型（假設堿基轉換為顛倒數的2倍）計算它們的遺傳距離（表2）。烏鱧、斑鱧、月鱧物種內遺傳距離最大為0.003、0.007、0.004，物種間遺傳距離最大發生在烏鱧和月鱧之間（0.111）。

基于ITS基因序列分別用鄰位相連法（NJ）和最大似然法（ML）構建分子進化樹。NJ和ML建立的進化樹都顯示（圖3和4），烏鱧、斑鱧、月鱧都各自聚為一支，物種間烏鱧和斑鱧先聚在一起，其次與月鱧聚在一起，最后與圓花鰹聚在一起。進化樹顯示烏鱧和斑鱧親緣關系最近，同時兩者與同屬的月鱧親緣關系也較近，而與鱸形目的其他屬魚類親緣關系較遠，這與林奈氏命名法分類結果相一致。

3討論

ITS區域并不參與核糖體的形成，受到的選擇壓力較小，進化速率較快，并且兩側的18S rRNA、28S rRNA 和中間5.8S rRNA具有高度保守性，有利于設計引物擴增，所以廣泛應用于種的分類鑒定、種及亞種的鑒別、分子系統進化[9-11]。不同物種間18S、5.8S和28S rRNA 基因序列同源性較高，而ITS種間的同源性很低。種間ITS基因進化速度不均勻，以此序列間的遺傳距離變化較大，所以ITS并不適合在高階元物種間進行分子系統發育研究，適合在屬以下分類中進行比較研究。

該研究中，用ITS分析烏鱧和斑鱧物種內具有較大的相似度，同屬鱧科魚類的兩者在ITS有明顯的差異性片段（特別是在ITS2中斑鱧明顯多出30 bp大小的片段，即TACCC CCACA CTCTG GGGCC CGGGG CGGGT）。因此ITS不適合用于研究物種內個體之間的差異性，這段明顯的差異性片段可以用于準確判定形態學上較難辨別的烏鱧和斑鱧[12]，而兩者與月鱧無論在形態上還是ITS序列上差異較大（如月鱧在800 bp左右多出CTTCG CCGGG GCTA），很容易用于ITS序列鑒別。在果蠅ITS研究中表明高GC含量是一個比較原始的特征[13]，這種特征也存在于魚類[14]。該研究中，3種鱧G+C含量占72%左右，明顯高于A+T，表明鱧屬魚類比較原始，其起源和分化可能較早，故鱧屬魚類種間明顯的序列長度多態性是在漫長的進化中積累形成的，同樣序列變異較小的種類可能分化較晚，進化時間相對較短。

該研究采用NJ和ML方法建立了分子進化樹，2種方法都表明烏鱧和斑鱧的遺傳距離較近（約0.020），親緣關系最近，而與同屬的月鱧遺傳距離相對較遠，這為種間雜交提供了基礎資料。鱧科魚類與同目的圓花鰹遺傳距離較大，這與ITS序列不大適合在高階元物種間分子系統發育研究相符合。

綜上所述，鱧屬ITS序列較快的核苷酸進化速率，適合用于該屬內種間物種鑒別和系統進化學研究。目前，發現的鱧屬魚類并不完整，GenBank數據庫中對鱧屬魚類ITS序列數據還較少，今后有必要對更多的鱧屬魚類進行測定，結合形態學特征及其他分子標記，這將有助于科研工作者對鱧屬新物種的發現和分類進化系統有更進一步的認識。

43卷31期朱樹人等3種鱧屬魚類ITS序列及系統進化分析

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