小鼠NF—κBp65亞基真核表達質粒的構建

楊雪梅　吳靖萱　屈瑋

摘要 [目的] 構建小鼠NFκB p65亞基真核表達質粒。 [方法] 擴增NFκB p65亞基，然后構建其真核表達質粒（mNFκBp65pEGFPC1），并通過PCR和測序驗證重組質粒中p65亞基的正確性；然后提取無內毒素的質粒，轉染HepG2細胞，通過觀測重組蛋白所融合的綠色熒光蛋白，檢測目的蛋白表達情況。[結果] PCR產物的電泳結果顯示，成功擴增了小鼠NFκB p65亞基，成功構建了小鼠NFκB p65亞基的真核表達質粒，將其命名為mNFκBp65pEGFPC1。在真核細胞中，重組質粒可以成功表達小鼠NFκB p65亞基融合綠色熒光蛋白的目的蛋白。[結論] 重組質粒NFκBp65pEGFP構建成功，為后續開展NFκB信號通路的相關研究奠定了基礎。

關鍵詞 NFκB；p65；重組質粒；真核表達

中圖分類號 S865.1+3；Q786 文獻標識碼 A 文章編號 05176611（2015）20-038-03

Abstract [Objective] To construct mice NFKB p65 subunit eukaryotic expression plasmid. [Method] The NFκB p65 subunit was amplified by PCR， and then digested and ligated to pEGFPC1. The recombined plasmid was termed mNFκBp65pEGFPC1， and validated by enzyme digestion and PCR. Finally， we purified the endotoxinfree plasmid DNA， and transfected it into the HepG2 cells. The expression of NFκB p65 subunit was assayed by observing the fusion GFP protein. [Results] The electrophoresis results indicate that we have successfully obtained the NFκB p65subunit gene， and constructed the mice NFκB p65 subunit eukaryotic expression plasmid. After transfection into HepG2 cells， the recombined protein expressed successfully. [Conclusion] The mice NFκB p65 subunit eukaryotic expression plasmid was constructed successfully， which is important for the further study of NFκB signal in macrophage.

Key words NFκB； p65； Recombinant plasmid； Eukaryotic expression

肥胖正在全球范圍迅速蔓延，肥胖增加了個體罹患心血管疾病、糖尿病、骨關節炎和某些癌癥的風險，嚴重威脅著人類健康[1-3]。肥胖過程中，脂肪組織增大所導致的免疫細胞浸潤、炎性因子分泌增加，以及游離脂肪酸增多，引起了低度的慢性炎癥，這一慢性炎性是引起肥胖相關代謝疾病的重要原因[4]。NFκB信號通路在調控炎性及壓力應答中起了核心作用，外界病原菌侵入或內部壓力會在大多數細胞中激活NFκB信號通路，此外NFκB信號還與癌癥的發生相關[5]。最近的研究表明，NFκB信號通路與胰島素抵抗的形成密切相關[6-8]。在哺乳動物中，NFκB轉錄因子家族包含5個蛋白：p65（RelA）、RelB、cRel、p105/p50 （NFκB1）以及p100/p52 （NFκB2），這些蛋白具有保守的RHD結構域，可以形成同源或異源復合物調控轉錄。p50/65異源二聚體是最主要的Rel二聚體，在NFκB信號通路中扮演了重要角色[9-11]。

為了進一步研究NFκB調控巨噬細胞影響脂肪組織炎性中的作用，筆者擬構建小鼠NFκB p65亞基的真核表達質粒。小鼠的p65基因mRNA全長1 740 bp，其編碼區長度為1 650 bp，共編碼549個氨基酸。構建的小鼠p65真核表達質粒，為后續探究其對于NFκB p65亞基的調控，及其調控脂肪組織炎性的相關機制奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

RNA提取試劑TRIzol和反轉錄酶Reverse Transcriptase MMLVG購自Invitrogen公司， 限制性內切酶、DNA連接試劑盒和Taq酶購自TaKaRa公司；pEGFPC1質粒和HepG由合肥工業大學肥胖與代謝疾病研究所保藏；DNA純化試劑盒購自Axygen公司；無內毒素質粒提取試劑盒購自上海生工公司；胎牛血清（FBS）、optiMEM和DMEM培養基購自Gibco公司；Lipofecta mine 2000脂質體轉染試劑盒購自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠NFκB p65亞基引物設計。

通過NCBI找到GenBank中NFκB p65亞基序列，序列編號為GI：M61909.1。根據其mRNA中的編碼區進行引物設計，引入限制性內切酶酶切位點（加粗處），引物序列如下：上游引物為5 CCCTCGAGATGGACGATCTGTTTCCCCT 3（引入XhoⅠ酶切位點）；

下游引物為5 CCCAAGCTTTTAGGAGCTGATCTGACTC 3 （引入HindⅢ酶切位點）。引物由Invitrogen公司（上海）合成。

1.2.2 小鼠NFκB p65亞基擴增。

取小鼠肝臟，剪碎后利用TRIzol提取總RNA，驗證RNA完整性及純度后，再利用反轉錄酶MMLV反轉錄合成cDNA。 以cDNA為模板，利用設計的上下游引物擴增小鼠NFκB p65亞基的ORF序列。反應體系為50 μl： rTaq酶0.25 μl，10× PCR Buffer 5 μl，dNTP 4 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，cDNA模板1 μl，滅菌水37.75 μl。PCR循環條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共3個循環；94 ℃變性30 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共27個循環；最后72 ℃延伸5 min。利用1%瓊脂糖凝膠對PCR產物進行電泳檢測。

1.2.3 小鼠NFκB p65亞基真核表達重組質粒的構建。

將上述PCR產物（包含NFκB p65亞基的開放讀碼框）和pEGFPC1載體，使用XhoⅠ和HindⅢ雙酶切，電泳后再利用DNA純化試劑盒純化DNA。然后用DNA連接試劑盒連接NFκB p65亞基和pEGFPC1載體，構建重組質粒。連接產物轉化感受態JM109，挑取菌落，PCR驗證確認重組菌包含p65亞基后，LB液體培養基擴大培養。使用無內毒素質粒抽提試劑盒提取重組質粒，將重組質粒命名為mNFκBp65pEGFPC1，-80 ℃儲存備用。

1.2.4 HepG2細胞的培養和瞬時轉染。HepG2細胞在37 ℃、5% CO2的條件下培養，培養基為含10%FBS的DMEM，隔天更換1次培養基，細胞長滿后用胰酶進行消化傳代。轉染試驗時，將細胞接到96孔細胞培養板上培養，細胞密度達到90%融合時，準備轉染試驗，首先用不含血清和雙抗的DMEM處理過夜；然后每孔按以下方法轉染，分別準備50 μl optiDMEM加入0.5 μg mNFκBp65pEGFPC1重組質粒，50 μl optiMEM 加入1 μl Lipofecta mine 2000脂質體，靜置5 min后，將兩者充分混勻后細胞上轉染6 h；然后去除轉染液，加入無血清無雙抗DMEM，恢復培養過夜； 利用倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光，拍照。

2 結果與分析

2.1 小鼠NFκB p65亞基擴增

取小鼠肝臟，提取總RNA，取1 μg 總RNA反轉錄得到cDNA，然后利用PCR擴增小鼠NFκB p65亞基開放讀碼框。瓊脂糖凝膠電泳結果表明，成功擴增了小鼠NFκB p65亞基，包含引入的酶切位點全長1 664 bp（圖1）。

2.2 小鼠NFκB p65亞基真核表達重組質粒的構建

將上述擴增的小鼠NFκB p65亞基（通過引物引入了酶切位點）（圖1），以及pEGFPC1質粒經XhoⅠ和HindⅢ雙酶切（圖2），純化后用DNA連接試劑盒進行連接。連接后轉化到大腸桿菌JM109進行擴增，提取重組質粒，用PCR驗證重組菌是否包含了目的基因（圖3）。PCR驗證結果表明重組菌中包含了

NFκB p65亞基的開放讀碼框，然后送去測序，測序顯示重組質粒中的插入序列與NFκB p65的ORF完全一致，說明NFκB p65亞基的真核表達質粒構建成功，將其命名為mNFκBp65pEGFPC1。擴大培養后，提取不含內毒素的重組質粒。

2.3 重組質粒mNFκBp65pEGFPC1的真核轉染驗證

為了驗證構建的重組質粒mNFκBp65pEGFPC1能否在真核細胞中進行表達，將重組質粒轉染進入HepG2細胞，通過觀察綠色熒光，來判斷NFκBp65蛋白的表達情況。將不含內毒素的質粒利用Lipofecta mine 2000脂質體轉染NFκBp65后，分別在24和48 h后觀察綠色熒光（圖4）。結果表明轉染48 h后有很強的綠色熒光，說明重組質粒在真核細胞中成功表達了NFκBp65的融合蛋白。

3 討論

肥胖的流行及其相關代謝疾病，嚴重危害著人類健康。肥胖作為一種低等的慢性炎性疾病理論，已經得到廣泛共識，也為肥胖的預防與控制提供了新的思路[4-5，12]。作為炎性調控的核心信號通路，NFκB信號通路參與了肥胖的發生及其相關代謝疾病的產生[6-8]。NFκB轉錄因子家族由眾多蛋白組成，其中p65亞基及其與p50組成的異源二聚體是細胞中含量最豐富的NFκB轉錄因子。因此，研究NFκB信號通路在脂肪組織炎性中的作用，并篩選以p65等NFκB轉錄因子為靶標的天然產物或藥物，有助于肥胖機理的闡明和新的治療方式的開發。這就需要建立相關的體外篩選體系，那首要目標就是建立p65的真核表達質粒，該研究恰是圍繞這一目標展開。

P65在肝臟中表達豐度較高，筆者利用小鼠的肝臟提取RNA，反轉錄得到cDNA，然后成功擴增小鼠p65的編碼區（圖1）。將PCR產物經XhoⅠ和HindⅢ雙酶切后（圖2）與真核表達質粒pEGFPC1連接，PCR驗證（圖3）表明，成功構建了重組質粒，將其命名為mNFκBp65pEGFPC1。提取無內毒素的質粒轉染HepG2細胞，觀察到綠色熒光（圖4），說明融合蛋白得到了成功表達。成功構建的小鼠p65真核表達質粒，可以用于真核表達試驗，為后續研究NFκB信號通路在脂肪組織炎性中的作用，篩選以p65為靶標最終調控脂肪組織炎性及相關代謝疾病的天然產物或藥物奠定了基礎。

參考文獻

[1]JAMES P T， LEACH R， KALAMARA E，et al. The worldwide obesity epidemic [J]. Obes Res， 2001， 9（suppl4）： 228-233.

[2] LEVINE J A. Obesity in China： Causes and solutions [J]. Chin Med J， 2007， 120（11）： 1043-1050.