新烷化劑替莫唑胺酯對膠質瘤細胞生長的影響

郭珊珊，朱仲玲，徐 輝，丁鳳霞，王國成，趙 敏，閻 昭

（1.天津醫科大學腫瘤醫院腫瘤研究所，國家藥物臨床試驗機構，國家腫瘤臨床醫學研究中心，天津市“腫瘤防治”重點實驗室，天津 300060；2.天津天士力集團研究院，天津 300402）

多形性腦膠質瘤（GBM）是惡性程度最高的原發性腦腫瘤[1]。目前，術后替莫唑胺（TMZ）聯合放療是治療GBM的標準方案。盡管如此，惡性腦膠質瘤患者的平均存活時間僅為15個月[2]。TMZ耐藥是造成膠質瘤患者治療效果不佳的主要原因。TMZ主要攻擊細胞DNA，造成DNA烷基化損傷，進而形成DNA交聯，導致細胞死亡[3]。在眾多DNA烷基化損傷中，以O6-甲基鳥嘌呤（O6-mG）的損傷威脅最大，是引起細胞致死的重要原因[4]。機體對O6-mG的修復主要依賴O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶（MGMT），此酶將甲基從DNA的O6位轉移到自身半胱氨酸殘基上，使DNA鏈上的鳥嘌呤損傷修復，同時MGMT不可逆地失活，是一種“自殺式”、可消耗酶[5-6]。臨床研究一些MGMT抑制劑作為TMZ輔助化療藥物，如O6-BG，但是，臨床試驗發現，O6-BG具有神經毒性[7]。所以，設計既有TMZ活性作用，又能夠消耗MGMT蛋白的藥物具有重要的臨床意義。TMZ-HE是在TMZ結構基礎上改造而來，保留原有藥物的作用基團，其目的為在保留原有藥物的作用結構基礎上，增加藥物的脂溶性，使藥物進入腫瘤內部的濃度增加。起初，TMZ-HE作為治療皮膚癌而設計的前體藥，能夠抑制裸鼠異種移植的黑色素瘤的生長[8]。膠質瘤細胞LN-18由于自身MGMT表達屬于原發性耐藥細胞系[9-10]，本研究選取LN-18細胞系，旨在探索TMZ-HE體外對腦膠質瘤細胞的增殖抑制及誘導凋亡的作用，同時對MGMT蛋白的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 TMZ、TMZ-HE由天津天士力公司提供，純度>99%。二甲基亞砜（DMSO）溶解配成100 mmol/L貯存液，置－20℃凍存。膠質瘤LN－18細胞購于ATCC，由本實驗室凍存。改良Eagle培養基（Dulbecco’smodified Eagle’smedium，DMEM）胰蛋白酶購自Gibico公司，胎牛血清購自天津灝洋生物制品公司。四甲基偶氮唑藍（MTT）、Hoechst33342熒光試劑盒、細胞凋亡試劑盒均為Sigma公司產品，MGMT抗體為CST公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 LN-18細胞用DMEM（含10%胎牛血清，1%雙抗）培養液培養，置于37℃、5%CO2孵箱中培養，0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 MTT比色法 取對數生長期LN-18細胞，以0.25%胰蛋白酶消化，計數，稀釋成1×104/mL的單細胞懸液，接種至96孔板，過夜貼壁后，加入含TMZ、TMZ-HE 終濃度為 62.5、125、250、500、1 000 μmol/L的培養液作為處理組及濃度為0μmol/L的等量DMSO對照組，每種濃度設4個重復孔，并以空白孔調零。藥物作用24、48、72和96h后，每孔加入20μL 5mg/mLMTT,繼續培養4 h,吸去上清,每孔加150μL DMSO,振蕩10min。490 nm波長處酶標儀檢測吸收值（OD），結果以各組OD均值±標準差表示（實驗重復3次）。

1.2.3 二維克隆法 取對數生長期LN-18細胞，調整細胞密度為200個/mL，以每孔1mL接種于12孔板，待細胞貼壁后，各實驗組加入含藥培養液（25～200μmol/L），陰性對照組分別加入等量的不含藥培養液，每組設2個復孔。每隔3 d換液，2周后取出培養板，甲醇-20℃固定10min,加入結晶紫染色液染色30min。顯微鏡下觀察克隆大小及數量，>50個細胞為克隆，計數。

1.2.4 Hoechst33342/PI熒光染色 取對數生長期LN-18細胞，調整細胞密度為1×106/mL，以每孔1mL接種于24孔板，待細胞貼壁后，加入含TMZ、TMZHE（50～400 mol/L）培養液，作用 96 h 后，棄上清，PBS洗2遍，各孔均加入 Hoechst染料（10 g/mL）、PI染料（1μg/mL）500μL，37℃避光孵育 10min，棄去染料，加入培養液，熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 流式細胞術Annexin V-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡率 TMZ、TMZ-HE（50～400 mol/L）作用LN-18細胞96 h，收集細胞，調整細胞濃度至1×105/mL，各取100μL；加入預冷的結合緩沖液100μL重懸細胞；加入5μLAnnexinV-FITC和PI染液于細胞懸液中,輕輕混勻，避光染色10min；補加200μL結合緩沖液，流式細胞儀檢測凋亡的百分比。

1.2.6 Western blot法檢測MGMT蛋白的表達 收取蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，將等量蛋白（約50μg）在15%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，電轉移至PVDF膜后封閉，4℃孵育MGMT兔抗人單克隆抗體過夜，TBST洗膜3次，兔抗熒光二抗孵育，TBST洗膜3次，熒光掃描儀掃描。

1.3 統計學分析 采用SPSS 13.0統計軟件處理數據，組間分析比較用t檢驗。計量資料以x±s表示，采用方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TMZ-HE對LN-18細胞活力的影響 MTT結果顯示，相同濃度梯度的TMZ、TMZ-HE作用膠質瘤LN-18細胞24～96 h后，兩種藥物均具有增殖抑制作用，且具有濃度和時間依賴性（圖1）。TMZ在24、48、72、96 h 處的 IC50值分別為 （2 448±0.17）、（2 063±0.16）、（1 298±0.08）、（1 020±0.095）μmol/L，TMZ-HE 的 IC50值分別為 （318.2±0.03）、（215.9±0.04）、（204.3±0.04）、（178.3±0.05）μmol/L，作用 96 h TMZ和TMZ-HE的IC50值相差約5.72倍，具有顯著統計學差異（P＜0.001）。以上結果表明，TMZ-HE對膠質瘤細胞LN-18的增殖抑制效果明顯優于TMZ。

圖1 TMZ,TMZ-HE作用LN-18細胞24、48、72、96 h后細胞存活率Fig 1 Survival ratesof the LN-18 glioma cells treated by different concentrationsof TMZ and TMZ-HE for 24,48,72 and 96 h

2.2 TMZ-HE對LN-18細胞克隆形成的影響 克隆結果顯示，TMZ、TMZ-HE對LN-18克隆形成均有抑制作用，隨著藥物濃度增加，克隆形成數量也隨著減少，但TMZ-HE的克隆抑制效果強于TMZ。如圖2所示，TMZ-HE作用LN-18細胞后，克隆數量明顯少于TMZ組，在200μmol/L的TMZ-HE作用下，能夠完全抑制克隆形成，而TMZ僅能抑制40%。

2.3 TMZ-HE誘導LN-18細胞發生凋亡情況TMZ-HE作用LN-18細胞96 h后，細胞凋亡率（包括早期凋亡和晚期凋亡）分別為8.4%、13.5%、14.9%、36.9%，死亡率為2.4%、5.4%、3.1%、6.5%，而TMZ誘導LN-18的凋亡率為7.1%、8.8%、11.5%、28.7%，死亡率為3.3%、2.8%、4.3%、7.3%。其結果表明，TMZ-HE誘導膠質瘤LN-18細胞發生的凋亡高于TMZ，具有濃度依賴性。但是，TMZ和TMZ-HE引起細胞的死亡數量較少，且沒有明顯的濃度依賴性，見圖3。

圖2 不同濃度TMZ,TM Z-HE作用LN-18后克隆形成數量百分比Fig 2 Effectsof graded TMZ and TMZ-HE on LN-18 colony form ation

圖3 TMZ,TMZ-HE作用LN-18細胞96 h后流式細胞儀檢測細胞凋亡率和死亡率Fig 3 Apoptosisand necrosisof LN-18 cellsby flow cytometry after treated with TMZ and TMZ-HE for 96 h

2.4 Hoechst33342/PI熒光染色觀察細胞核形態變化和細胞壞死情況 如圖4A所示，TMZ、TMZ-HE作用LN-18細胞96 h后，熒光顯微鏡下觀察可見細胞核熒光信號增強，同時，隨著濃度增加，細胞核數量不斷減少，但是相同濃度下的TMZ-HE組細胞核數量減少的更多。相同作用條件下，PI染色觀察可見，隨著兩種藥物濃度增加，壞死細胞沒有明顯增加，且熒光信號較少，幾乎沒有壞死，見圖4B。這與筆者流式檢測的結果相符，說明TMZ-HE更多的誘導LN-18細胞發生凋亡，且誘導細胞的凋亡率高于TMZ，其結果具有統計學意義。

圖4 Hoechst33342(A)/PI(B)染色觀察TMZ、TMZ-HE對LN-18細胞核的影響及壞死情況（×10）Fig 4 Hoechst33342(A)/PI(B)stainingwasobserved in TMZ,TMZ-HE effecton LN-18 cellnucleiand necrosis(×10)

2.5 TMZ-HE對LN-18細胞耐藥蛋白MGMT的影響 Western blot結果顯示，兩種藥物能夠使MGMT表達量降低，其具有濃度依賴性。但是，TMZ-HE能夠較TMZ更早更多的消耗MGMT蛋白，100μmol/L的TMZ-HE能夠完全消耗細胞中MGMT蛋白，而TMZ則需要更高濃度，見圖5。

圖5 TMZ,TMZ-HE對LN-18細胞中耐藥蛋白MGMT的影響Fig 5 Theeffectof TMZ,TMZ-HE on the resistant proterin MGMT in LN-18 cells

3 討論

GBM是…級腦腫瘤，年發病率為5～8/10萬，具有生長迅速、侵襲性強等特性，使得手術徹底切除困難，極易復發[11]。目前對GBM的治療采用手術和放化療的綜合治療方式[12]。TMZ是臨床治療惡性腦膠質細胞瘤的標準一線化療藥物。臨床研究表明，TMZ對人惡性腦膠質瘤的有效率在45%左右，GBM對TMZ的耐藥性是化療失敗的主要原因[7,13]。其中，DNA修復酶MGMT是耐藥的主要原因之一[14-15]。有研究表明，白藜蘆醇能夠抑制MGMT蛋白的表達，與TMZ聯合使用能夠增加TMZ的敏感性[16]。TMZ治療膠質瘤的作用效果與MGMT蛋白的消耗和合成的速率有關[5]。本研究通過檢測TMZ-HE對LN-18的作用效果，可以初步探索TMZ-HE是否能夠克服TMZ耐藥。研究結果表明，新型烷化劑TMZ-HE能夠較TMZ更早更多地降低膠質瘤LN-18細胞中MGMT蛋白的表達含量，相應可以增加DNA損傷，導致更多的細胞死亡。通過凋亡等相應功能性實驗結果表明TMZ-HE的作用效果明顯優于TMZ，具有統計學意義，說明TMZ-HE能夠通過降低MGMT的表達增強對LN-18的作用效果。TMZ-HE是在TMZ結構基礎上改造而來，保留了原有的作用基團，所以，通過凋亡檢測和熒光染色結果可以發現TMZ和TMZ-HE都主要誘導LN-18細胞發生凋亡，而細胞死亡幾乎沒有檢測到。這與Roos等[17]研究的TMZ能夠誘導膠質瘤細胞發生凋亡的結果一致。但是，細胞發生凋亡的途徑有很多，會受到各種因素的影響，如p53在膠質瘤細胞中的狀態不同，會誘導細胞發生不同途徑的凋亡[18]。所以，TMZ-HE誘導膠質瘤細胞發生凋亡的途徑是否與TMZ完全相同，其增加的酯結構是否僅影響藥物的滲透能力還有待進一步研究。

本實驗通過MTT法、二維克隆法證明了TMZHE對膠質瘤細胞的短期和長期作用效果都優于TMZ，但兩者有一個共同點，即長期的作用效果更加明顯，200μmol/L TMZ能夠抑制60%的克隆形成，TMZ-HE甚至完全抑制LN-18克隆的形成。TMZ誘導細胞凋亡發生的時間為96 h，這是因為TMZ首先導致膠質瘤細胞發生自噬，研究發現，通過藥物抑制自噬能夠增加TMZ誘導的凋亡[19-20]。TMZ-HE在96 h處誘導LN-18細胞發生更多的凋亡，這是由于TMZ-HE本身能夠抑制自噬導致凋亡增多，還是和TMZ相同，先發生自噬，然后誘導更多的凋亡，這是筆者值得探討的問題。

綜上所述，本研究證明了TMZ-HE能夠通過下調MGMT蛋白抑制膠質瘤細胞LN-18的增殖并誘導其凋亡，TMZ-HE較TMZ作用效果更好，對治療膠質瘤有很好的應用前景。因此，TMZ-HE是否能夠克服TMZ耐藥以及誘導凋亡的機制是進一步研究的主要內容。這些研究大多數還是建立在體外實驗上，由于體內外環境差別較大，要想更好地了解TMZ-HE在膠質瘤中的作用，還有待進一步開展TMZ-HE在體內的相關研究。

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