誘發枇杷霜凍害的冰核細菌拮抗菌分離與篩選

邱春錦　彭建平　鄭國棟

摘要 [目的]篩選出具有防除枇杷INA細菌的拮抗菌。[方法]從枇杷根際土壤中分離冰核細菌拮抗菌，對其進行抑菌圈、殺菌能力、破壞冰核活性蛋白能力測定。[結果]從不同海拔地區的根際土壤中共分離得到128個菌株，其中有拮抗效果的有55株，平皿拮抗效果強的有15株，再經拮抗系數比較得到9株強拮抗菌菌株，最后篩選出1株殺菌率達98%、破壞冰核蛋白能力達100%的拮抗菌BL36。[結論]BL36既有殺菌效果又有破壞冰核蛋白能力，是具有較好利用前景的防除誘發枇杷霜凍害冰核細菌、減輕枇杷霜凍害的生物防治材料。

關鍵詞 枇杷；拮抗菌；冰核細菌；抑菌圈法；殺菌能力；破壞冰核蛋白能力

中圖分類號 S432.4+2 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）20-168-03

Abstract [Objective] The aim was to screen out antagonistic bacteria to control ice nucleation active bacteria （INA） which induced loquat frost. [Method] INA antagonistic bacteria was screened out from rhizosphere soil of loquat， and then inhibition zone， inhibition ability and the damage of ice nucleation active protein were determined. [Result] Results showed that 128 strains were isolated from the rhizosphere soil at different altitudes， among 55 strains had antagonistic effect， 15 strains had strong antagonistic effect. Then through the comparison of antagonistic coefficient， 9 strains with strong antagonistic bacteria were acquired. One strain of antagonistic bacterium named BL36 was screened out finally； its bactericidal rate reached 98%， and the damage of ice nucleation active protein reached 100%. [Conclusion] BL36 had both bactericidal effect and damage of ice nucleation active protein， and was a biological control of materials which could control INA and reduce loquat frost， so it had a good utilization prospect.

Key words Loquat； Antagonistic bacteria； INA； Inhibition zone method； Bactericidal effect； Damage of ice nucleation active protein

枇杷是原產我國的一種兼具營養和保健功效的水果。枇杷秋花冬果，在福建省閩中地區其幼果期適逢一年中最冷的月份，一場霜凍害能在短短的幾個小時內造成大面積減產甚至絕收[1-4]。長期以來，人們一直認為霜凍僅是低溫對植物脅迫作用所造成的危害，王慧等指出冰核細菌（簡稱INA細菌）是誘發枇杷幼果凍害的主要因素[5]。冰核細菌能夠破壞水的過冷卻狀態，在-3.0～-1.0 ℃誘發植物細胞間水結冰而發生霜凍[6-12]。國內外學者已開始從自然界植物體上的多種微生物中篩選對INA細菌有拮抗作用、營養競爭能力強、抑殺或寄生性強的微生物菌株，對其進行了人工生產繁殖，再噴灑在植物體上，以期控制或殺滅INA 細菌，達到防御霜凍的目的[13-16]。Lindow 從玉米上分離到一種M232A 拮抗菌，處理霜凍指數比對照降低了30.8，處理株高為1.5 m的田間玉米，當發生氣溫為-2.5～-1.5 ℃的霜凍時，處理霜凍指數為0.8，而對照霜凍指數高達2.1，防效十分顯著[17]。目前關于分離拮抗菌防除冰核細菌減輕霜凍害的研究已有較多報道，但在枇杷上尚屬空白。鑒于此，筆者從枇杷根際土壤中分離冰核細菌拮抗菌，采用抑菌圈測定、殺菌能力測定、破壞冰核活性蛋白能力測定等方法篩選具有防除枇杷INA細菌的拮抗菌，旨在為降低由冰核細菌誘發的枇杷霜凍害提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種。INA細菌L4菌株分離自福建省莆田市鐘山鎮霜凍害發生區的田間枇杷花瓣上，經檢測具有冰核活性菌株。

1.1.2 培養基。KB培養基配方見文獻[2]；PSA培養基配方見文獻[18]。

1.2 方法

1.2.1 拮抗菌分離。

1.2.1.1 取樣。選擇高海拔地區莆田仙游縣（660 m）、福州晉安區（550、400 m），中海拔地區莆田荔城區（250 m）、莆田城廂區（350 m），低海拔地區莆田涵江區（50、100 m）、福州鼓樓區（10 m）、浙江德清縣（100 m）霜凍害發生頻繁的枇杷產區，在枇杷不同部位及根圍土壤中取樣。

1.2.1.2 樣品處理。取1.0 g根圍土或1.0 g新鮮葉片或葉芽磨碎加入9.0 ml無菌水于三角瓶中，振蕩10 min，稀釋至梯度濃度為1×10-5、1×10-6、1×10-7 g/ml，分別取0.1 ml各濃度稀釋液均勻涂抹于PSA培養基上，在22 ℃下培養36 h，挑選所有不同特征菌落，點接于混有INA細菌L4的KB平板上。測定抑菌圈半徑，3次重復。

1.2.2 抑菌圈測定。

取0.2 ml 3.0×108cfu/ml INA細菌L4菌液放入培養皿內，對孫福在等的抑菌圈法進行改進[19]，測量抑菌圈、菌落、抑菌帶半徑，觀察透明度等，重復3次。

1.2.3 殺滅INA細菌能力測定。

復篩的9個菌株分別在PSA斜面培養基上28 ℃培養36 h，INAL4細菌在KB斜面培養基上22 ℃培養36 h，備用。將培養好的拮抗菌和INA細菌配成濃度均為3.0×108cfu/ml的菌液，各取5.0 ml菌液配制成混合液。將混合液放入4 ℃冰箱中[5]，5 h后各取1.0 ml混合液按照1∶1×105、1∶1×106、1∶1×107的比例稀釋，各取0.2 ml稀釋液于KB培養基上培養，并設INA細菌原液為對照，重復3皿，在22 ℃下培養3 d，觀察記錄冰核細菌的菌落數量。處理完畢后，立即放入4 ℃冰箱中24 h，再測定冰核細菌的菌落數量。

1.2.4 破壞冰核蛋白能力測定。

采用Lindow等改進的小液滴凍結法測定冰核活性[8]。配制混合液方法同“1.2.3”。用微量加樣器吸取0.2 ml細菌懸浮液，滴加到-5.0 ℃的測試表面上，每滴0.1 ml，每種菌液滴10滴，重復2次。以無菌水和INA細菌L4 3.0×108 cfu/ml作對照。用低溫恒溫槽測定凍滴數。在2 min內記下凍滴數，換算成凍滴率和破壞率。探針驗證小液滴是否凍結以第1次結果為準。

凍滴率=凍結個數/試驗總個數×100%

破壞率=不凍結個數/試驗總個數×100%

2 結果與分析

2.1 分離到的菌株對INA細菌的抑菌能力測定

從9個不同地區和海拔的枇杷根際土樣、枇杷不同部位上分離純化128個菌株。發現55個菌株對INA有抑菌效果。對INA細菌有抑菌效果的55個菌株中，抑菌圈半徑大于10 cm的有15株，占11.7%；抑菌圈半徑大于5 cm且小于10 cm的有22株，占17.2%；抑菌圈半徑大于0且小于5 cm的有18株，占14.0%。沒有拮抗作用的菌株有73株，占57.0%。拮抗菌株獲得率為43.0%。具拮抗能力的55個菌株中，強菌株占27.3%，中強菌株占40.0%，弱菌株占32.7%。根據拮抗菌抑菌圈半徑大、增殖速度快、抑菌帶清晰程度等特點要求，最終確定了9個菌株作為復篩試驗對象，分別為BL36、BL27、BL33、BL30、BL43、BL28、BL31、BL35和BL38。

2.2 拮抗菌對INA細菌抑菌作用比較

INA細菌與抑菌帶接觸的菌落邊緣厚，而對照INA細菌生長正常，菌落鋪展整個平板，說明這些拮抗菌產生的拮抗物質對INA菌落的擴展均具有較強的抑制作用。由表2可知，BL36拮抗系數達1.28，抑菌圈半徑為27.2 mm，抑菌帶寬度為6.0 mm，表現都是最佳，抑菌效果好于其他8個拮抗菌，達到極顯著水平。BL43、BL35等6個拮抗菌的拮抗系數沒有差異，但抑菌圈半徑、抑菌圈寬度、拮抗菌半徑之間差異大，無法直接進行利用。

2.3 不同拮抗菌對枇杷INA細菌的殺菌作用

9個拮抗菌與枇杷INA細菌L4按照1∶1的比例混合后，在4 ℃冰箱中處理5 h后，BL33對INA細菌的殺菌率達到98.5%，BL36的殺菌率達到98.0%，殺菌效果較好。處理24 h后，BL33、BL36的殺菌率達100%；拮抗菌BL36、BL33的殺菌效果好于其他7個拮抗菌，差異達到極顯著水平。由表2和表3綜合分析得出：第一，INA拮抗菌對INA細菌的殺菌作用與產生的抑菌圈大小無關。如菌株BL27等，抑菌圈較大但對INA細菌的殺菌作用與其他的拮抗菌比較卻相對較弱。第二，BL38、BL28等4個拮抗菌的殺菌效果隨著時間的延長，殺菌率反而下降，該4個菌株的殺菌有效期短。其三，除了BL33、BL36的殺菌率達100%外，其他7個拮抗菌殺菌都不徹底，不能直接應用。綜上所述，拮抗菌BL36、BL33是殺滅冰核活性細菌良好的生物防治菌株。

2.4 不同拮抗菌破壞枇杷INA細菌冰核活性結果

對放置5和24 h的混合液于-5 ℃下測定凍滴率。由表4可知，處理5 h后，9個拮抗菌菌株與INA細菌的混合液都有不同程度的凍結現象，其中，BL36的凍滴率為20%，破壞率為80%，效果最佳；BL33、BL38 等4個菌株的凍滴率為40%，破壞率為60%；拮抗菌的破壞率達50%以上。24 h后，BL36、BL33的凍滴率均為10%，破壞率為90%；BL36、BL33等3個拮抗菌對冰核蛋白的破壞率隨著時間的延長而提高。BL31、BL35破壞冰核蛋白能力均隨著時間的延長而有所下降。綜上所述，BL36在5和24 h的破壞能力都是最好的。

3 結論與討論

針對誘發枇杷霜凍害的冰核細菌，從枇杷根際土壤分離到55個拮抗菌，說明自然界普遍存在著INA細菌拮抗菌。根據增殖速度快、抑菌帶寬且清晰程度高的拮抗菌株篩選要求，選出BL36、BL33、BL27等9個強拮抗菌菌株。對INA細菌殺菌能力測定發現處理5和24 h后，BL36的殺菌能力較好且穩定；用VaLi法測定破壞冰核蛋白能力發現BL36在5和24 h破壞冰核活性能力都是最好， BL33次之。拮抗菌BL36在爭奪生存空間和營養、殺滅冰核活性細菌、降低冰核蛋白數量3個方面綜合效果最佳。

拮抗菌對INA細菌主要通過爭奪生存空間和營養來抑制冰核細菌的數量，相應降低冰蛋白的數量來達到抑菌防御霜凍的目的，由于生防菌增殖和擴展要有一個過程，因此在實際生產中，應與藥劑復配使用，才能更好地防除冰核細菌，減輕枇杷霜凍害。

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