mir－181c抑制神經母細胞瘤的作用機制研究

李 勇 王莉華

鄭州大學附屬鄭州中心醫院 鄭州 450007

50%的神經母細胞瘤（neuroblastoma，NB）發生在2 歲以內的嬰幼兒。NB預后差別很大，有廣泛的腫瘤異質性［1］。低危組NB患者（嬰幼兒）臨床觀察或手術可以取得良好療效；高危組NB患者即使綜合治療預后仍不佳。NB 屬于神經內分泌性腫瘤，超過50%的神經母細胞瘤病人發生轉移，尤其骨轉移嚴重威脅兒童的健康［2］。盡管有許多因素與NB發病機制相關［3］，但對關鍵分子機制和NB終末期決定因素尚未清楚。因此，識別新介質對NB 發病機制非常重要。本課題擬對mir－181c在NB中的調控機制進行探討。

1 實驗步驟

1.1 組織樣本和細胞系 12個NB組織從鄭州大學附屬鄭州中心醫院神經外科獲得。經組織病理學檢查確認，并存儲在－80液態氮。人類NB細胞系SK－N－SH 和SH－SY5Y 培養在（Eagle＇s Minimum Essential Medium EMEM Gibco），用10%胎牛血清緩沖，補充100 U／mL 青霉素／鏈霉素（PEST）。所有細胞都保存在5%CO237 ℃濕潤孵化器。

1.2 寡核苷酸合成和細胞轉染 MiR－181c模塊，miR－181c反義寡核苷酸（AOS），模塊（mimics－ctrl），ASO 控件（ASOctrl），購買于上海基因制造公司。使用Lipofectamine TM 2 000細胞轉染試劑（英杰公司）進行細胞轉染。

1.3 RNA 的提取和實時定量PCR 根據制造商的說明方案，使用Trizol提取總的RNA。使用NanDrop ND－1000分光光度計來測定RNA 的濃度和質量。然后使用1μg 的RNA 進行逆轉錄。對于miRNA 的逆轉錄反應，使用特定的miR－181cRT 引物，然后用于總RNA 的逆轉錄，Oligo（dT）作為一個通用的引物，使用SYBR GreenPCR 混合物進行實時定量PCR。條件如下：95℃5min，隨后40個循環的95℃30s，57 ℃30s，72 ℃30s。RNU6B（U6 小 核 乙 非 編 碼RNA）作為miR－181c正常表達的所有使用的引物如下：miR－181c RT primer：5’CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACTCACCG 3’；U6 RT primer：5’CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG AAAATATGGAAC3’；miR－181cforward primer：5’ACACTCCAGCTGGGAACATTCAACCTG 3’；U6 forward primer：5’ACACTCCAGCTGGGGTGCTCGCTTCGGCAGCACA 3’；Reverse primer：5’TGGTGTCGTGGAGTCG 3’。

1.4 腫瘤細胞存活實驗（MTT） 鋪96孔板，4 000個／每孔轉染細胞。轉染48h 后，用MTT 培養4h。加入DMSO 100μL，解除MTT 并將細胞放置搖晃10min。用分光光度計測定吸光值A（波長570nm）。細胞增殖率（%）＝ATest／AControl×100%。

1.5 集落形成試驗（克隆實驗） 將轉染的細胞接種到12孔板中，密度為200個細胞／孔。將培養液每3d更換1次，孵育10～14d。當大多數克隆含超過50個細胞時，終止孵育。用1×PBS洗脫克隆，冷甲醇固定克隆細胞，結晶紫染色約5min。將克隆進行拍照并計數。集落形成率＝克隆數／接種細胞數×100%。

1.6 Transwell小室遷移試驗和侵襲試驗 無血清培養基培養24h，消化細胞并離心收集細胞，細胞懸液（細胞密度2.5×104）250μL加入Transwell上室，腔室底部則加入750 μL的含10%～20%血清的培養液。20h后取出Transwell小室，使用棉簽輕輕擦拭小室上層細胞，使用4%多聚甲醛固定Transwell小室。取出固定好的小室，使用自來水沖洗小室，結晶紫染色15 min沖洗。將染好色的小室經梯度酒精脫水，風干后取下膜層，用中性樹脂封片，顯微鏡下計數即可。

1.7 統計學分析 運用SPSS 13.0統計學軟件，所有數據采用ˉx±s表示，2組間比較采用雙樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Mir－181c抑制NB組織轉移 如圖1示，mir－181c的表達水平在轉移NB組織中表達降低，與原發NB組織中表達水平形成顯明對比，表明mir－181c與腫瘤生成有關。

圖1 定量RT－PCR分析Mir－181c表達率，＊P＜0.05

圖2 mir－181c抑制SK－N－SH 細胞

2.2 mir－181c抑制SK－N－SH 細胞擴散 經RT－PCR 驗證了2個細胞系，mir－181c模塊或mir－181cASO 轉染的SK－NSH 細胞。MTT 分析 顯 示，mir－181c可 降 低SK－N－SH 細 胞的活力約20%，而抑制了mir－181c細胞生存能力提高約25%。mir－181c對SH－SY5Y 細胞也有相似的作用。從克隆形成實驗我們發現mir－181c的超表達減少SK－N－SH 克隆細胞約50%，而抑制mir－181c表達可導致相反的影響。表明mir－181c可能在腫瘤的生長起重要作用。見圖2。

2.3 mir－181c抑制SK－N－SH 和SH－SY5Y 細胞的遷移和入侵 為確定mir－181c是否與腫瘤轉移相關，我們采用Transwell檢測了mir－181c影響細胞遷移和入侵作用。發現mir－181c超表達減少了遷移和入侵SK－N－SH 細胞數量分別為約40%和50%，而抑制mir－181c起相反效果。圖3 顯示mir－181c超表達減少了遷移和入侵SH－SY5Y 細胞的數量。表明mir－181c參與了NB的遷移。

圖3 mir－181c抑 制SK－N－SH 和SH－SY5Y 細 胞 的 遷移和入侵

3 討論

研究表明miRNA 參與多種生物過程，包括細胞的分化、增殖和凋亡［4－5］。超過50%的miRNA 擁有與癌基因相結合的脆裂點［6］，到目前為止發現60%的蛋白編碼基因受miRNA 的調控［7－8］。研 究 表 明，miRNA 扮 演2 個 角 色（致 癌 基因／抑癌基因），如mir－490－3p作為一個致癌因子促進細胞增殖、遷移和入侵，而且還會靶向作用于ERGIC3導致肝細胞肝癌的上皮間葉細胞轉化（EMT）［9］。mir－125b抑制乳腺癌細胞增殖和轉移特征通過靶向下調致癌基因ETS1完成［10］。

許多關于miRNA 對NB 組織下調機制的研究報道，但關 于miRNA 對NB 組 織 上 調 機 制 研 究 仍 很 少［11－12］。mir－335通 過調節TGF－β信 號 通 路 抑 制NB 細 胞 入 侵［13］，mir－9通過靶向作用于MMP－14抑制NB 細胞的入侵和遷移［14］。mir－15a通過mir－15a／RECK／MMP－9 軸 促 進NB 細 胞 的 遷移和生長［15］。研究人員在miRNA 對NB 組織的分析過程中發現對神經系統及免疫機制有抑制作用［7］。

NB是兒童常見的實質性惡性腫瘤，可表現為預后多樣性，NB病因尚不清楚。研究人員進行了堿基配對改變和重排后與NB有關聯基因中發現了癌癥特異性基因突變，其中ARID1A 和ARID1B基因突變與患兒病死率有關，而且還發現N－myc基因的擴增突變在NB 中常見，呈雙向擴增，發現此擴增方式與腫瘤的擴散相關。研究發現，一些蛋白酶與NB發病有關，在腫瘤生物進程中起重要作用。在鼠體內模型中檢測54個與NB有關的miRNA，發現35個上調，下調19個，部分miRNA 在原發NB 和轉移NB 中的表達有明顯差異，說明這些表達有差異的基因在NB轉移中起重要的作用，還發現NB中基質金屬蛋白酶14（MMP－14）與腫瘤病理特性及預后生存率密切相關。

MiR－181家族里6個基因，這些miRNAs均由3個獨立的染色體編碼，并產生4個成熟的miRNA。研究表明，miR－181s在肝細胞肝癌中超表達并參與細胞分化［16］。在肝細胞肝癌中，TGF－β（轉化生長因子－β）可通過抑制TIMP3 上調miR－181b，從而促進細胞增殖、遷移和入侵［17］。Mir－181c通過下調BMPR2 而與室中隔缺損有關［18］。胃癌中高表達mir－181c與淋巴結轉移和預后有關，表明mir－181c可能是致癌基因［19］。Fanconi貧血中mir－181c具有促進TNF－α克隆潛能作用［20］，表明miR－181家族在包括癌癥的很多疾病的發生中起促進作用。

本實驗用mir－181c－mmics和AOS－mir－181c轉染NB 細胞，MTT 分析顯示mir－181c降低細胞活力約20%，colony實驗示減少NB細胞克隆約50%，2組間抑制細胞生長率有明顯差異，說明mir－181c對NB細胞有抑制作用（圖2）。本實驗結果表明mir－181c在NB細胞中的新型調控機制，證明mir－181c可能在NB發病機制中起重要作用。相比之下，本研究組織標本中RT－PCR 結果顯示，mir－181c在轉移NB組織中的表達率明顯低于原發NB組織，初步肯定mir－181c與NB轉移有關。體外細胞實驗發現轉染mir－181c－mmic可抑制NB細胞的遷移和侵襲分別約40%和50%（圖3），確定本實驗中mir－181c是抑癌基因。

［1］ Sharp SE，Gelfand MJ，Shulkin BL.Pediatrics：diagnosis of neuroblastoma［J］.Semin Nucl Med，2011，41（5）：345－353.

［2］ Qiao J，Lee S，Paul P，et al.Akt2regulates metastatic potential in neuroblastoma［J］.PloS One，2013，8（2）：e56 382.

［3］ Brodeur GM，Seeger RC，Schwab M，et al.Amplification of N－myc in untreated human neuroblastomas correlates with advanced disease stage［J］.Science，1984，224（4653）：1 121－1 124.

［4］ Ambros V.The functions of animal miRNAs［J］.Nature，2004，431（7006）：350－355.

［5］ Calin GA，Sevignani C，Dumitru CD，et al.Human microRNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2004，101（9）：2 999－3 004.

［6］ Friedman RC，Farh KK，Burge CB，et al.Most mammalian mRNAs are conserved targets of miRNAs［J］.Genome Res，2009，19（1）：92－105.

［7］ Xu N，Zhang L，Meisgen F，et al.MiRNA－125bdown－regulates matrix metallopeptidase 13and inhibits cutaneous squamous cell carcinoma cell proliferation，migration，and invasion［J］.J Biol Chem，2012，287（35）：29 899－29 908.

［8］ Zhang LY，Liu M，Li X，et al.MiR－490－3p modulates cell growth and epithelial to mesenchymal transition of hepatocellular carcinoma cells by targeting endoplasmic reticulum－Golgi intermediate compartment protein 3＊（ERGIC3）［J］.J Biol Chem，2013，288（6）：4 035－4 047.

［9］ Zhang Y，Yan LX，Wu QN，et al.miR－125bis methylated and functions as a tumor suppressor by regulating the ETS1 proto－oncogene in human invasive breast cancer［J］.Cancer Res，2011，71（10）：3 552－3 562.

［10］ Guo J，Dong Q，Fang Z，et al.Identification of miRNAs that are associated with tumor metastasis in neuroblastoma［J］.Cancer Biol Ther，2010，9（6）：446－452.

［11］ Terrile M，Bryan K，Vaughan L，et al.miRNA expression profiling of the murine TH－MYCN 10neuroblastoma model reveals similarities with human tumors and identifies novel candidate miRNAs［J］.PloS One，2011，6（12）：e28356.

［12］ Lynch J，Fay J，Meehan M，et al.MiRNA－335suppresses neuroblastoma cell invasiveness by direct targeting of multiple genes from the non－canonical TGF－beta signalling pathway［J］.Carcinogenesis，2012，33（5）：976－985.

［13］ Zhang H，Qi M，Li S，et al.miRNA－9targets matrix metalloproteinase 14to inhibit invasion，metastasis，and angiogenesis of neuroblastoma cells［J］.Mol Cancer Ther，2012，11（7）：1 454－1 466.

［14］ Chio CC，Lin JW，Cheng HA，et al.MiRNA－210targets antiapoptotic Bcl－2expression and mediates hypoxia－induced apoptosis of neuroblastoma cells［J］.Arch Toxicol，2013，87（3）：459－468.

［15］ Xin C，Buhe B，Hongting L，et al.MiRNA－15apromotes neuroblastoma migration by targeting reversion inducing cysteine－rich protein with Kazal motifs（RECK）and regulating matrix metalloproteinase－9expression［J］.FEBS J，2013，280（3）：855－866.

［16］ Ji J，Yamashita T，Budhu A，et al.Identification of miRNA－181by genome－wide screening as a critical player in EpCAMpositive hepatic cancer stem cells［J］.Hepatology，2009，50（2）：472－480.

［17］ Wang B，Hsu SH，Majumder S，et al.TGFbeta－mediated upregulation of hepatic miR－181b promotes hepatocarcinogenesis by targeting TIMP3［J］.Oncogene，2010，29（12）：1 787－1 797.

［18］ Li J，Cao Y，Ma XJ，et al.Roles of miR－1－1and mir－181cin ventricular septal defects［J］.Int J Cardiol，2013，168（2）：1 441－1 446.

［19］ Cui M，Yue L，Fu Y，et al.Association of MiRNA－181cExpression with the Progression and Prognosis of Human Gastric Carcinoma［J］.Hepatogastroenterology，2013，60（125）：961－964.

［20］ Rio P，Agirre X，Garate L，et al.Down－regulated expression of hsa－mir－181cin Fanconi anemia patients：implications in TNFalpha regulation and proliferation of hematopoietic progenitor cells［J］.Blood，2012，119（13）：3 042－3 049.