枸杞中黃酮類化合物提取與分離純化工藝的研究進展

于惠 康磊等??

摘要 近幾年，隨著枸杞的化學成分和藥理作用的廣泛研究，枸杞總黃酮因具明顯的抗氧化、清除自由基、提高免疫力等活性而逐漸成為研究熱點，因此人們采用多種方法對枸杞黃酮進行提取分離。在此從枸杞黃酮的提取和分離提純兩方面進行總結，為今后的分離提純提供參考依據。

關鍵詞 枸杞；黃酮；提取；分離純化；研究進展

中圖分類號 S567；TS225.1 文獻標識碼

A 文章編號 0517-6611（2015）05-062-03

Research Progress of Separation and Extraction Flavones in Lycium barbarum

YU Hui1， 2， KANG Lei1， 2， ZHANG Rui1， 2 et al （1. State Key Testing Laboratory of Coal Chemical， Yinchuan， Ningxia 750002； 2. Chemical Laboratory Center of Ningxia Baota， Yinchuan， Ningxia 750002）

Abstract In recent years， the chemical composition and pharmacological function of Lycium barbarum has been extensively studied， the total flavones in Lycium barbarum has been gradually become a hot topic because of significant antioxidation， removal of the free radicals， enhancing immunity and other activities. Thus， many researchers used variety methods to separate and extract the total flavones from Lycium barbarum. The separation and extraction of total flavones from Lycium barbarum were summarized， providing a reference for separation and purification in future.

Key words Lycium barbarum； Flavones； Extraction； Separation and purification； Research progress

基金項目 寧夏自然科學基金項目（NZ13255）。

作者簡介 于惠（1986-），女，遼寧凌源人，工程師，碩士，從事分離型功能高分子材料研究。

收稿日期 20141226

枸杞 （Lycium Barbarum）為茄科枸杞屬，多年生落葉小灌木植物，是我國傳統的藥食兩用同源植物之一[1]。枸杞的藥用部位較多，明朝李時珍《本草綱目》記載：“春采枸杞葉，名天精草；夏采花，名長生草；秋采子，名枸杞子；冬采根，名地骨皮”。枸杞子為枸杞的成熟干燥果實，其活性成分主要包括色素類、多糖類、黃酮類化合物、多種氨基酸、維生素及微量元素[2]。枸杞子具有滋補肝腎、益精明目之功效，現代臨床上廣泛用于調節免疫功能[3]、抗氧化[4]、抗輻射[5]、抗腫瘤[6]、清除自由基[7]、促進益生菌細胞生長及抗衰老[8]等。枸杞葉，又名天精草，為茄科植物枸杞或寧夏枸杞的嫩莖葉，功能補肝益腎、生津止渴、虛勞發熱。枸杞葉中的活性成分與枸杞子類似，其蛋白質含量極其豐富，另外據報道枸杞葉中含有豐富的有機鍺，具有增強免疫力、延緩衰老的功效[9]。枸杞根皮，又稱為地骨皮，為茄科、枸杞屬植物枸杞的根皮，可入藥，具有清熱、涼血、降壓、清肺降火等功效。我國枸杞有7個種3個變種，其中以寧夏地區生產的寧夏枸杞 （Lycium Barbarum L.） 最為著名[10]，青海、甘肅等地的枸杞品質也很高。近幾年，枸杞的化學成分和藥理作用被廣泛的研究，作為枸杞中重要的活性物質之一，枸杞總黃酮因具明顯的抗氧化、清除自由基、降血脂、降血糖、治療心腦血管疾病、抗腫瘤、抗衰老、提高免疫力等活性而逐漸成為研究熱點[11-12]。

枸杞中黃酮類化合物的提純，主要包括以下兩方面：一方面是提取，基于植物不同部位所含黃酮類化合物的結合狀態不同，如在花、果、葉中以甙為主要存在形式，在木質部分以甙元為主要存在形式，需要根據被提取物的類型和理化性質選擇合適的提取溶劑和提取方法；另一方面是分離純化，目的是盡可能充分將黃酮類化合物與其他成分分開，并進一步分離得到黃酮類成分單體。筆者在此對近年來枸杞中黃酮類化合物的提取與分離純化工藝的研究進展進行了系統總結。

1 提取方法

1.1 有機溶劑提取法

有機溶劑提取法是國內外使用最為廣泛的一種提取方法，主要以乙醇、甲醇、石油醚等有機溶劑作為提取溶劑，在索氏提取器中進行抽提。通常采用乙醇作為提取溶劑，提取的過程中，乙醇的濃度對黃酮類化合物的提取存在影響。高濃度的醇（90%～95%）適用于提取黃酮甙元類化合物，而低濃度的醇（60%～70%）更適合提取黃酮甙類化合物[13]。該方法操作簡單、成本低，易于大規模生產，但工藝繁瑣，雜質含量也較高，回收率低。李銘芳等采用70%的乙醇為溶劑回流提取寧夏枸杞中的總黃酮，通過正交試驗，研究發現最優提取條件為提取溫度70 ℃、提取時間2.0 h、固液比為1∶20[14]。劉蘭英等以70%乙醇對枸杞葉進行回流提取，并通過正交試驗確定了提取工藝條件為70%乙醇、料液比1∶8、提取時間3 h、提取3～8 nm碎粒，黃酮得率為3.72%[15]。

1.2 超聲輔助提取法

超聲波的作用機理是在被提取樣品和溶劑之間產生聲波空化效應[16]，破壞植物細胞并加速溶劑分子之間的運動，使植物細胞中的有效成分較易溶解于溶劑中，加速了植物有效成分的浸出提取。另一方面，超聲提取過程中的空化作用還會增大樣品與提取溶劑之間的接觸面積，從而提高植物中活性成分從固相轉移到液相的傳質速率[17]。因此，對植物有效成分采用超聲提取，可以在很大程度上加快提取速度，縮短了提取時間，進而提高了天然產物中活性成分的提取速率和提取量。該方法節省提取時間、提高提取效率、試驗設備簡單、操作方便，在工業生產中具有較為廣闊的應用前景。王漢卿等通過正交試驗優選出超聲輔助提取枸杞葉總黃酮的最佳工藝條件為乙醇體積分數 65%、乙醇用量 1∶60、超聲提取時間 35 min、超聲溫度 70 ℃；利用優選出的最佳超聲提取工藝測定比較不同采收期枸杞葉中的總黃酮含量，結果為5月中旬含量最高[18]。孫化鵬等通過正交試驗法優選出超聲輔助提取枸杞葉總黃酮的最佳工藝條件為乙醇濃度75%、乙醇用量1∶40、超聲提取時間30 min、超聲提取溫度50 ℃[19]。

1.3 微波輔助萃取法

微波萃取又稱微波輔助萃取（Miacrowaveassisted extraction，MAE），是利用微波的熱效應對樣品及其有機溶劑進行加熱，從而將目標組分從樣品基體中分離出來的一種新型高效分離技術。微波萃取過程是高頻電磁波穿透萃取介質到達物料內部，微波能轉化為熱能，物料內部的溫度迅速上升，使物料內部的壓力超過細胞壁膨脹所能承受的壓力，導致細胞膨脹破裂，從而促使有效成分自由流出，并溶解于萃取介質中[20]。微波加熱不同于傳統的加熱模式，即熱量由外向內傳遞，而是直接作用于內部和外部的介質分子，使整個物料同時被加熱，即“體加熱過程”，從而可克服傳統的傳導式加熱方式所存在的升溫較慢的缺陷。同時，微波所產生的電磁場可加速被萃取組分的分子由固體內部向固液界面擴散的速率，從而使萃取速率提高數倍，并能降低萃取溫度，最大限度地保證萃取物的質量[21]。

與其他的提取方法相比較，微波輔助萃取具有如下優點：①選擇性好。由于樣品中各組分對微波的吸收能力存在差異，從而導致其溫度不同，致使各組分從基體中分離的速度也存在差異。因此，微波萃取能對萃取體系中的不同組分進行選擇性加熱，可以使目標組分直接從基體中分離。②熱效率較高。微波加熱是內外同時加熱的模式，由微波能量直接轉化為熱能，沒有熱傳遞造成的溫度梯度和熱量損失，因而加熱均勻，熱效率較高。③質量穩定。可以在較低的溫度下完成萃取，有效地保護了被提取物的有效成分。④操作簡單。微波萃取無需干燥等預處理，簡化了工藝，減少了投資。

巨敏等以枸杞為原料，用乙醇作為提取劑，采用微波提取法對枸杞中總黃酮進行提取，以二次同歸正交試驗設計對結果進行優化分析，得出的最佳條件為乙醇濃度68.3%、微波時間100 s、微波溫度73 ℃、微波功率300 W、液料比14.7∶1.0（ml/g），在最佳條件下，總黃酮的提取率為19.52 mg/g[22]。孫波等以蘆丁為對照品，采用單因素試驗和正交試驗時影響枸杞總黃酮提取率的因素進行了考察，并優選出最佳提取工藝為乙醇濃度70%、料液比1∶30（g/ml）、微波輻射功率400 W、溫度120 ℃、提取時間8 min，在此條件下枸杞總黃酮的含量為18.3 mg/g[23]。

1.4 磁場強化萃取法

磁場強化萃取是一種借助外加磁場以強化化工分離過程的新技術，被稱為“綠色分離技術”，它可以利用磁場產生的特殊能量來改變抗磁性物質的微觀結構，使其理化性質發生變化[24]，同時通過影響反應速率來起到強化萃取的作用。周蕓等以新鮮枸杞為原料，采用磁場強化萃取法提取枸杞黃酮，通過正交試驗，得出優化磁場處理的最佳條件為：在磁感應強度 640 mT、磁化時間 40 min、磁化溫度 65 ℃、浸提回流時間 60 min 的條件下，枸杞黃酮的提取率可達290.81 mg/100g[25]。李冰等發明一種利用磁性吸附樹脂及外加磁場分離純化葛根黃酮的方法，具體的工藝流程如圖1所示。首先，將葛根粉碎置于微波萃取罐中，加入95%乙醇，微波萃取除去雜質后得葛根黃酮提取液；其次，將磁性吸附樹脂裝入樹脂柱，置于可調磁場中，將葛根黃酮提取液流過樹脂柱，收集解吸液，濃縮干燥后得葛根黃酮產品[26]。

1.5 高壓均質提取法

高壓均質提取法是指利用柱塞泵將被分離物保持在一定的壓力條件下，液料高速流過一個狹窄的縫隙時而受到強大的剪切力，同時還有液料與金屬環接觸產生的碰撞力以及由于靜壓驟降和驟升而產生的孔爆發力等綜合力的作用，使原料中不透明、粒徑較大的懸濁液轉化成穩定細小的懸濁液的過程[13]。高壓均質提取法可以將樣品中的組成結構破粹到納米級，利于目標成分的溶出，大大提高了樣品的提取率。同時，操作時溫度較低，因此對樣品的破壞力較小，可以保持樣品原有的性質。因此，該方法將在天然活性成分的提取方面展現越來越重要的作用[27]。

劉增根等考察了高壓均質提取柴達木枸杞葉有效成分的最佳工藝及對有效成分進行了純化，發現高壓均質提取柴達木枸杞葉總黃酮的最佳工藝條件為乙醇體積分數 80%、料液比 1∶10、均質壓力 60 MPa、提取時間 30 min，在該條件下，提取物中蘆丁質量分數為 10.53%，總黃酮質量分數為32.61%[28]。

2 分離純化方法

2.1 大孔吸附樹脂吸附分離法

大孔吸附樹脂（Macroporous Adsorption Resin，MAR）是由功能單體、交聯劑等可聚合成分與致孔劑、分散劑等添加劑經懸浮或反相懸浮聚合制備而成的一類球狀的多孔高分子吸附分離材料，其內部存在大大小小、形狀各異、相互貫通的孔穴，即使在干燥狀態下，其內部均具有較高的孔隙率，且存在大孔結構（一般在100～1 000 nm）。MAR不同于離子交換樹脂，其本身不含可交換性功能基，它的吸附性主要依靠范德華力（包含色散力、定向力和誘導力等）和氫鍵的作用，同時，網狀結構和很高的比表面積又賦予其良好的吸附性能和篩分性能，因此，MAR是一類不同于離子交換樹脂的、集吸附和篩分性能為一體的分離型功能高分子材料。目前，國內外MAR的生產廠家主要有美國RohmHass、日本三菱化成公司、天津南開大學化工廠、華北制藥廠樹脂分廠、西安藍曉科技有限公司、西安藍深特種樹脂有限公司、滄州寶恩化工有限公司、天津海光化工有限公司等，部分廠家產品的性能如表1～3所示[29-30]。

目前，MAR主用于皂苷類、黃酮及其苷類、蒽醌及其苷類、酚酸類、色素類及生物堿類等的分離純化。利用MAR分離純化中草藥中的有效成分，有以下幾點優勢：首先，由于MAR獨特的吸附性和篩分性，利用MAR分離純化了多種單味中草藥的有效成分，這為其他中草藥的提取研究奠定了基礎；其次，不斷有新的MAR問世，這為中草藥有效成分的分離富集提供了可供選擇的保障。

胡曉蓮等通過優選MAR，并考察其工藝參數，篩選合適的吸附樹脂DA201，最佳的工藝條件為上樣量10柱床體積（BV）、上樣液濃度15 mg/ml、上樣液流速1 BV/h，上樣液pH=3，解吸洗脫劑乙醇濃度為40%、乙醇用量8 BV，富集純化總黃酮得率75.85%，總黃酮純度35.70%[31]。何彥峰等通過比較11種MAR的靜態吸附解吸性能，篩選出適合純化柴達木枸杞總黃酮的樹脂類型HPD400；并進行動態吸附解吸試驗，利用單因素和響應面法優化MAR純化柴達木枸杞總黃酮，得到的的最佳工藝條為：以16.0 ml pH為4.0的柴達木枸杞總黃酮粗提液上柱，流速1.0 ml/min，充分吸附后用3 BV去離子水洗柱，然后用23.0 ml 80%乙醇溶液以流速1.0 ml/min進行解吸，枸杞黃酮的平均回收率為89.92%，含量為27.62%，約為純化前總黃酮含量的5倍左右[32]。

2.2 高效液相色譜法（HPLC）

高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）又稱“高壓液相色譜”，以液體為流動相，采用高壓輸液系統，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內各成分被分離后，進入檢測器進行檢測，從而實現對試樣的分析。HPLC具有高壓、高效、高速、高靈敏度及應用范圍廣的特點。

董靜洲等對寧夏枸杞果實黃酮提取液進行色譜柱分離，檢測波長為259 nm，流動相 A為1.0%乙酸，流動相 B為甲醇，流速為1.0 ml/min；并對我國寧夏枸杞六大產區的枸杞果實總黃酮提取液進行了 HPLC 分離和 HPLC 指紋圖譜比較[33]。張自萍等以10個寧夏不同產地的寧夏枸杞主栽品種“寧杞I號”樣品建立枸杞黃酮類化合物指紋圖譜共有模式，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”軟件進行數據處理，對15個不同來源的枸杞樣品進行了分析[34]。

安徽農業科學 2015年

3 展望

近幾年，隨著人們對枸杞黃酮的化學成分和藥理作用不斷深入研究，使枸杞黃酮愈來愈受到人們的重視。因此，通過不斷地探索枸杞黃酮提取和分離純化工藝研究的新方法，仍將是提純枸杞黃酮的熱點研究方向。

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責任編輯 黃小燕 責任校對 況玲玲