復合乳酸菌在蘋果酒中的生長和蘋果酸—乳酸發酵特性的研究

李鳳 黃業傳 吳照民

摘要[目的]探索川秀乳酸菌1L型（混合型）在蘋果酒中的蘋果酸-乳酸發酵特性。[方法]以川秀乳酸菌1L型（嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌）作為蘋果酒二次發酵的發酵菌種，通過單因素試驗分析了接種量、SO2濃度、酒精度、pH和發酵溫度對乳酸菌生長和總滴定酸的影響。[結果]試驗表明，當接種量達到5×106 CFU/ml時接種量對乳酸菌的生長影響不明顯。當SO2濃度達到50 mg/L或者酒精度達到8.0%（V/V）時，或者pH降至3.2或者溫度低至20 ℃時，乳酸菌生長受到明顯抑制，降酸不完全。活菌數與總滴定酸的降低速率呈正相關。[結論]研究可為蘋果酒的蘋果酸-乳酸發酵工藝條件的研究提供參考，但各因素間的協同和互作的結果尚待研究。

關鍵詞復合乳酸菌；蘋果酒；蘋果酸乳酸發酵

中圖分類號S609.9；TS20文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2015）31-188-03

The Study of Growth and Malolactic Fermentation Characteristics of Lactobacillus Complex in Cider

LI Feng1，2， HUANG Yechuan1，2， WU Zhaomin1，2

（1.College of Life Science and Technology， SouthWest University of Science and Technology， Mianyang， Sichuan 621010； 2.Institute of Food Science and Technology Research， SouthWest University of Science and Technology， Mianyang， Sichuan 621010）

Abstract [Objective]The growth and malolactic fermentation characteristics of lactobacillus complex in cider were explored. [Method] Through single factor test， the influence of inoculation amount， SO2 concentration， pH value， fermentation temperature and alcoholic strength on the growth of lactobacillus and deacidification was studied. [Result] The results indicated that the effect was unobvious when the inoculation amount was above 5×106 CFU/ml and the growth and deacidification were inhibited when SO2 concentration reached 50 mg/L or the alcoholic strength reached 8.0%（V/V） or the pH value was lower than 3.2 or the temperature was lower than 20 ℃. Deacidification was positively related to viable count. [Conclusion] The results can provide reference to further research but the interaction effect of the factors need further research.

Key words Lactobacillus complex； Cider； Malolactic fermentation

蘋果酸-乳酸發酵（Malolactic Fermentation，MLF）是L蘋果酸在乳酸菌的蘋果酸乳酸酶的作用下轉化為L乳酸并放出二氧化碳的過程[1]。MLF在包括蘋果酒和葡萄酒在內的果酒的釀造中有非常重要的作用。首先，MLF是目前最主要的果酒生物降酸方法，雖然物理或者化學的方法也能降低果酒的酸度，但只能作用于酒石酸而對蘋果酸沒有什么效果[2]；其次，MLF降低了酸度，削弱了收斂酸的作用，減小酒的粗糙和酸澀感，使酒的風味呈現多樣性口感飽和、圓潤；并且經MLF發酵，酒體中的營養成分被消耗同時部分細菌素等抑菌物質產生，提高了果酒抗雜菌的能力，增強了酒的穩定性。目前關于MLF的研究資料非常豐富，主要可以歸納為3個方面：發酵菌株的篩選，主要考慮菌株的生長能力、發酵能力、耐受酒精及二氧化硫的能力和絮凝能力，能啟動MLF的乳酸菌主要有明串珠菌屬、乳桿菌屬、酒類酒球菌屬和片球菌屬；MLF對果酒感官品質的影響研究，主要包括對風味和色澤的影響研究；MLF主要影響因素的研究以及在葡萄酒和果酒釀造中進行蘋果酸-乳酸發酵的工藝參數的優化和控制。乳酸菌在MLF進行的過程中除進行蘋果酸分解外還分解酒醪中的檸檬酸、殘糖等產生一些代謝副產物對成品酒的感官品質產生影響，不同的研究都發現不同的發酵菌種不論是在發酵能力、生長能力或者對成品酒的風味影響方面都有較大的差異，目前關于單一菌株在MLF中的相關研究報道較多[2-5]，關于復合菌株在MLF的相關研究報道較少[6]。筆者擬以川秀乳酸菌1L型（嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌）作為蘋果酒二次發酵的發酵菌種，研究其生長性及其蘋果酸-乳酸發酵特性。

1材料與方法

1.1材料

川秀乳酸菌1L型，北京川秀科技有限公司；葡萄酒活性干酵母，湖北宜昌安琪酵母股份有限公司；蘋果，市售紅富士。主要試劑：蔗糖、酒精均為食品級；亞硫酸等均為分析純，成都市欣海興化工試劑廠。主要儀器：精密pH計，上海虹益儀表有限公司；超純水儀（MiLLiQbiocel），美國密理博公司。適應性培養基為MRS培養基∶無菌蘋果前酵酒（1∶1）。

1.2方法

1.2.1蘋果汁的制備及前發酵。

選擇經貯存后熟超過1個月，果實中淀粉充分轉化成糖的蘋果，洗凈去核后切塊，盡量減少蘋果與空氣接觸，同時加入維生素C護色。按照蘋果∶水1∶1的比例加水打漿。在蘋果漿中加入果膠酶和纖維素酶，50 ℃恒溫水浴保持2 h后用2層醫用紗布過濾制得蘋果汁。測定蘋果汁的糖度、酸度，并用蘋果酸將蘋果汁滴定酸調整至5 g/L用于前發酵，按照初始糖度調整至180 g/L計算蔗糖添加量，并在發酵過程中分批加入。活性干酵母用2%蔗糖溶液按照1∶10比例在35～38 ℃條件下復水活化15～20 min，復水完成后溫度降至30 ℃左右時接入至蘋果汁中進行發酵。發酵完成后過濾得蘋果前酵酒。用亞硫酸調整其總二氧化硫（SO2）濃度分別為30、40、50和60 mg/L，以食用酒精調整其酒度分別為6.0%、7.0%、8.0%和9.0%（V/V），用1 mol/L HCl 或者4 mol/L NaOH溶液調整pH分別為3.2、3.4、3.6和3.8備用。

1.2.2川秀乳酸菌在蘋果酒中的生長及蘋果酸乳酸發酵特性。

將川秀乳酸菌在MRS 培養基中培養至對數末期，以 5%（V/V）接種量分別接種于適應性培養基中，30 ℃條件下靜置培養 24 h后離心并用無菌水調整細胞濃度為1.0×108CFU/ml，以 5%、7%、10%和12%（V/V）的接種量分別接種于“1.2.1”項下蘋果酒中，分別在16、20、24和30 ℃下進行蘋果酸-乳酸發酵。每隔24 h取樣檢測活菌數和總酸度。

1.2.3測定方法。

總活菌數的測定按照GB/T4789.35平板菌落計數法，總滴定酸的測定按照GB/T15038-2006中指示劑法（以蘋果酸計）。

2結果與分析

2.1接種量對乳酸菌在蘋果酒中生長和MLF的影響

在酒精度6.0%（V/V）、pH為3.6、總SO2濃度為30 mg/L的蘋果前酵酒中，分別以5%、7%、10%和12%（V/V）的接種量接種乳酸菌活菌液（1.0×108CFU/ml），在25 ℃下靜置密閉發酵，期間活菌數和總滴定酸的變化見圖1和圖2。結果表明，當接種量達到5%時菌種能保持平緩的方式生長，接種量的變化對乳酸菌的生長影響不明顯。在發酵的過程中乳酸菌的總量呈現下降的趨勢，與其文獻報道的一致[1，4]。接種量增加降酸的速度加快，但發酵至第6天，10%和12%接種量2組的總酸接近。有研究表明，接種量增加可能導致發酵酒中的乙酸含量增加影響酒的風味[1]。因此實際生產中接種量需要謹慎選擇。

2.2SO2濃度對乳酸菌在蘋果酒中生長和MLF的影響

在酒精度6.0%（V/V）、pH為3.6的蘋果前酵酒中，接種量為10%時不同總SO2濃度時在25 ℃下靜置密閉發酵，期間活菌數和總滴定酸的變化見圖3和圖4。總SO2濃度為30 mg/L時乳酸菌的生長平緩能完成降酸，但是當濃度達到50 mg/L時接種后乳酸菌活菌數直線下降，降酸不完全。不同研究者的結果有較大的差異與不同菌種耐受SO2能力的差異有關[1，5]。

2.3酒精度對乳酸菌在蘋果酒中生長和MLF的影響

在pH為3.6、總二氧化硫濃度為30 mg/L的蘋果前酵酒中，接種量為10%時不同酒精度時在25 ℃下靜置密閉發酵，期間活菌數和總滴定酸的變化見圖5和圖6。酒度為6.0%和70%（V/V）時乳酸菌生長平緩，能完成降酸，但是當酒度達到80 %（V/V）時接種后乳酸菌活菌數直線下降，降酸不完全。不同研究者的結果有較大的差異與不同菌種耐受酒精能力的差異有關[1，5]，另外可能與發酵的溫度有關，有研究表明，隨著發酵溫度的升高，菌株耐受酒精的能力降低[3]。

2.4pH對乳酸菌在蘋果酒中生長和MLF的影響

在酒精度6.0%（V/V）、總二氧化硫濃度為30 mg/L的蘋果前酵酒中，接種量為10%時，不同pH條件下在25 ℃下靜置密閉發酵，期間活菌數和總滴定酸的變化見圖7和圖8。活菌數隨pH的降低而迅速降低，當pH降至3.2時活菌數迅速降低，降酸無法完成。當pH升高至3.6時，活菌數下降趨于平緩，降酸能順利完成，與其他研究者的研究結果一致[1，3，5]

2.5發酵溫度對乳酸菌在蘋果酒中生長和MLF的影響

在酒精度6.0%（V/V）、總二氧化硫濃度為30 mg/L、pH為3.6的蘋果前酵酒中，接種量為10%時，不同溫度下靜置密閉發酵，期間活菌數和總滴定酸的變化見圖9、10。結果表明，低溫對乳酸菌的生長有明顯的抑制作用，低溫發酵時降酸的速率降低時間延長，當溫度低至20 ℃時乳酸菌生長受明顯抑制，降酸不完全。

3結論與討論

SO2濃度、pH、酒精度和發酵溫度對蘋果酒的蘋果酸-

乳酸發酵有較大的影響，當接種量達到5×106 CFU/ml時菌種能保持平緩的方式生長，接種量的變化對乳酸菌的生長影響不明顯。因此通過增大接種量以緩解SO2濃度、pH、酒精度和發酵溫度等因素對乳酸菌生長抑制的效果是有限的，篩選對抑制因素有更好耐受性的菌株就十分必要。活菌數與總滴定酸降低速率間呈正相關性，表明川秀乳酸菌1L型在MLF中可能是通過蘋果酸活菌代謝即蘋果酸在轉運蛋白作用下運輸到胞內，經脫羧產生乳酸和CO2，將乳酸排出胞外，但是這還需要對培養液中蘋果酸乳酸酶的活性測定進行驗證。該試驗僅是發酵過程中的乳酸菌生長和總滴定酸度的改變，而蘋果酒后發酵中還需要考慮酒的感官和其他理化指標。因此該研究可為蘋果酒的蘋果酸-乳酸發酵提供一定的參考。

安徽農業科學2015年

參考文獻

[1] 潘海燕.蘋果酒蘋果酸乳酸發酵的研究[D].無錫：江南大學，2004.

[2] 張春暉.中國優良酒類酒球菌（Oenococcus oeni）的分離篩選及蘋果酸-乳酸發酵研究[D].楊凌：西北農林科技大學，2001.

[3] 李愛霞.植物乳桿菌蘋果酸-乳酸發酵性能及其蘋果酸-乳酸酶的研究[D].楊凌：西北農林科技大學，2014.

[4] 熊犍，何翠嬋，林偉鋒，等.植物乳桿菌在青梅汁中的生長及蘋果酸乳酸發酵特性研究[J].現代食品科技，2013（12）：2850-2854，2914.

[5] 李維新.優良MLF乳酸菌選育及其產酶特性研究與應用[D].福州：福建農林大學，2012

[6] LERM E.The selection and characterization of lactic acid bacteria to be used as a mixed starter culture for malolactic fermentation[M].Stellenbosch：Stellenbosch University，2010.