Design-Expert設計優化紅景天苷提取條件

龐紅霞，范桂強，王志杰，王悅，徐衛霞，齊善厚

（1.河北省衡水市食品藥品檢測中心，河北衡水053000；2.衡水學院，河北衡水053000）

Design-Expert設計優化紅景天苷提取條件

龐紅霞1，范桂強1，王志杰2，王悅2，徐衛霞2，齊善厚2

（1.河北省衡水市食品藥品檢測中心，河北衡水053000；2.衡水學院，河北衡水053000）

利用試驗設計軟件Design-Expert通過二次回歸設計得到紅景天苷提取量與提取溫度、提取時間、乙醇濃度關系的回歸模型，該模型能夠較好的預測紅景天苷提取量，在對影響紅景天苷提取量的關鍵因素及其相互作用進行探討之后，得到優化的提取工藝參數為：提取溫度11.4℃，提取時間12.14 h，乙醇濃度為82°（體積比），在此條件下，紅景天苷提取率為2.42%，與理論預測值相比，其相對誤差約為1%。

紅景天苷；響應面；提取

高山紅景天（Rhodiola sachalinensis A Bor.），又名紅景天，庫頁紅景天，是景天科（Crassulaceae）、紅景天屬（Rhodiola）的多年生草本植物或亞灌木植物，是藥食兩用植物［1］。近年來的研究發現了紅景天的許多新的藥理作用，如抗疲勞、抗輻射、抗衰老等［2］，紅景天中的活性成分較多，也較為復雜，國內外已經對20多種的紅景天進行過分離、分析，已經證實的具有明顯功效成分之一的為紅景天苷［3-4］，本研究以紅景天植物為原料，利用響應面法對紅景天苷的提取工藝進行優化研究。

1　材料與方法

1.1材料

乙醇（95%）、乙腈色譜純，（Tedia Company Inc.USA）；高山紅景天購于吉林省安圖縣二道白河鎮；紅景天苷標準品（95%購于國家標準物質網）。

1.2儀器

高效液相色譜：Agilent1100美國；旋蒸儀（型號：EV311）：萊伯泰科有限公司；電子天平：上海田宮稱重制造有限公司。

1.3方法

1.3.1高效液相色譜分析條件

色譜柱：ODS柱（4.6mm×250mm，5m，HPLCTechnology Ltd）；檢測波長：280 nm；流動相：乙腈/水（體積比）=1/9；柱溫：25，流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL。

標準曲線的建立：精確稱取5 g紅景天苷標準品，用95%乙醇定于10 mL容量瓶中，搖勻、備用。分別配置不同濃度梯度的紅景天標準品，HPLC法分別測定吸光度值，重復3次，取平均值，制定標準曲線，得到測定的回歸方程為：Y=2 131 620.354 3X-8 652.812 3，該回歸方程的R2=0.999 2，表明該紅景天苷溶液濃度與峰面積在相應范圍內線性關系良好。

1.3.2設計篩選紅景天苷提取的重要因素

正交設計僅能從試驗預先設定的幾個水平中優選組合，它得到的最佳工藝條件，并非真實意義的最佳條件，只能說是理想條件，所以無法給出整個區域上因素的最佳組合的最優值。響應面分析法（RSM）是一種尋找多因素系統中最佳條件的數學統計方法。由于采用了合理的實驗設計，能以最經濟的方式，用很少的實驗數量和時間對實驗進行全面研究，能在整個考察區域上確定各個因素的最佳組合及最優響應值。所以本實驗將通過Box-Behnken實驗設計優化紅景天苷提取條件，為紅景天苷的工業提取提供理論參考。

采用Design-Expert8.0軟件中Box-Behnken試驗設計方案［3］，根據前期試驗研究結果，選取對紅景天苷較有影響的提取溫度、提取時間、乙醇濃度三因素三水平共15個試驗點（3個中心點）的響應面分析試驗，運用Design-Expert8.0軟件的RSREG（Response surface regression）程序對15個試驗點的響應值進行回歸分析。表1為響應面試驗設計表。

表1　響應面設計因素水平表Table 1The factors and levels of response surface for Grifola frondosa

2　結果與討論

2.1響應面結果與分析

根據前期單因素試驗結果，選取最顯著的提取溫度、提取時間、乙醇濃度為實驗因素，采用Box-Benhnken實驗設計對紅景天苷提取條件進行三因素三水平的響應面分析實驗，包括12個析因試驗和3個中心試驗。運用Design-Expert8.0軟件中Box-Behnken程序對15個試驗點的響應值進行回歸分析。15個試驗點可分為兩類：其一是析因點，自變量取值在各因素所構成的三維頂點，共有12個析因點；其二是零點，為區域的中心點，零點試驗重復3次，用以估計試驗誤差，以紅景天苷提取量為響應值，經回歸擬合后，確定函數表達式。試驗結果見表2。

該實驗回歸方程為：

表2　Box-Behnken試驗設計及相應結果Table 2Box-Behnken design and the experimental results

采用SAS RSREG程序對表2數據進行ANOVA分析，結果見表3。

表3　回歸方程中回歸系數的估計值及方差分析Table 3Results of the Box-Behnken design regression analysis

該方程回歸顯著，模型的復相關系數的平方即R2=99.51%，說明回歸方程的擬合程度良好，失擬較小，可以用該方程代替真實實驗點進行分析。由表3中的P值可知道，方程中A、B、C、A2、B2、C2對Y值的影響達到極顯著水平，而方程中AC、BC影響顯著，表明實驗因子對響應值不是簡單的線性關系，二次項對響應值也有很大的關系，這和模型回歸中的線性和平方項影響顯著相對應。交互項系數均不顯著，所以交互作用的影響相對較小。失擬項的p=1.83，沒有顯著性影響，說明數據中沒有異常點，不需要引入更高次數的項，模型適當。

通過軟件分析，得到當紅景天苷提取量最大時，A=0.14；B=0.07；C=0.20；從而分析得到紅景天苷提取的最佳工藝條件為提取溫度11.4℃，提取時間12.14h，乙醇濃度為820（體積比），此條件下，根據方程分析得到紅景天苷的提取量為2.356 3（%）；為檢驗響應曲面法所得結果的可靠性，采用上述優化提取條件進行提取實驗，實際測得的紅景天苷提取量為2.42%，與理論預測值相比，其相對誤差約為1%，因此，基于響應曲面法所得的紅景天苷提取參數準確可靠，具有實用價值。

2.2響應面直觀分析

圖1～圖3直觀地給出了各個因子交互作用的響應面的3D和等值線分析圖。從響應面的最高點和等值線可以看出，在所選的范圍內存在極值，既是響應面的最高點，同時也是等值線最小橢圓的中心點。

圖1　提取時間和乙醇濃度對紅景天苷提取響應面分析Fig.1The analysis on response surface from inoculum size and culture temperature

圖2　提取溫度和乙醇濃度對紅景天苷提取響應面分析Fig.2The analysis on response surface from inoculum size and culture temperature

圖3　提取溫度和提取時間對紅景天苷影響響應面分析Fig.3The analysis on nisin fermentation response surface from temperature and add the volume of sucrose

圖1顯示了當提取溫度位于中心水平時，提取時間和乙醇濃度對紅景天苷提取量影響的響應面和等高線圖。從圖中可以直觀地看出提取時間和乙醇濃的交互作用較強，因為等高線的形狀反映交互效應的強弱大小，圓形表示2因素交互作用不顯著，而橢圓形則與之相反。并發現乙醇濃度軸向等高線變化密集，而提取時間軸向等高線的變化相對稀疏，故乙醇濃度對響應值峰值的影響較提取時間影響大。

圖2顯示了當提取時間位于中心水平時，提取溫度和乙醇濃度對紅景天苷提取量的影響的響應面和等高線圖。由圖可知，提取溫度和乙醇濃度的交互作用不大。

圖3顯示了當乙醇濃度位于中心水平時，提取溫度和提取時間對紅景天苷提取影響的響應面和等高線圖。結果表明，提取溫度的等高線較為密集，而提取時間較為稀疏，表明提取溫度的影響較大，而提取時間影響不明顯。

3　結論

紅景天苷為紅景天中的主要活性物質之一，具有抗缺氧、抗疲勞、抗輻射等多重功效，在前期單因素研究基礎上，采用Design-Expert8.0軟件中Box-Behnken試驗設計對紅景天苷進行提取條件優化研究，結果得到當紅景天苷提取量最大時，A=0.14；B=0.07；C=0.20；從而分析得到紅景天苷提取的最佳工藝條件為提取溫度11.4℃，提取時間12.14 h，乙醇濃度為82°（體積比），此條件下，根據方程分析得到紅景天苷的提取量為2.356 3（%）；為檢驗響應曲面法所得結果的可靠性，采用上述優化提取條件進行提取實驗，實際測得的紅景天苷提取量為2.42%，與理論預測值相比，其相對誤差約為1%，因此，基于響應曲面法所得的紅景天苷提取參數準確可靠，具有實用價值。

［1］鄒曉麗．長白山紅景天配伍FDP抗疲勞作用實驗研究［D］．哈爾濱：東北師范大學，2008

［2］陶貴榮，趙銀萍，齊建，等．不同地區紅景天植物紅景天苷含量比較研究［J］．西北植物學報，2010，30（9）：1902-1905

［3］李穎，厙守權，劉剛，等．發酵紅景天中紅景天苷的含量測定［J］．延邊大學醫學學報，2013，36（4）：271-273

［4］楊連梅，胡榮，齊文，等．藏藥狹葉紅景天化學成分研究［J］.中國藥劑學，2011，20（5）：154-158

Study on Extraction of Salidroside by Design-Expert Method

PANG Hong-xia1，FAN Gui-qiang1，WANG Zhi-jie2，WANG Yue2，XU Wei-xia2，QI Shan-hou2
（1.Hengshui Municipal Food and Drug Inspection and Testing Center，Hengshui 053000，Hebei，China；2.Hengshui College，Hengshui 053000，Hebei，China）

The regression model，related to the amount of extraction of salidroside，extracting temperature，extracting time，ethanol concentration was obtained by using Design-Expert experimental design software through quadric regression design.The regression model would be a fairly reliable forecast for extraction of extraction of salidroside.The optimized extraction parameters were obtained as follows：extraction temperature 11.4℃，extracting time 12.14 h，ethanol concentration 82°（v/v）.Under the conditions，the extraction amount of salidroside reached 2.42%，the relative error of about 1%Comparing with the theoretical predictions.

salidroside；responsesurface；extracting

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.13.019

2015-04-20

衡水市科技局指令性課題（編號：14032）

龐紅霞（1977—），女（漢），主管藥師，本科，主要從事化學藥品檢測檢驗研究。