番茄紅素生物合成調控基因工程研究進展

程珍霞　胡海濤

摘要 番茄紅素對人體的健康有著至關重要的作用，在清楚高等植物類胡蘿卜素生物合成代謝相關基因的基礎上，利用生物工程手段調控上游基因的超表達和下游基因的沉默，以提高番茄紅素的含量已取得了進展。

關鍵詞 番茄紅素；基因表達調控；生物工程

中圖分類號 S188 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）20-027-02

Abstract Lycopene plays an important role in human health.Based on understanding the expression and regulation of carotene genes in higher plants，it is possible to use genetic engineering methods to increase lycopene content by overexpression of upstream gene and interference of downstream gene.

Key words Lycopene； Gene expression and regulation； Genetic engineering

番茄紅素是一種極具潛力的類胡蘿卜素化合物，對人體的健康有著至關重要的作用。它具有極強的抗氧化能力，可以延緩細胞和人體的衰老[1]、降低心血管疾病以及某些癌癥的發病率[2]等。但人體及動物自身無法產生番茄紅素，必須通過飲食從食物中攝取，人體攝取的番茄紅素中85%來源于番茄（Solanum lycopersicum）果實。隨著人口的增長，人們對番茄紅素的需求日益上升，因此，尋求高含量番茄紅素的植物種質成為當下亟需解決的問題。

基于類胡蘿卜素生物合成途徑的研究成果，通過基因工程手段調控番茄紅素的生物合成代謝日趨成熟[3]。筆者綜述了國內外對番茄紅素基因表達調控的研究進展。

1 類胡蘿卜素合成代謝相關基因的克隆

類胡蘿卜素是高等植物、真菌和光合微生物中廣泛存在的一種天然C40萜類化合物。高等植物的類胡蘿卜素主要存在于成色素細胞，通過類異戊二烯生物途徑合成，始于由八氫番茄紅素合成酶（PSY）催化的2分子牦牛兒基牦牛兒基焦磷酸（GGPP）向八氫番茄紅素的轉化，八氫番茄紅素經過八氫番茄紅素脫氫酶（PDS）和六氫番茄紅素脫氫酶（ZDS）的4步連續脫氫形成番茄紅素，在2種番茄紅素環化酶（LCYb、LCYe）的作用下形成胡蘿卜素，胡蘿卜素經過羥化酶和加氧酶的作用形成種類多樣的類胡蘿卜素及其他下游代謝產物。

為了從分子水平上理解類胡蘿卜素生物合成代謝，人們克隆了類胡蘿卜素生物合成相關基因。番茄是公認的類胡蘿卜素生物合成代謝模式植物，其相關基因是研究最早也是最透徹的。Cunningham等[4]結合前人的研究成果對類胡蘿卜素生物合成途徑的相關基因和酶進行了詳細總結。此后，大量物種的類胡蘿卜素合成基因相繼被克隆出來，如柑橘、橙、胡蘿卜、番木瓜等。通過序列比對發現植物類胡蘿卜素基因編碼的氨基酸序列在不同的物種間具有較高的保守性。對相關基因的時空表達分析顯示，盡管在不同的組織基因表達水平不同，但類胡蘿卜素含量及成分的變化與類胡蘿卜素生物合成相關基因的表達水平相關[5]，總體趨勢為隨著PSY、PDS、ZDS等基因的表達上調，類胡蘿卜素的總含量及番茄紅素含量隨之上升，而隨著LCYb、LCYe基因的表達下調，下游類胡蘿卜素的含量會隨之下降，但上游類胡蘿卜素，尤其是番茄紅素的含量則顯著增加。

2 類胡蘿卜素基因的表達調控

2.1 番茄紅素上游關鍵基因的超表達調控

PSY是類胡蘿卜素生物合成途徑的限速酶，由細菌CRTB基因與真核生物PSY基因編碼，調控PSY的表達量通常會引起類胡蘿卜素成分及含量的變化。將CRTB基因轉入胡蘿卜（Daucus carota），類胡蘿卜素提高了2～5倍[6]。在油菜（Brassica campestris）種子中特異性超表達CRTB基因，獲得的轉基因胚乳呈黃色，類胡蘿卜素含量上升了50倍，種子出現輕微萌發延遲現象[7]。在番茄果實中特異性超表達CRTB基因，PSY總活性上升了5～10倍，總類胡蘿卜素含量上升了2～4倍[8]。在2個品種的土豆（Solanum tuberosum）塊莖中特異性表達CRTB基因，轉基因土豆的β胡蘿卜素和葉黃素含量均大量上升[9]。在亞麻（Linum usitatissimum）中分別組成型和種子特異性超表達CRTB，結果組成型超表達的轉基因植株中CRTB基因也只在種子中表達，類胡蘿卜素總量達到65.4～156.3 μg/g鮮重，還積累了大量八氫番茄紅素、α胡蘿卜素和β胡蘿卜素[10]。在番茄中超表達CRTB基因，獲得的轉基因番茄果實中八氫番茄紅素的含量增加了1.8倍，類胡蘿卜素總量增加1.3～2.5倍[11]。 在番茄中組成型表達PSY基因，導致種皮、子葉、果實等多個器官的類胡蘿卜素含量發生變化，同時赤霉素含量下降了30倍，引起轉基因番茄植株的矮化現象[12]。在水稻（Oryza sativa）胚乳中分別進行組成型和胚乳特異性超表達水仙PSY，結果轉基因胚乳中只有特異性表達的胚乳能且僅能檢測到八氫番茄紅素[13]。在擬南芥（Arabidopsis thaliana）種子中特異性超表達其內源PSY基因，獲得的轉基因種子β胡蘿卜素含量上升了43倍，葉黃素、紫黃質、葉綠素和脫落酸的含量也顯著上升，種子出現休眠現象[14]。在番茄果實中組成型表達歐李（Cerasus humilis）PSY 基因，獲得的轉基因番茄果實中總類胡蘿卜素含量增加了1.62～3.04 倍[15]。

PDS是將八氫番茄紅素經過連續的2步脫氫轉變為六氫番茄紅素的酶，是類胡蘿卜素生物合成途徑中的另一重要酶。在煙草中組成型表達臘梅（Chimonanthus praecox）PDS基因，結果轉基因煙草中番茄紅素含量均高于野生型對照組[16]。在番茄中超表達番茄PDS基因，獲得的轉基因株系果實中的番茄紅素產量提高了1.4倍[17]。在小麥（Triticum aestivum）胚乳中特異性表達玉米y1（編碼PSY）和CRTI基因，轉基因小麥的總類胡蘿卜素含量上升了10.8倍[18]。在小麥中同時表達CRTB和CRTI基因，種子干重的總類胡蘿卜素含量提高了近8倍，β胡蘿卜素含量提高了65倍，維生素A前體含量提高了76倍[19]。

這些試驗結果均表明，在植物中超表達PSY、PDS等基因，能改變類胡蘿卜素含量及成分，但是不同的物種其變化類胡蘿卜素種類及程度不同，可能因為物種本身的類胡蘿卜素生物合成代謝相關基因的表達水平及酶活性不同導致結果的巨大差異。從這些研究中還發現，超表達的基因來自高等植物比來自原核生物的好，特異性超表達比組成型表達效果更好，選擇的受體物種中類胡蘿卜素生物合成基因表達量及酶活高的比不具有或基因表達量及酶活低的物種效果好。

2.2 番茄紅素下游代謝基因的干擾調控

要提高番茄紅素積累，理論上需要下調下游關鍵基因LCYb、LCYe的表達以降低其對番茄紅素的利用。利用2個反向LCYb、LCYe片段間插入GUS A基因構成干擾載體，通過遺傳轉化番茄，導致類胡蘿卜素含量明顯變化，證明RNA干擾（RNAi）技術是提高植物番茄紅素含量的有效方法[20]。將番茄LCYb、LCYe基因構建成正、反義干擾表達載體，結果轉基因番茄中番茄紅素的含量均有不同程度的上升[21]。通過RNAi 阻斷LCYb基因的表達來調控番茄紅素的積累，獲得的轉基因植株中番茄紅素的含量最高可達13.84 μg/g鮮重，是對照組的4.26倍[22]。通過控制反義LCYb基因在番茄果實中特異性表達，獲得的轉基因番茄中平均番茄紅素含量上升了2.1倍[23]。將擬南芥LCYb構建成果實特異性反義干擾載體，獲得的轉基因株系中LCYb基因表達水平下調了近1倍，導致番茄紅素含量上升[24]。使LCYe在土豆塊莖中特異性沉默，結果β胡蘿卜素含量顯著上升14倍，總類胡蘿卜素含量上升2.5倍[25]。這些研究結果均表明，干擾下游基因的表達可以提高番茄紅素的含量。

隨著基因表達調控研究的深入，在單獨調控的基礎上，衍生出將番茄紅素的上游超表達和下游干擾相結合的方式，同時調控番茄紅素的生物合成。通過果實特異性啟動子將擬南芥PSY 基因和番茄LCYb基因RNAi 片段構建在同一表達載體中，為獲得高含量的番茄紅素提供了新的技術平臺[26]。

3 結語

在植物中超表達類胡蘿卜素生物合成PSY、PDS等上游基因，或者借助反義、RNAi等技術引起下游基因的沉默，實現了類胡蘿卜素特定成分含量的變化，為通過基因調控手段提高番茄紅素含量提供了理論依據和有效的技術平臺。

參考文獻

[1]DI MASCIO P，KAISER S，SIES H.Lycopene as the most efficient biological carotenoid singlet oxygen quencher[J].Arch Biochem Biophys，1989，274（2）：532-538.

[2] ARAB L，STECK S.Lycopene and cardiovascular disease[J].Am J Clin Nutr，2000，71（6）：1691-1695.

[3] ENFISSI E M A，FRASER P D，BRAMLEY P M.Genetic engineering of carotenoid formation in tomato[J].Phytochem Rev，2006，5（1）：59-65.

[4] CUNNINGHAM JR F X，GANTT E.Genes and enzymes of carotenoid biosynthesis in plants[J].Annual Review of Plant Biology，1998，49（1）：557-583.

[5] GUO X，YANG L，HU H，et al.Cloning and expression analysis of carotenogenic genes during ripening of autumn olive fruit （Elaeagnus umbellata）[J].J Agr Food Chem，2009，57（12）：5334-5339.

[6] HAUPTMANN R，ESCHENFELDT W H，ENGLISH J，et al.Enhanced carotenoid accumulation in storage organs of genetically engineered plants：US，5618988[P].1997-04-08.

[7] SHEWMAKER C K，SHEEHY J A，DALEY M，et al.Seedspecific overexpression of phytoene synthase：increase in carotenoids and other metabolic effects[J].Plant J，1999，20（4）：401-412.

[8] FRASER P D，ROMER S，SHIPTON C A，et al.Evaluation of transgenic tomato plants expressing an additional phytoene synthase in a fruitspecific manner[J].P Natl Acad Sci USA，2002，99（2）：1092-1097.

[9] DUCREUX L J M，MORRIS W L，HEDLEY P E，et al.Metabolic engineering of high carotenoid potato tubers containing enhanced levels of βcarotene and lutein[J].J Exp Bot，2005，56（409）：81-89.

[10] FUJISAWA M，WATANABE M，CHOI S K，et al.Enrichment of carotenoids in flaxseed （Linum usitatissimum） by metabolic engineering with introduction of bacterial phytoene synthase gene crtB[J].J Biosci Bioeng，2008，105（6）：636-641.

[11] 張建成，周文靜，鄧秀新.超表達草生歐文氏菌crtB 基因促進轉基因番茄類胡蘿卜素合成的研究[J].園藝學報，2010，37（3）：390-396.

[12] FRAY R G，WALLACE A，FRASER P D，et al.Constitutive expression of a fruit phytoene synthase gene in transgenic tomatoes causes dwarfism by redirecting metabolites from the gibberellin pathway[J].Plant J，1995，8（5）：693-701.

[13] BURKHARDT P K，BEYER P，WNN J，et al.Transgenic rice （Oryza sativa） endosperm expressing daffodil （Narcissus pseudonarcissus） phytoene synthase accumulates phytoene，a key intermediate of provitamin A biosynthesis[J].Plant J，1997，11（5）：1071-1078.

[14] LINDGREN L O，STLBERG K G，HGLUND A S.Seedspecific overexpression of an endogenous Arabidopsis phytoene synthase gene results in delayed germination and increased levels of carotenoids，chlorophyll，and abscisic acid[J].Plant Physiol，2003，132（2）：779-785.

[15] 張建成，王鵬飛，郝燕燕，等.超量表達歐李ChPSY基因促進轉基因番茄類胡蘿卜素合成的研究[J].園藝學報，2014，41（8）：1563-1572.

[16] 陶靜靜.蠟梅八氫番茄紅素脫氫酶基因CpPds的克隆與表達分析[D].重慶：西南大學，2013.

[17] 鄒禮平，高和平，鐘亞琴.八氫番茄紅素脫氫酶基因超表達載體的構建及表達鑒定[J].湖北農業科學，2012，51（2）：393-395.

[18] CONG L，WANG C，CHEN L，et al.Expression of phytoene synthase1 and carotene desaturase crtI genes result in an increase in the total carotenoids content in transgenic elite wheat （Triticum aestivum L.）[J].J Agr Food Chem，2009，57（18）：8652-8660.

[19] WANG C，ZENG J，LI Y，et al.Enrichment of provitamin A content in wheat （Triticum aestivum L.） by introduction of the bacterial carotenoid biosynthetic genes CrtB and CrtI[J].J Exp Bot，2014，65（9）：2545-2556.

[20] MA C，MA B，HE J，et al.Regulation of carotenoid content in tomato by silencing of lycopene β/εcyclase genes[J].Plant Mol Biol Report，2011，29（1）：117-124.

[21] 馬超，何娟，郝青南，等.構建番茄紅素β/ε環化酶基因RNAi植物表達載體及其表達分析[J].核農學報，2010，24（3）：482-489.

[22] 馬超，馬兵鋼，郝青南，等.番茄紅素β環化酶基因（Lycβ）RNAi載體構建及表達鑒定[J].農業生物技術學報，2010，18（1）：10-17.

[23]萬群，張興國，宋明.果實特異性 RNAi 介導的 Lcy 基因沉默來增加番茄中番茄紅素的含量[J].生物工程學報，2007，23（3）：429-433.

[24] ROSATI C，AQUILANI R，DHARMAPURI S，et al.Metabolic engineering of betacarotene and lycopene content in tomato fruit[J].Plant J，2000，24（3）：413-420.

[25] DIRETTO G，TAVAZZA R，WELSCH R，et al.Metabolic engineering of potato tuber carotenoids through tuberspecific silencing of lycopene epsilon cyclase[J].BMC Plant Biol，2006，6（1）：13.

[26] 萬群，張興國，宋明，等.加強Psy基因表達和通過RNAi抑制Lcy基因表達的載體構建[J].農業生物技術學報，2007，15（3）：477-481.