高效液相色譜法同時測定枇芩口服液中黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素含量

王慶芬，倪曉霞，李杰，張榮

（中國人民解放軍第一七五醫院·廈門大學附屬東南醫院制劑科，福建漳州363000）

高效液相色譜法同時測定枇芩口服液中黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素含量

王慶芬，倪曉霞，李杰，張榮

（中國人民解放軍第一七五醫院·廈門大學附屬東南醫院制劑科，福建漳州363000）

目的建立同時測定枇芩口服液中黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素含量的高效液相色譜（HPLC）法。方法色譜柱為Kromasil-C18柱（250mm×4.6mm，5μm），流動相為甲醇-0.2%磷酸溶液梯度洗脫，流速為1.0mL/min，進樣量為10μL，檢測波長280 nm，柱溫35℃。結果枇芩口服液中的黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素達到了完全分離，黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的質量濃度線性范圍分別為34.20～171.00μg/mL（r=0.999 8），1.44～7.20μg/mL（r=0.999 6），1.36～6.80μg/mL（r=0.997 7）；高、中、低濃度樣品的平均回收率，黃芩苷分別為99.09%、99.56%和99.61%，黃芩素為98.46%、97.95%、98.31%，漢黃芩素為98.44%、98.51%和98.10%（n=9）。結論該法操作簡單、準確、重復性好，可用于枇芩口服液的質量控制。

枇芩口服液；高效液相色譜法；黃芩苷；黃芩素；漢黃芩素

枇芩口服液是我院皮膚科依據中醫辨證理論，結合臨床用藥經驗研制的治療痤瘡的中藥復方制劑，由枇杷葉、黃芩、白花蛇舌草等13味中藥組方，適用于先天腎陰不足、腎火過旺，加之飲食失節而發病的痤瘡患者［1］。處方中黃芩為君藥，黃芩活性成分主要為黃酮類化合物，其中黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素在醫藥和很多領域有著廣泛的用途，試驗證明，黃芩對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等抑菌活性好［2］。因此，對黃芩中的主要活性成分進行含量控制，對于該制劑的質量控制具有重要意義。枇芩口服液在我院使用多年，臨床效果較好，由于成分復雜，一直以來缺少質量控制方法。現建立了同時測定枇芩口服液中君藥黃芩所含黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素含量的高效液相色譜（HPLC）法［3］，以多指標綜合評價其質量，旨在為該制劑的質量控制提供依據。

1　儀器和試藥

Agilent 1200 Series型高效液相色譜儀，QUAT Pump G1311A型二極管陣列檢測器，ChemState 320型數據處理系統；AUX220型電子分析天平（日本島津）；一次性針頭過濾器；U-S15型實驗室超純水系統。甲醇（HPLC/spectro，TEDIA公司，Lot909910）；磷酸（廣東光華化學廠有限公司，批號為20041001）；黃芩苷對照品（批號為110715-201318），黃芩素對照品（批號為111595-200905），漢黃芩素對照品（批號為111514-200403），均由中國藥品生物制品檢定研究院提供，枇芩口服液（本院制劑室配制，批號為20140509，20140519，20140521）。

2　方法和結果

2.1色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Kromasil-C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇-0.2%磷酸溶液，梯度洗脫（0～20min，47%甲醇；20～30min，47%～53%甲醇；30～40 min，53%～60%甲醇；40～50 min，60%～53%甲醇；50～55 min，53%～47%甲醇；55～60 min，47%甲醇）；流速：1.0mL/min，柱溫：35℃，進樣量：10μL，檢測波長：280 nm。在上述色譜條件下，分別取混合對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液，過濾，分別進樣10μL，記錄色譜圖，結果見圖1。結果表明，黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素與其他組分均能達到較好的分離，且分離度均大于1.5，理論板數均大于5 000。

圖1　枇芩口服液高效液相色譜圖

2.2溶液制備

分別精密稱取黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素對照品17.1，1.2，3.4mg，置50mL容量瓶中，以甲醇溶解并定容至刻度，制成質量濃度分別為342.00，24.00，68.00μg/mL的對照品貯備液。分別精密吸取黃芩苷對照品貯備液5mL、黃芩素對照品貯備液3mL、漢黃芩素對照品貯備液1mL，分別置25mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，經0.45μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得混合對照品溶液。取枇芩口服液適量，用水稀釋5倍，0.45μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液。根據枇芩口服液處方，制備缺黃芩陰性樣品，用水稀釋5倍，0.45μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得陰性對照品溶液。

2.3方法學考察

線性關系考察：精密吸取黃芩苷對照品貯備液5mL、黃芩素對照品貯備液3mL、漢黃芩素對照品貯備液1mL，分別置10，15，20，25，50mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，經0.45μm微孔濾膜濾過，取續濾液，分別依次注入高效液相色譜儀，進樣量為10μL，記錄峰面積。以對照品溶液質量濃度為橫坐標（X）、峰面積值為縱坐標（Y）進行線性回歸，結果見表1。

表1　標準曲線結果

精密度試驗：分別精密吸取黃芩苷對照品貯備液5mL、黃芩素對照品貯備液3mL、漢黃芩素對照品貯備液1mL，分別置25mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。經0.45μm微孔濾膜濾過，取續濾液，測定峰面積，連續測定5次。結果黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素峰面積的RSD分別為1.07%，0.54%，0.29%（n=5），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液（批號為20140509），分別在0，3，6，9，12 h時進樣，按擬訂色譜條件測定峰面積。結果黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素峰面積的RSD分別為1.67%，1.18%，1.58%（n=5），表明供試品溶液在12 h內基本穩定。

重復性試驗：取樣品溶液（批號為20140509）5份，分別依法制備供試品溶液并測定。結果黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素峰面積的RSD分別為1.34%，1.28%，1.17%（n=5），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：精密量取已知含量的供試品溶液（批號為20140509，樣品含黃芩苷319.1885μg/mL、黃芩素19.8815μg/mL、漢黃芩素9.901 0μg/mL）2 mL，分別加入黃芩苷對照品液（171.00μg/mL）、黃芩素對照品液（6.00μg/mL）和漢黃芩素對照品液（6.80μg/mL）1.0，1.5，2.0mL，用水定容至5mL，0.45μm微孔濾膜濾過，取續濾液，進樣測定。結果見表2。

表2　加樣回收試驗結果（n=9）

2.4樣品含量測定

取3批枇芩口服液，依法制備供試品溶液，測定含量。結果見表3。

3　討論

進行多種流動相試驗，參考2010年版《中國藥典（一部）》［4］，以甲醇-0.2%磷酸溶液（47∶53）為流動相，因其中磷酸可作為解離抑制劑，抑制組分解離，增強保留［5］，進而采用梯度洗脫的方法［6-9］，黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素和干擾雜質分離良好，且出峰時間比較早。預試驗中曾對比甲醇-0.2%磷酸溶液（47∶53）等度洗脫和梯度洗脫，采用等度洗脫方法時，黃芩素出峰時間約在47min，漢黃芩素出峰時間在60min后，分離時間長，分離效果不理想。

表3　樣品含量測定結果（μg/mL）

目前，2010年版《中國藥典（一部）》及相關文獻僅對黃芩中黃芩苷的含量進行控制，單以黃芩苷來衡量黃芩的質量稍顯片面性。研究證明，黃芩苷口服液不易吸收，須在腸道經酶水解為苷元黃芩素后方可吸收入血，黃芩素是體內重要有效成分［10］。本試驗中建立了同時測定枇芩口服液中3種指標成分的HPLC法，該法科學、合理，能相對較客觀、全面地反映枇芩口服液的內在質量，為客觀評價其質量提供了科學依據。

［1］蔡元元，陳力.痤瘡的中醫藥辨證治療［J］.吉林中醫藥，2013，33（2）：144-145.

［2］張瑜，武斌，許建衛.黃芩藥理作用的研究進展［J］.醫學綜述，2013，19（6）：1 091-1 093.

［3］李堆淑.中藥黃芩化學成分的研究進展［J］.江西農業學報，2013，25（8）：51-54.

［4］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）［M］.北京：中國醫藥科技出版社，2010：282.

［5］韓憲忠，金蜀蓉，柯昌毅.HPLC法測定復方芩蒼鼻噴霧劑中黃芩苷的含量［J］.中國藥房，2013，24（7）：644-646.

［6］侯學智，張振秋，尤春雪，等.HPLC法測定黃連、黃芩藥對提取物中11個成分的含量［J］.藥物分析雜志，2013，33（1）：57-62.

［7］張慧，閆磊，林龍飛，等.HPLC法測定小柴胡顆粒中7種指標成分［J］.現代藥物與臨床，2014，29（2）：162-165.

［8］杭世艷，何兵，張燕.HPLC同時測定銀黃顆粒中7種有機酸及4種黃酮類成分［J］.中草藥，2013，44（3）：301-304.

［9］周蓬，宋青，馬帥.HPLC法同時測定小兒豉翹清熱顆粒中梔子苷、芍藥苷、黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素［J］.中成藥，2013，35（8）：1 693-1 696.

［10］辛文妤，宋俊科，何國榮，等.黃芩素和黃芩苷的藥理作用及機制研究進展［J］.中國新藥雜志，2013，22（6）：647-659.

Simultaneous Determ ination of Baicalin，Baicalein and Wogonin in Piqin Oral Solution by HPLC

Wang Qingfen，Ni Xiaoxia，Li Jie，Zhang Rong
（Department of Pharmacy，175 Hospital of PLA/the Affiliated Southeast Hospital of Xiamen University，Zhangzhou，Fujian，China 363000）

Objective To establish a method for the simultaneous determination of baicalin,baicalein and bogonin in Piqin Oral Solution by HPLC.M ethods The Kromasil-C18column（250 mm×4.6 mm,5μm）with a column temperature of 35℃was used；the mobile phase consisted of methanol-0.2%phosphate,gradient elution,with flow rate of 1.0 mL/min,and the detection wavelength was set at 280 nm.Results The content of baicalin,baicalein and wogonin achieved a complete separation,peak area of the 3 components had a good linear relationship with the amount of samples.The linear ranges of baicalin,baicalein and wogonin were 34.20-171.00μg/mL（r=0.999 8）,1.44-7.20μg/mL（r=0.999 6）,1.36-6.80μg/mL（r=0.997 7）respectively；the sample-adding recovery were 99.09%,99.56%,99.61%for baicalin，98.46%,97.95%,98.31%for baicalein，and 98.44,98.51,98.10%for wogonin in high，middle，low concentrations（n=9）.Conclusion The method is simple,rapid,accurate and reproducible,and it is suitable for the content determination of baicalin,baicalein and wogonin in Piqin Oral Solution.

Piqin Oral Solution；HPLC；baicalin；baicalein；wogonin

R284.1；R286.0

A

1006-4931（2015）16-0093-03

王慶芬，女，主管藥師，在讀碩士研究生，研究方向為醫院制劑，（電子信箱）wqf0596@163.com；張榮，副主任藥師，研究方向為藥學管理、醫院制劑，本文通訊作者，（電話）0596-2975701。

2014-07-28）