視網膜母細胞瘤蛋白（pRb）、MMP—3和人細胞周期素D2（Cyclin—D2）在前列腺癌中的表達及臨床意義

陽翔蓮

摘要：目的：探討Cyclin-D2、MMP-3和pRb蛋白在前列腺癌組織中的表達及與前列腺癌生物學行為的關系.方法：應用免疫組化SP法檢測源80例前列腺癌和30例正常前列腺組織中Cyclin-D2、MMP-3和pRb蛋白的表達.結果： Cyclin-D2、MMP-3和pRb在前列腺癌中的陽性率分別為76.25%、73.75%、41.25%；Cyclin-D2和pRb蛋白在前列腺癌中的表達與病理類型有關（p<0.05），MMP-3在前列腺癌中的表達與病理類型無關（ p>0.05）；Cyclin-D2、MMP-3和pRb蛋白在前列腺癌復發組中的陽性率與無復發組相比，差異有顯著性（p<0.05）；Cyclin-D2與pRb在前列腺癌中的表達呈負相關，與MMP-3表達呈正相關。結論： Cyclin-D2、MMP-3和pRb蛋白的異常表達在前列腺癌發生、發展和復發中起重要作用，聯合檢測多個指標可能對患者預后的判斷有指導意義。

關鍵詞： 前列腺癌；Cyclin-D2；MMP-3；pRb；免疫組織化學

前列腺癌在歐美國家發病率較高， 東亞地區發病率較低， 但有增高趨勢， 我國近年來該病的發病率較20 世紀60 年代前明顯增高[1]. 對前列腺癌的診治已日益受到重視.，目前對前列腺癌發生發展和侵襲轉移的具體分子機制尚不清楚。

pRb蛋白由原始抑癌基因Rb編碼表達，在細胞周期中以磷酸化和去磷酸化的形式決定著轉錄因子E2F的活性，從而控制著細胞的生長和分化，其在控制細胞周期G1-S期轉化中起關鍵作用。CyclinD2是D型細胞周期素的成員之一，與細胞周期調節、分化和惡性轉化有關。研究表明，cyclinD2是Myc的直接靶點，它的聚集有助于隔離細胞周期抑制子p27而啟動細胞周期[2]。基質金屬蛋白酶3（matrix metalloproteinase3，MMP -3）的功能比較特殊，可以降解、重塑細胞外基質，并完全激活多種基質金屬蛋白酶前體（ProMMPs），包括ProMMP1、ProMMP3、ProMMP7、ProMMP8、ProMMP9、ProMMP13 等，使其成為臨床許多疾病病理過程研究的重要環節。本實驗通過檢測前列腺癌中pRb、MMP-3及Cyclin-D2的表達，旨在明確pRb、MMP-3及Cyclin-D2在前列腺癌發生發展中的作用及三者間相關性，從而為前列腺癌的生物治療提供新的實驗依據。

1 研究對象與方法

1.1 標本來源：本實驗石蠟標本取自2003年1月至2010年12月在湖南中醫藥大學第一附屬醫院泌尿外科住院行手術治療，術前未行化療和放療，術后均經病理檢查確診的患者。前列腺癌的病理分級采用Bocking（ 1982） 的三級標準， I ， Ⅱ ， Ⅲ級分別有42， 20 和18 例。 臨床分期采用1993 年版吳階平主編泌尿外科標準分為A、B、C、D 四期，分別各有31、24、17和8例. 甲醛固定石蠟包埋的組織切片常規進行HE染色，分別由2名病理診斷醫師確定腫瘤的病理類型以及組織學分級。包括正常前列腺組織30例和前列腺癌80例（漿液性囊腺癌42例，黏液性囊腺癌24例，子宮內膜樣癌14例）。80例前列腺癌中，中位年齡43歲；按組織分化程度分為：高一中分化47例，低分化33例；采用國際婦產科聯盟（FIG0）2009年制定的分期標準，臨床分期：I期+Ⅱ期42例，Ⅲ期+Ⅳ期38例。

1.2 免疫組化

pRb、MMP-3和Cyclin-D2單克隆即用型抗體和S-P Kits均購自北京中杉金橋公司，免疫組化采用SP法，DAB顯色。以已知 pRb、MMP-3和Cyclin-D2陽性組織切片作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 結果判定

Cyclin-D2和pRb陽性表達定位于腫瘤細胞胞核內，Cyclin-D2陽性表達定位于腫瘤細胞胞質內，均以出現棕褐色顆粒為陽性。每張切片隨機選擇10個高倍視野，計數1000個細胞，陽性細胞<10%為陰性，≥10%為陽性。

1.4 統計學分析

采用SPSS18.0統計軟件對所得數據進行分析，組間數據用χ2檢驗，相關分析用Spearman等級相關分析。

2 結果

2.1 pRb、MMP-3和Cyclin-D2在正常前列腺組織和前列腺癌中表達

Cyclin-D2在前列腺癌中陽性率為76.25%（61/80）（圖1），在正常前列腺組織中陽性率為23.33%（7/30），兩者差異有顯著性（p<0.05）；pRb在前列腺癌中陽性率為41.25%（33/80）（圖2），在正常前列腺組織中陽性率為86.67%（26/30），兩者差異有顯著性（p<0.05）；MMP3在前列腺癌中陽性率為73.75%（59/80）（圖3），在正常前列腺組織中陽性率為26.67%（8/30），兩者差異有顯著性（ p<0.05，表1）。

2.3 前列腺癌中pRb、MMP-3和Cyclin-D2蛋白表達的相關性

在33例pRb陽性表達的前列腺癌中MMP-3和Cyclin-D2陽性例數分別為19例（57.58%）和20例（60.61%），47例pRb陰性表達的前列腺癌中MMP-3和Cyclin-D2陽性例數分別為40例（85.11%）和41例（87.23%）；在61例Cyclin-D2陽性和19例 陰性表達的前列腺癌中MMP-3的陽性例數分別為55例（90.16%）和4例（21.05%）。Spearman等級相關分析表明，pRb分別與MMP-3和Cyclin-D2呈負相關，而MMP-3與Cyclin-D2呈正相關（表3）。

3 討論

研究證實Cyclin-D2是多種人類癌癥的重要調控因子。Sakuma M等研究表明，Cyclin-D2啟動子異常甲基化與前列腺癌患者預后差相關，與本組實驗結果相似；Cyclin-D2蛋白在前列腺癌中的陽性率明顯高于正常前列腺組織組，與Milde-Langosch K研究結果一致；本組研究還發現Cyclin-D2蛋白在低分化前列腺癌組的陽性率明顯高于中高分化組，Cyclin-D2在復發組中的陽性率明顯高于無復發組，差異有顯著性（p<0.05）。從病理分級上看，低分化前列腺癌侵襲性明顯高于高中分化型，且Cyclin-D2高表達者復發率增高，說明Cyclin-D2的表達隨著前列腺癌惡性程度升高而升高，Cyclin-D2蛋白的高表達患者預后差，與相關文獻類似，提示其表達可作為評價前列腺癌惡性程度的客觀指標之一。

MMP-3是一組鋅離子依賴性蛋白水解酶，由多個結構和功能上與ECM 結構蛋白及生長因子的功能單位具有同源性的區段拼接而成，這些相互適應的結構表現在“外顯子改裝”和“外顯子插入”中，其催化區域是包含鋅離子的由160～170 個氨基酸組成的致密球形結構，該區域能特異的與底物結合，同時，也是大多數人工合成的小分子MMP 抑制劑的作用靶點[3] 。MMP3 可降解幾乎所有的ECM，降低細胞之間的黏附狀態，從而使腫瘤細胞易于侵襲遷移，引起腫瘤的轉移[4] 。國內外有關MMP-3在前列腺癌中的表達報道較少，本研究發現前列腺癌組織和正常前列腺組織中MMP-3的陽性率分別為73.75%和26.67%，兩者差異有顯著性（p<0.05），另外MMP-3陽性率高的前列腺癌患者與陽性率低者相比，術后腫瘤復發率較高，兩者差異有顯著性（p<0.05），說明MMP-3在前列腺癌的發展、浸潤和轉移過程中發揮重要作用。其機制可能是前列腺癌過量表達MMP-3，其激活后降解了腫瘤細胞周圍基質和脈管基膜，使腫瘤細胞易于侵入周圍組織和脈管系統，形成連鎖反應進而共同促進腫瘤生長與侵襲。

pRb是視網膜母細胞瘤基因家族成員之一，是抑癌基因Rb的一種蛋白表達產物[5]，其與PRB2/p130、p107三者共同組成了視網膜母細胞瘤家族（Rb家族）蛋白。三種蛋白的結構和功能相似，作用相互補充。在細胞周期的進行中，通過對轉錄因子E2F家族成員活性的調節，在細胞周期的不同階段發揮負調控功能，將正在分裂的細胞阻滯于G1期，激活這個途徑的活動依賴于視網膜母細胞瘤蛋白質pRb損傷或缺失[6]。因此pRb是典型的抑癌基因之一，在人體內的各種正常組織中廣泛表達，而其發生突變或缺失與人類多種腫瘤的發生、發展密切相關[7]。pRb在多種惡性腫瘤中低表達，其在前列腺癌中的相關研究較罕見。本組研究結果顯示，pRb在前列腺癌中的表達水平明顯低于正常前列腺組織， pRb在前列腺癌復發組中的陽性率明顯低于無復發組，差異均有顯著性（ p<0.05）。這些結果均提示，pRb的失活促進了前列腺癌的惡性增殖及轉移，pRb陰性表達的前列腺癌患者預后差。pRb在惡性腫瘤中的預后與國內學者孫光等[8]在膀胱癌中的結果類似。

另外本文發現，在前列腺癌中Cyclin-D2與pRb的表達呈負相關，與MMP-3呈正相關，提示Cyclin-D2與pRb、MMP-3可能共同參與前列腺癌的發生、發展。pRb能夠調節E2F轉錄調節因子家族的活性，而E2F是許多與G1/S過渡有關的基因表達所需要的，這些基因之中就包括Cyclin-D2，這一現象表明在前列腺癌和癌前發生階段即存在pRb表達的缺失，也存在Cyclin-D2蛋白的異常高表達，使得細胞周期失控，促進了細胞的生長和腫瘤的發展，是前列腺癌的發生、發展中的重要事件。MMP-3蛋白表達與Cyclin-D2蛋白表達呈正相關，其可能是Cyclin-D2蛋白的異常高表達，使得細胞周期失控，而MMP-3能降解細胞外基質，進一步促進上皮前列腺癌的侵襲性生長，可能與Cyclin-D2在前列腺癌表達的調節過程中起到協同作用有關，其具體機制有待進一步研究。

綜上所述，本實驗中Cyclin-D2與pRb、MMP-3蛋白表達與前列腺癌生物學行為和預后相關，Cyclin-D2、MMP-3蛋白高表達、pRb蛋白低表達或陰性者，腫瘤惡性程度高，進展快，復發率高，預后差。聯合檢測前列腺癌中Cyclin-D2與pRb、MMP-3蛋白表達水平可能對判斷前列腺癌惡性程度及預后具有指導意義。

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