高效液相色譜熒光檢測法測定22種桑葉中1—脫氧野尻霉素含量的研究

徐斌　張東陽　劉利等

摘要 [目的] 采用柱前衍生高效液相色譜熒光檢測法（HPLCFLD），對22種桑葉中1-脫氧野尻霉素（DNJ）的含量進(jìn)行測定。[方法] 采用水浴超聲提取法提取桑葉中的DNJ，以9芴甲氧羰酰氯（FMOCCl）為衍生化試劑，在pH 8.5的K3BO3緩沖液中對DNJ進(jìn)行衍生，生成的熒光物質(zhì)FMOCDNJ用高效液相色譜熒光檢測法檢測。色譜流動相為乙腈—濃度0.1%乙酸水溶液。同時(shí)，對分離條件做了改進(jìn)，采用梯度洗脫的方法對桑葉提取物中衍生化的DNJ進(jìn)行分離。[結(jié)果]該方法的線性范圍為2.02～40.50 μg/ml，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 1；方法檢出限、定量限分別為0.15、0.50 μg/ml。對樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，回收率范圍為93.73%～97.91%。[結(jié)論] 該方法用于測定桑葉中DNJ的效果令人滿意。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜法；衍生化；熒光檢測；桑葉；1-脫氧野尻霉素

中圖分類號 S-03 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）20-001-03

Abstract [Objective] The contents of 1deoxynojirimycin （DNJ） in 22 kinds of mulberry leaves were determined by derivatization with 9fluorenylmethyl chloroformate followed by highperformance liquid chromatography equipped with a fluorescence detector （HPLCFLD）.[Method] DNJ was extracted from mulberry leaves by water bath and ultrasonic extraction，then derivatized using FMOCCl in K3BO3 buffer solution （pH=8.5）.The fluorescent product FMOCDNJ was detected by HPLCFLD.The mobile phase was acetonitrile and water （containing 0.1% acetic acid）.The elution process was optimized，which was different from the articles reported before.The derivatized DNJ in the extracts of mulberry leaves was separated by a gradient elution.[Result] The linear range of the method is 2.02-40.50 mg/L and the correlation coefficient （R2） is 0.999 1.The limits of detection （LOD） and quantification （LOQ） of the method are 0.15 and 0.50 μg/ml，respectively.The range of recoveryis shown to be 93.73%-97.91%.[Conclusion] The effect of quantifying DNJ in mulberry leaves is satisfactory by the optimized HPLCFLD method.

Key words High performance liquid chromatography； Derivatization；Fluorescence detection； Mulberry leaves； 1deoxynojirimycin

1-脫氧野尻霉素（DNJ）是一種存在于桑葉中的多羥基哌啶類生物堿，具有降血糖[1-2]、抗病毒[3-4]、抗腫瘤[5]等生物活性。目前，桑葉中DNJ的檢測分析方法有柱前衍生化高效液相色譜熒光檢測法（HPLCFLD）[6]、高效液相色譜蒸發(fā)光檢測法（HPLCELSD）[7]、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLCMS/MS）[8]、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（GCMS）[9]等。對于液質(zhì)、氣質(zhì)聯(lián)用法，雖然質(zhì)譜檢測器具有更高的靈敏度以及專一性，然而質(zhì)譜儀器價(jià)格較昂貴，檢測成本很高。相比而言，采用光譜檢測器的方法更具有普適性，有利于方法的推廣。筆者對Kim等[6]和歐陽臻等[10]報(bào)道的HPLCFLD法在分離條件上做了改進(jìn)和優(yōu)化。采用改進(jìn)后的HPLCFLD法對來自于全國12個(gè)省份的22種桑葉中DNJ含量進(jìn)行測定，并取得令人滿意的效果。這種改進(jìn)的HPLCFLD法可以為準(zhǔn)確測定桑葉中的DNJ含量提供可靠的分析手段。

1 材料與方法

1.1 桑葉樣品

供試22種桑葉采自全國12個(gè)省份。將采摘的桑葉（枝條上部葉）用超純水洗凈，晾干，放入電熱鼓風(fēng)干燥機(jī)中于120 ℃下烘1 h，然后在100 ℃下烘干至恒重。取適量桑葉，放入研缽中磨成粉末，備用。

1.2 桑葉中DNJ的提取

準(zhǔn)確稱取0.20 g桑葉粉末，加入25 ml錐形瓶中，向容量瓶中加入20 ml濃度70%的乙醇水溶液（V/V），搖勻。對桑葉粉末進(jìn)行水浴超聲提取，水浴溫度65 ℃，超聲功率 100 W，時(shí)間 20 min。在水浴超聲后，冷卻至室溫，抽濾，得到濾液、殘?jiān)渲袣堅(jiān)凑丈鲜隽鞒淘偬崛?次，冷卻，抽濾；將2次得到的濾液合并，轉(zhuǎn)移至50 ml容量瓶中，用超純水定容。

1.3 DNJ標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取2.30 mg DNJ于10 ml容量瓶，用超純水定容，得到 230 μg/ml DNJ標(biāo)準(zhǔn)儲備液，放入4 ℃冰箱中保存。取適量DNJ儲備液，用超純水稀釋，得到2.02、5.06、10.13、20.25、30.38、40.50 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

1.4 DNJ的衍生化

桑葉提取物溶液以及DNJ標(biāo)準(zhǔn)溶液的衍生化參照文獻(xiàn)[6]。

1.5 試驗(yàn)條件

熒光檢測器：激發(fā)波長 254 nm，發(fā)射波長 322 nm；色譜柱：Waters XBrige C18 柱 （150 mm× 4.6 mm，5 μm）；進(jìn)樣速度：1.0 ml/min，進(jìn)樣體積：10 μl，柱溫：25 ℃。桑葉提取物的分離采用梯度洗脫，流動相 A為乙腈，流動相B為濃度0.1%乙酸水溶液（V/V），0～4 min 32% A+68% B，4～7 min 梯度過渡到75% A+25% B，7～10 min 維持75% A+25% B，10～12 min 梯度過渡到32% A+68% B，12～15 min 維持32% A +68% B。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動相的優(yōu)化

歐陽臻等[10]使用HiQSiLC18（250 mm×4.60 mm，5 μm）色譜柱，以流動相A∶B（V/V）55∶45對桑葉提取物中DNJ衍生物進(jìn)行較好地分離[10]。然而，在實(shí)際試驗(yàn)中采用上述方法，對桑葉提取物溶液的分離效果并不理想。

從圖1可以看出，當(dāng)以流動相A∶B比例55∶45對桑葉提取物進(jìn)行等度洗脫時(shí)，出峰將集中在1.5～2.8 min。對DNJ標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行衍生后，在相同的條件下進(jìn)樣（圖2）。圖1中色譜峰1（保留時(shí)間1.99 min）即為DNJFMOC。此外，圖1中有2個(gè)倒峰，色譜峰2（保留時(shí)間2.99 min）為GlyFMOC，是 Gly（甘氨酸）與過量FMOCCl反應(yīng)生成物；色譜峰3為FMOCOH（保留時(shí)間3.77 min），是FMOCCl的水解峰。這兩個(gè)峰均為倒峰，是因?yàn)檠苌髽悠分羞@兩種物質(zhì)的含量過高，超出檢測器的響應(yīng)范圍所致。從分離結(jié)果可以看出，目標(biāo)成分DNJ出峰時(shí)間過早，說明流動相極性過小。此外，由于桑葉中存在多種與DNJ結(jié)構(gòu)很類似的生物堿如蕎麥堿（fagomine）、3表蕎麥堿（3epifagomine）、1，4雙脫氧1，4亞氨基D阿拉伯糖醇（DAB）等，這些物質(zhì)在衍生化過程中同樣會被衍生且與DNJ的保留時(shí)間相近[6]，加之出峰時(shí)間間隔過短，DNJ與這些物質(zhì)沒達(dá)到基線分離。

通過對流動相比例的優(yōu)化，建立如下的洗脫梯度：0～4 min 32% A + 68% B，4～7 min 梯度過渡到75% A + 25% B，7～10 min 維持75% A + 25% B，10～12 min 梯度過渡到32% A + 68% B，12～15 min 維持32% A + 68% B。對桑葉提取物的分離效果見圖3，對DNJ標(biāo)準(zhǔn)品衍生后在上述流動相下進(jìn)樣（圖4），可以確定圖3中色譜峰1是DNJFMOC（保留時(shí)間5.73 min）。相比于圖1，DNJ衍生物的出峰時(shí)間被推至5.73 min。這是一個(gè)理想的出峰時(shí)間。圖1中色譜峰黏連的問題得到很好的解決，DNJ與干擾物質(zhì)完全被分離開。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

對2.02～40.50 μg/ml DNJ標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行衍生后測定，以DNJ標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以對應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸擬合。由圖5可知，在2.02～40.50 μg/ml的范圍內(nèi)，所得回歸方程為y=2 220 591x-1 587 898，線性相關(guān)系數(shù)（R2）=為0.999 1。

2.3 方法檢測限以及定量限的確定

方法檢測限、定量限是通過所測得色譜峰的信噪比（S/N）來確定的。S/N=3對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為該方法的檢測限；S/N=10對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為該方法的定量限。通過連續(xù)稀釋DNJ標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生后測定，得到該方法的檢出限和定量限分別為0.15、0.50 μg/ml。

2.4 方法重復(fù)性與精密性試驗(yàn)

2.4.1 方法的重復(fù)性試驗(yàn)。對同一樣品進(jìn)行衍生后，連續(xù)測定6次，發(fā)現(xiàn)樣品峰面積RSD為2.92%。

2.4.2 方法的精密性試驗(yàn)。分為日內(nèi)精密性試驗(yàn)和日間精密性試驗(yàn)。對于日內(nèi)精密性試驗(yàn)，對一個(gè)樣品衍生后在同一日的不同時(shí)間內(nèi)測定6次，發(fā)現(xiàn)樣品峰面積RSD為4.21%。對于日間精密性試驗(yàn)，對一個(gè)樣品衍生后連續(xù)3 d測定，發(fā)現(xiàn)樣品峰面積RSD為3.83%。

2.5 方法回收率試驗(yàn)

選取一個(gè)樣品，平行稱取6份，分別加入相當(dāng)于該桑葉樣品測定含量50%、100%、150%的DNJ標(biāo)準(zhǔn)溶液。按照上述試驗(yàn)方法進(jìn)行測定，計(jì)算方法回收率（表1）。

2.6 桑葉中DNJ含量

對來自全國12個(gè)省份的22種桑葉品種中DNJ含量進(jìn)行測定。由表2可知，2種來源于四川省的魯桑葉7、8（樣品編號14、15）和1種來源于浙江省的魯桑葉9（樣品編號19）中DNJ含量明顯高于其他省份，來源于湖南省的魯桑葉10（樣品編號20）中DNJ含量最低。

3 結(jié)論

利用高效液相色譜熒光檢測法，測定了來自于全國12個(gè)省份的22種桑葉中的DNJ含量。與之前文獻(xiàn)報(bào)道相比，對HPLC的流動相進(jìn)行改進(jìn)。采用梯度洗脫的方法，成功地將DNJ與桑葉提取物中其他干擾物質(zhì)分離開，從而避免這些組分對定量結(jié)果的影響。在2.02～40.50 μg/ml范圍內(nèi)，線性回歸方程為y=2 220 591x-1 587 898，R2為0.999 1，方法的檢測限、定量限分別為0.15、0.50 μg/ml，對樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，回收率范圍為93.73%～97.91%。方法學(xué)研究表明，該方法的精密度、準(zhǔn)確度令人滿意。這種改進(jìn)的HPLCFLD法能夠精確地測定桑葉中DNJ含量，為建立DNJ的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測提供可靠的分析方法，也可以為開發(fā)降血糖藥用桑樹資源提供技術(shù)支持。

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