蝴堞蘭病毒病檢測與防治

張清

蝴蝶蘭從20世紀80年代之前的珍貴高價蘭花蛻變為現今的平價消費性盆花，但臺灣業者在20世紀80～90年代由于國際市場需求量遠高于臺灣本土產能，在買方市場的大環境刺激下，的確有部分業者忽略蘭花病毒病管控之重要性。因此當荷蘭加入蝴蝶蘭產業競爭后，國際上經常有對臺灣蝴蝶蘭種苗病毒感染比例過高的疑慮，而對臺灣蝴蝶蘭的外銷造成部分沖擊。目前多數臺灣業者均已引進病毒病控管機制，否則勢將遭到淘汰。特別是那些過去幾年提早實施病毒病控管的業者，在最近國際經濟危機下仍然保有較強的競爭力，更凸顯病毒病控管的重要性。本文將針對近幾年來臺灣產官學界在蝴蝶蘭病毒檢測與防治上的成果與最新進展加以說明，希望使蘭花界朋友能有更清楚的認識與了解。

一、蘭花病毒的發現與鑒定

臺灣學術界早于1973年及1980年即已分別證實臺灣蘭花上有蕙蘭嵌紋病毒（CymMV）及齒舌蘭輪斑病毒（ORSV） 的存在。1988年又發現胡瓜嵌紋病毒（CMV） 可以感染蘭花。因此當1990年臺灣蝴蝶蘭產業開始萌芽時，政府部門的蘭花病毒防治策略即已針對三種病毒進行擬定。不過在1990年至2003年間有一種有別于上述三種病毒病征的黃化輪斑癥狀（vellow ringspotsyndrome）一直出現在臺灣各蘭園，尤其是白花品系的品種發生比較普遍。當時幾個進行蘭花病毒研究的實驗室，包括臺灣研究所與筆者甚至國外包括荷蘭在內的病毒學者都一直無法證實此一癥狀是否為病毒感染所致。由于此種黃化輪斑病癥經常出現在臺灣外銷到各國的種苗上，雖不確定是哪種病毒所感染，國際上仍然將其通稱為“臺灣病毒Taiwanvirus”，因而對臺灣蝴蝶蘭外銷形象有所影響。所幸到了2003年臺灣農改場陳慶忠博士與中興大學詹富智教授合作，終于證實此病癥乃由一種當時國際上剛剛發現鑒定的新病毒所引起。此病毒乃由澳洲學者于番椒上所發現，并且命名為番椒黃化病毒 （Capsicumchlorosisvirus），簡稱CaCV。由于澳洲學者首先發表與命名，因此遵照國際慣例將此一造成蘭花產生黃化輪斑之病毒定名為CaCV。不過荷蘭在2008年也正式宣稱，在其國內蝴蝶蘭上亦發現另二種病毒可以造成與臺灣病毒（CaCV）相同的病征，其一為鳳仙花壞疽斑點病毒（Impetiens necroticspotvirus，INSV），其二為蕃茄斑點萎凋病毒（Tomatospottedwiltvirus，TSWV）。荷蘭并且承認所謂的臺灣病毒的稱謂并不適當。

2008年中興大學詹富智教授團隊發表在蝴蝶蘭上首次發現一種馬鈴薯Y屬病毒感染的病例，該病毒會造成葉片產生黃化斑點病癥，因此他們將其暫時命名為Phalaenopsischloroticspotvirus（PhCSV）。不過此一病毒與同時期臺灣大學張雅君教授實驗室于俗稱皇宮菜的洛葵（basella）上所發現的另一種馬鈴薯Y屬病毒（Basellarugosemosaicvirus，BaRMV） 分子特性完全相同。故而二者理論上應該視為同一種病毒而給予同一種命名。由于BaRMV在臺灣皇宮菜上發生極為普遍，而蝴蝶蘭的PhCSV僅偶然出現在特定地區。因此判斷蝴蝶蘭上的PhCSV可能是皇宮菜上的BaRMV經由蚜蟲傳播所致。若以此角度來看，此一病毒稱為BaRMV可能較符合實際發生的狀況。

截至目前，經過筆者最新確認的全球各地報導可以感染蘭花的病毒種類已經高達57種，其中有41種為分類地位明確的病毒，另外16種則屬特性有待理清，分類地位仍不明的種類。對于蝴蝶蘭而言，目前我們掌握的全球資料中，可能的病毒種類有12種，其中有8種特性清楚分類確定，其余4種則仍有待鑒定。此8種可以感染蝴蝶蘭的病毒種類中，真正確認發生于臺灣的只有ORSV，CymMv，CaCV，CMV及PhCSV等5種。這五種病毒中經過調查以ORSVGNCymMV分布較為普遍，重要性較高。其次則為CaCV。其他二種事實上因為需經由蚜蟲傳播，而蝴蝶蘭多栽培于溫室內，蚜蟲發生可能性低，故發生的案例極少，重要性并不高。不過所有可能發生的8種蝴蝶蘭病毒臺灣方面均已完全掌握檢測的技術，并且官方多年來一直委由筆者及其他實驗室長期持續監測此等病毒之發生，確保除5種已存在的病毒外不再有入侵之機會。

二、蘭花病毒檢測技術之開發

臺灣早在20世紀90年代初期筆者研究室即已建立CymMV、ORSV及CMV等蘭花病毒之抗血清制作與ELISA檢定技術，在當時技術水平實際上已經與國際同步。2003年當CaCV被確認為引起蝴蝶蘭黃化輪斑的病毒后，因為筆者研究室早已在大巖桐盆花上研究過相同的病毒（HT-1），且已建立檢測技術，因此當時即順利以HT-1的抗血清開始全面應用于CaCV之檢測服務。

1995年筆者首度發展出蘭花病毒ORSV與Cym-MV之RT-PCR檢測技術，將臺灣蘭花病毒帶入核酸檢定之層次。到了1999年我們已經成功開發出可以于單步驟下同時檢定ORSV及CymMV之RT-PCR技術，也就是所謂的單步聚多目標型（SinglestepmultiplexRT-PCR）。此技術比傳統只能偵測單一病毒之RT-PCR技術節省一倍時間、人力及材料成本。此一技術已分別于2006及2007年授權新高及臺霖二家蘭花種苗公司使用。2008年我們更進一步發展出可同時檢測ORSV與CymMV二種病毒之多目標型免疫捕捉RT-PCR技術（Multipleximmune-captureRT-PCR），此技術運用此二病毒之抗體進行RNA的專一捕捉，可以免除蘭花樣品檢測前繁瑣的RNA純化步驟，提升檢測效率，適合大量樣品之作業。

2006年筆者針對RT-PCR技術在結果判斷上的弱點加以改進，發展出所謂的生物品片檢測系統，此系統可以同時檢測ORSV及CymMV二種病毒。2008年筆者進一步開發出可同時檢測ORSV、CymMV及CaDV等三種病毒之單步驟多目標型RT-PCR技術及生物晶片檢測系統。此等生物晶片檢測系統均已技轉晶宇生技公司，進行商業量產及推廣，目前約有十家臺灣蘭花廠商引進此一系統，建立自我檢測品管實驗室。

2008年初筆者離開農業試驗所，轉往朝陽科技大學任教，2009年我們甚至已經開發出可以同時檢測ORSV及CymMV等五種蘭花病毒的生物晶片系統。2010年研究室更進一步建立了目前極受國際科學界矚目的新技術——即時定量RT-PCR，此一技術改進了先前所有病毒檢測技術只能夠進行定性判別的限制，可以在2～3小時內完成定量的檢測，且由于數據化的結果，在重現性與客觀性上都獲得相當程度的進行。目前荷蘭NAK也開始嘗試運用此一技術進行蘭花病毒的偵測與鑒定。我們本年度更首度發展出可以同時檢測ORSV與CymMV的即時定量RT-PCR技術系統，可以節省一半的檢測成本費用，因此臺灣在技術開發上已經稍有領先。

三、病毒檢測之實際推廣與應用

學研界所開發之病毒測技術無非是為了能夠提供可行的方法，讓蘭花業者能夠在種苗生產過程中，明確判斷出感染或未感染的蘭花材料，避免繁殖出感染病毒的種苗。因此這些技術必須能落實應用于蘭花產業界，才能真正解決產業界之需求。因此筆者早在20世紀90年代省政府農林廳期間即開始接受委托辦理“蘭花病毒檢定技術研究”計劃，將抗血清檢定技術無償轉移各試驗改良場所及部分中大型蘭花種苗業者，協助其建立自我病毒檢測實驗室。

另外筆者研究室同時也接受業界蘭花廠商的委托，進行無償的檢測服務。我們于2003年起開始辦理蘭花病毒有償檢測服務工作，按件計酬，向委托業者收取規費（其收費標準乃經過財政部之核定，受規費法之限制）。直到筆者2008年初離開農試所為止，五年來累計曾經接受59家不同蘭花業者之檢測委托，服務樣品估計達6萬個以上。

2003年至2008年期間我們也曾通過技術授權作業，正式將所開發之病毒檢測技術移轉私人企業，協助其建立病毒檢測實驗室，其中包括新高、臺霖與晶宇生物技術，目的是希望能使檢測技術能廣泛應用于蘭花產業界，加速蘭花病毒植株的淘汰與無病毒種苗之生產。后來晶宇生技甚至將其生物晶片之檢測平臺商業銷售推廣于國內廠商應用。目前有臺糖等10家業者引進此一系統。

事實上由于臺灣多數的蘭花生產者、組培廠商與外銷業者多屬小型廠商，建立自我檢測品管實驗室，對他們來講在成本考量上并不經濟。若完全仰仗公家研究單位或學校實驗室進行檢測服務，在效率與服務品質上已尼無法呼應廣大業界之需求。因此，2004～2009年間國科會所成立的農業生物技術國家型計劃策略決定，將農業分子檢測技術產業發展方向著重于檢測服務型企業之催生與輔導。此期間曾經接受國科會計劃輔導之廠商包括晶宇、睿嘉及宏良甫等，這些廠商后來均成為現今蘭花病毒檢測服務與試劑的供應廠商，構成目前我國蘭花病毒檢測服務之基石。2008年筆者輔導艾瑞克生技公司成為另一家獨立專責的檢測服務公司，進行多種蘭花病毒之免疫與分子檢測服務。

由于檢測服務企業化乃國際間包括荷蘭、美國與日本等先進國家運行現況，企業化的運作可以提高服務彈性、效果及品質，而且讓企業間自由競爭，本來就是相互砥礪成長的自然法則，依賴公家單位或學研界進行“兼差式”的檢測服務，不僅會磨損本應單純專責于研究工作的技術人員的精力，其效率與彈性亦不敷競爭嚴苛的產業界之需求。

目前臺灣在檢測服務的架構上乃由“檢測服務企業”、“公家或大學檢測服務”、“蘭花業者內部自我品管”與“試劑套組制造與供應企業”等來源構成四大基石。依據筆者的觀察，四者中目前以私部門所提供之檢測服務占有最大的比例。故此等運用測技術之模式與發展上，已經符合國際之趨勢，且應用檢測技術的普及率與效率上，已經超出任何競爭對手。