復合益生菌粉對刺參生長·體壁成分和消化酶活性的影響

錢淑媛　王福強　憨素連等

摘要 [目的]研究飼料中添加復合益生菌粉對刺參生長、體壁成分和消化酶活性的影響。[方法] 在基礎日糧中分別添加含有0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%的復合益生菌粉（由枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌、釀酒酵母菌組成，含有106CFU/g）進行喂養試驗，養殖8周。[結果]隨著復合益生菌添加量的提高，刺參增重率和特殊生長率有增加趨勢。與對照組相比，添加0.8%的復合益生菌能顯著提高刺參的增重率和特定生長率（P<0.05）。復合益生菌對刺參成活率和體壁成分均無顯著影響（P>0.05）。復合益生菌對刺參腸道的消化酶活性也無顯著影響（P>0.05），但有提高刺參腸道脂肪酶活性的趨勢。當益生菌添加量為0.4%時，刺參脂肪酶活性最高。[結論]復合益生菌粉能夠促進刺參的生長。當益生菌添加量為0.8%時刺參的生長較好。

關鍵詞 復合益生菌；刺參；生長；消化酶活性

中圖分類號 S816 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）20-129-04

Abstract [Objective] The experiment was conducted to investigate the effects of compound probiotics powder on the growth，body wall composition and digestive enzyme activity of sea cucumber，Apostichopus japonicus.[Method] Five diets were formulated by supplementing with 0.0%（control），0.4%，0.6% and 0.8% compound probiotics （Bacillus subtilis，Lactobacilli acidophilus，Saccharomyces cerevisiae，106cfu/g） in basal diet，respectively.The experiment lasted for 8 weeks.[Result] Weight gain and specific growth rate had an increasing trend with increasing compound probiotics，weight gain and specific growth rate in sea cucumber fed the diets with 0.8% supplementation were significantly higher than that of control group （P<0.05）.There were no significant difference on survival rate and body wall composition among treatments （P>0.05）.Although there were no significant difference on digestive enzyme activity （P>0.05），sea cucumber fed the diets with compound probiotics showed higher trends of lipase activity than those fed the control diet.The highest lipase activity appeared in 0.4% supplementation group.[Conclusion] Diet supplementing with 0.8% compound probiotics can promote the growth performance of sea cucumber .

Key words Compound probiotics； Apostichopus japonicus； Growth performance； Digestive enzyme activity

刺參是棘皮動物門、海參綱的動物，是我國黃渤海海域最具經濟價值的水產養殖品種之一。大規模、高密度的刺參人工養殖、藥物濫用常常會導致刺參的疾病和死亡大規模爆發等問題。在飼料中添加益生菌，不僅可以提高養殖動物的增重率，而且可以增強養殖動物的免疫力，降低疾病的發生幾率，是實現生態養殖的重要方式。

大量研究表明，益生菌對魚類的生長有積極作用[1-3]。益生菌還可以產生多種酶類，減少細菌毒素毒害的發生[4]。

復合益生菌比單一益生菌對水產動物有更好的作用效果。胡毅等[5]用復合益生菌和單一益生菌投喂凡納濱對蝦，復合益生菌組的特定生長率、飼料效率、溶菌酶活力和血清蛋白濃度等均優于單一益生菌組。Salinas等[6]用芽孢桿菌和乳酸菌復合投喂烏頰魚（Gilthead seabream）效果比單一的這2種菌更好。

益生菌在刺參養殖上的應用研究還較少報道。筆者研究了復合益生菌粉對刺參的生長、刺參體壁成分和腸道消化酶活性的影響，探索益生菌在刺參方面的應用，以期為刺參的可持續養殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 復合益生菌。

試驗所用的復合益生菌由大連陽光白奧科技有限公司生產，由枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis， 106CFU/g以上）、嗜酸乳桿菌（Lactobacilli acidophilus， 106CFU/g以上）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae， 106CFU/g以上）組成。

1.1.2 試驗動物。

試驗所用刺參來自大連水益生海洋生物科技公司的同一批次刺參苗，刺參購回后暫養馴化7 d。挑取個體大小均勻的健康刺參隨機分為5組，每組3個重復，每個重復30頭刺參，試驗刺參初始體重為（1.07±0.02）g。

1.1.3 試驗地點。養殖試驗在大連海洋大學遼寧省水生生物學重點實驗室進行。

1.2 方法

1.2.1 試驗飼料。試驗基礎日糧組成和營養成分見表1～2。分別在基礎日糧中添加0、0.2%、0.4%、0.6%和0.8%的復合益生菌，制成A、B、C、D、E 5組飼料。在低于20 ℃室內陰干后，貯存于-20 ℃的冰箱中備用。

1.2.2 飼養管理。

每天以刺參體重的3%投餌，根據攝食情況適當調整飼喂量，達到飽食投喂，每天17：20投喂1次，次日13：30吸除殘餌和糞便，并補充暫存1 d的沙慮海水。飼養期間連續充氣，水溫控制在（15±3）℃。養殖試驗持續56 d。

1.2.3 生長指標的測定。

同時，采集刺參體壁進行體成分分析。粗蛋白的測定采用凱氏定氮法（GB/T 6432-1994），粗脂肪的測定采用索氏抽提法（GB/T 6433-1994），灰分的測定采用550 ℃灼燒質量法（GB/T 6438-2007）。

1.2.4 腸道消化酶活性的測定。粗酶液的提取：刺參腸道粗酶液的提取參照袁成玉等[7]的方法進行，收集刺參后，在冰盤中將腸道取出，將刺參腸道內容物擠出，并用冷凍雙蒸水沖洗干凈。用濾紙輕輕吸干水分，迅速稱重，在勻漿器中勻漿，并且稀釋10倍制成勻漿液，4 ℃下3 000 r/min 離心30 min，取上清液立即測定。

腸道中蛋白酶的活力采用福林-酚法進行測定。腸道中淀粉酶的活力采用淀粉-碘顯色法進行測定。腸道中脂肪酶活力采用滴定法進行測定[8]。

1.2.5 數據處理。

試驗結果以平均值±標準差表示，并使用SPSS17.0統計軟件進行方差分析，在差異顯著時對平均數進行鄧肯氏多重比較。

2 結果與分析

2.1 復合益生菌對刺參生長、存活率及體成分的影響 由表2可知，各組刺參的始重無顯著差異（P>0.05）；養殖56 d后添加益生菌的各組刺參末重、增重率和特定生長率隨著益生菌添加量的增加呈現遞增的趨勢。其中，E組增重率和特定生長率均顯著高于A、B、C組（P<0.05），其他試驗組與A組差異不顯著（P>0.05）；各試驗組刺參的存活率較高，但各組之間沒有顯著差異（P>0.05）。

2.2 復合益生菌對刺參體壁成分的影響

由表3可知，試驗組的粗脂肪含量較低，粗灰分含量較高，但各組間刺參體壁的粗蛋白、粗脂肪和粗灰分含量均沒有顯著差異（P>0.05）。

2.3 復合益生菌對刺參腸道消化酶活性的影響

由表4可知，隨著益生菌添加量的增加，刺參腸道中蛋白酶活性有輕微的降低趨勢，E組有所回升。但是，不同處理組間腸道蛋白酶活力沒有顯著差異（P>0.05）。刺參腸道中淀粉酶活性B組比A組有所升高，C組反而降低，之后又升高。不同處理組間腸道淀粉酶活力沒有顯著差異（P>0.05）。刺參腸道中脂肪酶活性先逐漸上升，后有所回落。但是，不同處理組間腸道脂肪酶活力也沒有顯著差異（P>0.05）。

3 討論與結論

3.1 飼料中添加益生菌對刺參生長和存活率的影響

芽孢桿菌可以飼料的形式進入水產動物的消化道中，提高其消化酶的活性，促進動物生長[9-10]。有學者推測，芽孢菌可以促進水產動物的生長和消化，可能是由于芽孢菌可以分泌豐富的胞外消化酶類，對水產動物有輔助消化的作用[11]。

嗜酸乳桿菌具有較高的蛋白水解酶活性[12]，這可能有輔助消化作用。Son等[13]在石斑魚飼料中添加4周的植物乳酸桿菌后，石斑魚的增重率和飼料效率顯著提高。Suzer等[14]的研究表明，在黑鯛（Sparus aurata）的仔魚發育階段使用乳酸菌，可以提高仔魚的生長性能和消化酶活性。Aly等[15]在飼料中添加乳酸菌，飼喂羅非魚1個月和2個月后均可以顯著提高其體增重。Ha等[16]將1 g/kg的熱滅活的植物乳酸桿菌添加到對蝦的飼料中，可以提高對蝦的存活率、體增重率和特定生長率。王國霞等[17]證實添加10%的乳酸菌可以提高南美白對蝦的成活率、增重率和特定生長率，降低餌料系數。在凡納濱對蝦的研究中也得到相似結果[18]。

酵母菌含有豐富的菌體蛋白，可以作為水產動物的餌料而被利用。酵母的細胞蛋白可以替代一定的魚粉或蝦粉，并且適宜的替代量可以促進魚蝦的生長，提高飼料效率，從而降低養殖成本[19]。

大量研究表明，飼料中添加益生菌也可以促進刺參的生長性能。王路平等[20]發現微生態制劑能夠凈化養殖水質，并且顯著提高刺參生長速度。周慧慧等[21]發現仿刺參腸道中分離的益生菌能夠使刺參生長得到促進，抗病力也有所加強。李明[22]用酵母菌和枯草芽孢桿菌投喂刺參，刺參的特定生長率顯著提高。袁成玉等[7]用光合細菌和芽孢桿菌飼喂刺參后特定生長率明顯提高。該試驗中飼料中添加0.8%復合益生菌能顯著提高刺參的增重率和特定生長率，但較低水平的益生菌添加量的促生長作用不明顯。該試驗結果與上述研究基本一致。這也預示著益生菌必須達到一定的添加量才具有促進生長的效果。

3.2 飼料中添加益生菌對刺參體成分的影響

為了考察飼料添加劑對刺參品質的影響，在試驗結束后測定刺參體壁中主要營養成分。該試驗中粗蛋白和粗脂肪含量與對照組相比均無顯著差異（P>0.05），C組的粗灰分含量最高，但與其他組間差異不顯著（P>0.05）。Shear[23]認為影響粗蛋白含量的因素主要是內因（如魚體大小，不同發育階段）造成的，而外因（如溫度、鹽度、日糧等）對魚體粗蛋白含量沒有影響。魯琳等[24]研究表明在飼料中添加微生物制劑對虹鱒魚體成分無明顯不良影響。這些研究與該試驗結果類似。

3.3 復合益生菌對刺參腸道消化酶活性的影響

大量研究表明，飼料中添加一些益生菌能影響魚的消化酶活性。華雪銘等[25]研究表明枯草桿菌和地衣芽孢桿菌等益生菌能提高暗紋東方鲀腸道的消化酶活性。丁賢等[26]研究發現芽孢桿菌能顯著影響對蝦腸道中蛋白酶活性。Pan等[27]研究表明添加芽孢桿菌制劑的鯉魚試驗組腸道蛋白酶和淀粉酶活性均比對照組顯著提高。一定濃度的芽孢桿菌也顯著提高了印度白對蝦和凡納濱對蝦腸道蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等消化酶的活性[28-29]。Suzer等[14]報道在金頭鯛的仔魚發育階段使用乳酸菌可以提高仔魚的生長性能和消化酶活性。ZiaeiNejad[28]認為益生菌可以刺激對蝦產生內源性酶，從含有益生菌的日糧中獲得高活力的酶。

益生菌對刺參腸道消化酶的影響也有報道。張艷婷[30]研究表明滅活植物乳桿菌也能提高刺參腸道的蛋白酶和淀粉酶的活性。張濤等[31]用仿刺參腸道篩選的乳酸菌和芽孢桿菌投喂仿刺參，提高了腸道內蛋白酶和淀粉酶的活性。李明[22]用酵母菌和枯草芽孢桿菌投喂刺參，刺參的脂肪酶、淀粉酶、胰蛋白酶都顯著提高。袁成玉等[7]用光合細菌和芽孢桿菌飼喂刺參后，蛋白酶和淀粉酶的活性高于對照組。

該試驗中添加不同水平的復合益生菌對蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性均無顯著差異。該試驗結果與上述文獻報道并不一致。這可能是此次試驗的水溫較低（12～15 ℃）、益生菌的添加量也較低（106 CFU/g），導致芽孢桿菌和酵母菌等益生菌產酶活力較弱所致，有必要研究在不同水溫下添加更大劑量益生菌對刺參腸道消化酶活性的影響，以探討益生菌作用的最適水溫和最適添加量。

參考文獻

[1] 邱燕，蔡春芳，代小芳，等.枯草芽孢桿菌對草魚生長性能與腸道黏膜形態的影響[J].中國飼料，2010（19）：34-36.

[2] GHOSH K，SEN S K，RAY A K.Supplementation of an isolated fish gut bacterium，Bacillus circulans， in formulated diets for rohu，Labeo rohita， fingerlings[J].Bamidgeh，2003，55：13-21.

[3] 李衛芬，沈濤，陳南南，等.飼料中添加枯草芽孢桿菌對草魚消化酶活性和腸道菌群的影響[J].大連海洋大學學報，2012，27（3）：221-225.

[4] HARRIS L J，DAESCHEL M A，STILES M E，et al.Antimicrobial activity of lactic acid bacteria against Listeria monocytogenes[J].Journal of Food Protection，1989，52（6）：384-387.

[5] 胡毅，譚北平，麥康森，等.飼料中益生菌對凡納濱對蝦生長、腸道菌群及部分免疫指標的影響[J].中國水產科學，2008，15（2）：244-251.

[6] SALINAS I，CUESTA A，ESTEBAN M.Dietary administration of Lactobacillus delbrueckii and Bacillus subtilis， single or combined，on gilthead seabream cellular innate immune responses[J].Fish Shellfish Immunol，2005，19：67-77.

[7] 袁成玉，張洪，吳垠，等.微生態制劑對幼刺參生長及消化酶活性的影響[J].水產科學，2006，25（12）：612-615.

[8] 桂遠明.水產動物機能學實驗[M].北京：中國農業出版社，2004：124-147.

[9] WANG Y B.Effect of probiotics on growth performance and digestive enzyme activity of the shrimp Penaeus vannamei[J].Aquaculture，2007，269（1/4）：259-264.

[10] ALY S M，MOHAMED M F，JOHN G.Effect of probiotics on the survival，growth and challenge infection in Tilapia nilotica （Oreochromis niloticus）[J].Aquaculture Research，2008，39（6）：647-656.

[11] GATESOUPE F J.The use of probiotics in aquaculture[J].Aquaculture，1999，180（1/2）：147-165.

[12] ZHAO R X，SUN J L，MO H Z，et al.Analysis of functional properties of Lactobacillus acidophilus[J].World Journal of Microbiology and Biotectmology，2007，23（2）：195-200.

[13] SON V M，CHANGA C C，WU M C，et al.Dietary administration of the probiotic，Lactobacillus plantarum，enhanced the growth，innate immune responses，and disease resistance of the grouper Epinephelus coioides[J].Fish Shellfish Immunol，2009，26：691-698.

[14] SUZER C，COBAN D，KAMACI H O，et al.Lactobacillus spp.bacteria as probioticsin gilthead sea bream （Sparus aurata L） larvae：Effects on growth performance and digestivc enzyme activities[J].Aquaculture，2008，280：140-145.

[15] ALY S M，AHMED Y A G，GHAREEB A A A，et al.Studies on Bacillus subtilis and Lactobacillus acidophilus，as potential probiotics，on the immune response and resistance of Tilapia nilotica （Oreochromis niloticus） to challenge infections[J].Fish Shellfish Immunol，2008，25：128-136.

[16] THANH TUNG H，KOSHIO S，ISHIKAWA M，et al.Effects of dietary heatkilled Lactobacillus plantarum on larval and postlarval kuruma shrimp， Marsupenaeus japonicus Bate[J].Journal of the World Aquaculture Socirty，2010，41（S1）：16-26.

[17] 王國霞，黃燕華，黃文慶，等.乳酸菌對南美白對蝦生長，飼料利用和體組成的影響[J].中國飼料，2010（12）：24-32.

[18] 王國霞，黃燕華，周曄，等.乳酸菌對凡納濱對蝦生長性能、消化酶活性和非特異性免疫的影響[J].動物營養學報，2010，22（1）：228-234.

[19] OLIVATELES A，GONQALVES P.Partial replacement of fishmeal by brewers yeast （Saccaromyces cerevisae） in diets for sea bass （Dicentrarchus labrax） juveniles[J].Aquaculture，2001，202（3/4）：269-278.

[20] 王路平，吳垠，班紅琴，等.微生態制劑對刺參幼參在封閉式循環養殖系統中的應用研究[J].中國微生態學雜志，2009，21（6）：497-499.

[21] 周慧慧，馬洪明，張文兵，等.仿刺參腸道潛在益生菌對刺參生長、免疫及抗病力的影響[J].水產學報，2010，34（6）：955-963.

[22] 李明.混合益生菌對刺參生長、免疫、消化和腸道菌群的影響[D].大連：大連海洋大學，2014.

[23] SHEARER K D.Factors affecting the proximate composition of cultured fishes with emphasis on salmonids[J].Aquaculture，1994，119：63-88.

[24] 魯琳，于志強，燕楠.資源化微生物添加劑對虹鱒魚生長性能的影響[J].飼料研究，2007（3）：3-5.

[25] 華雪銘，周洪淇，張宇峰.飼料中添加殼聚糖和益生菌對暗紋東方鲀幼魚生長及部分消化酶活性的影響[J].水生生物學報，2005，29（3）：299-304.

[26] 丁賢，李卓佳，陳永青，等.芽孢桿菌對凡納對蝦生長和消化酶活性的影響[J].中國水產科學，2004，11（6）：580-584.

[27] PAN K C，YANG H B. Progress in study of mechanism of Bacillus[J].Feed Industry，1997，18（9）：32-34.

[28] ZIAEINEJAD S，REZAEI M H，TAKAMI G A，et al.The effect of Bacillus spp.Bacteria used as probiotics on digestive enzyme activity，survival and growth in the Indian white shrimp Fenneropenaeus indicus[J].Aquaculture，2006，252（2/4）：516-524.

[29] 王彥波，傅玲琳.益生菌對凡納濱對蝦生長性能和消化酶活性的影響[J].飼料工業，2010，31（20）：12-14.

[30] 張艷婷.熱滅活乳酸桿菌（HKLP）對刺參生長性能、消化酶活性、免疫力以及人工感染燦爛弧菌后免疫反應的影響[D].大連：大連海洋大學，2012.

[31] 張濤，白嵐，李蕾，等.不同添加量的益生菌組合對仿刺參消化和免疫指標的影響[J].大連水產學院學報，2009（S1）：64-68.