骨炎敗毒丸的微生物限度檢驗法驗證

陳 君

（襄陽市食品藥品監督檢驗所，湖北 襄陽 441100）

骨炎敗毒丸的微生物限度檢驗法驗證

陳 君

（襄陽市食品藥品監督檢驗所，湖北 襄陽 441100）

目的 建立骨炎敗毒丸的微生物限度檢驗法。方法 按中國藥典2010年微生物限度檢查驗證方法的驗證，以回收率對方法有效性進行評價。結果 采用常規法，5種陽性菌的回收率均＞70%，控制菌驗證試驗均為陽性。結論 骨炎敗毒丸其中藥成分在微生物限度檢查時不會干擾檢查結果，不具有抑菌活性，常規法用于骨炎敗毒丸的微生物限度檢查可行性強，垂直操作簡單易行，結果準確，可用于骨炎敗毒丸的微生物限度檢驗。

骨炎敗毒丸；微生物限度檢查；驗證；培養基稀釋法；回收率

本品為襄陽市夏綠二骨炎風濕病專科門診部自制制劑，有金銀花、蒲公英、苦地丁、連翹、黃柏等一共15味中藥制成，具行氣活血，化瘀通滯，清熱解毒的功效，用于急慢性骨髓炎，慢性化膿性骨髓炎，慢性硬化性骨髓炎，化膿性關節炎，一切化膿性炎癥［1］。其方中金銀花具有清熱解毒，疏散風熱。用于癰腫疔瘡，喉痹，丹毒，熱毒血痢，風熱感冒，溫病發熱［2］。其質量控制一直使用其門診部自制標準，原質量標準中無微生物限度檢查法的具體檢驗方法，產品內在質量得不到保證，本研究擬對骨炎敗毒丸的微生物限度檢查方法進行驗證，最終確認對本品最科學的方法，為保證本品的質量提供定量方法學實驗依據［3］。

1　儀器與試藥

骨炎敗毒丸（襄陽市夏綠二骨炎風濕病專科門診部，20131002，60克/瓶），菌種包括大腸埃希菌［CMCC（B）44102］；金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］；枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501］；白色念珠菌［CMCC（F）98001］；黑曲霉［CMCC（F）98003］均購自中國藥品生物制品檢定所。培養基：營養肉湯（130522）營養瓊脂培養基（130521）、玫瑰紅鈉瓊脂培養基（130627）、膽鹽乳糖培養基（130421）、改良馬丁瓊脂培養基（130607）、改良馬丁液培養基（130522）。儀器：電熱恒溫干燥箱（202-2），立式滅菌器（LMQ.C）。

2　方法與結果

2.1菌液的制備

2.1.1分別將5種菌種接種至斜面培養基上培養。

2.1.2分別取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌新鮮培養物至50 mL營養肉湯中；白色念珠菌至改良馬丁瓊脂培養基上，以上4種菌均培養24 h。

2.1.3黑曲霉至改良馬丁瓊脂斜面培養基上，培養5 d，加入3 mL含0.05%聚山梨脂80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，然后吸出孢子懸液至無菌試管內。

2.1.4以上5種培養好的菌，分別用相應的稀釋溶液按10倍遞增稀釋法稀釋，制成含菌數為50～100 cfu/mL的菌液。

2.1.5所有菌液臨用現制并均放置于冰箱冷藏。24 h內使用。

2.2適用性檢查：按中國藥典2010年版一部附錄XIIIC微生物限度檢查法項下計數培養基適用性檢查法操作，每個菌種在其對應的培養基平行做2個平皿，培養相應的時間后計數，本次試驗所用養基上的菌落平均數均大于對照培養基上的菌落平均數的70%，菌落形態大小均與對照培養基上的菌落一致。培養基的適用性檢查通過。

2.3供試液的制備：取本品10 g，加稀釋液至100 mL，用勻漿儀2擋 1 min打碎混勻，做為1∶10的供試液，按遞增稀釋法制成1∶10、1∶102、1∶103共3個稀釋級的供試液。

2.4計數方法的驗證

2.4.1細菌、霉菌及酵母菌驗證試驗［4］。①實驗組：取1∶103供試液1 mL和制備好的的實驗菌液1 mL，每種實驗菌平行制備2個平皿，分別加相應的培養基，按平皿法測定其菌落數。②菌液組：此組只加菌液，不加供試品，按實驗組的方操作計數。③供試品對照組：按中國藥典2010年版一部附錄XIIIC微生物限度檢查法——菌落計數法測定本品菌數，3個稀釋級別每種培養基平行制備2個平皿。④稀釋劑對照組：此組用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替供試品，按實驗組的方操作計數。⑤陰性對照組：中國藥典2010年版一部附錄XIIIC微生物限度檢查法項下計數方法驗證中，未加入陰性對照組，此次試驗筆者首次提出應加入陰性對照組，以增加驗證的準確性和嚴謹性。試驗用每種培養基均制備2個平皿，只加稀釋液，注入培養基后依法培養計數。陰性對照組均無菌落生長。

以上實驗共進行3次獨立的平行試驗。計算菌數回收率。菌數回收率見表1。稀釋劑對照組和實驗組對5種試驗菌的回收率均＞70%。說明本次試驗制備供試液和計數的方法適用于骨炎敗毒丸的微生物限度檢驗法。

2.4.2控制菌檢查方法的驗證：取1∶10稀釋級的供試液10 mL及1 mL含菌數為50～100 cfu的大腸埃希菌實驗菌液分別接種至膽鹽糖培養基和乳糖膽鹽發酵培養基中，按中國藥典2010年版一部附錄XIIIC微生物限度檢查法項下大腸埃希菌和大腸菌群檢查法進行檢查，結果均為陽性。說明常規法即可適用于本品的控制菌檢查。同細菌、霉菌及酵母菌計數驗證一樣，本次試驗，筆者也增加了陰性對照組，依法培養后均無菌生長。

3　討 論

由驗證結果可知，本品微生物限度采用常規法，對5種試驗菌的回收率均＞70%，且控制菌驗證結果大腸埃希菌及大腸菌群均為陽性，說明本品中含有的中藥成分不具有抑菌活性，不會干擾微生物限度檢驗結果，采用常規法即適用于本品的微生物限度檢查。此次驗證，確立了骨炎敗毒丸的微生物限度檢查方法，為今后本制劑的質量控制提供了有力的科學證據。同時，本次驗證，筆者首次提出在依照中國藥典2010年版一部附錄XIIIC微生物限度檢查法驗證同時，增加陰性對照組，使實驗結果更具有說服力和科學性。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:一部［S］.北京:化學工業出版社，2010:231.

表1　菌數回收率

［2］南京中醫藥大學.中藥大辭典（下冊）［M］.2版.上海:上海科學技術出版社，2006:1895.

［3］張美麗，楊曉東，鄧媛，等.中成藥微生物限度檢查方法驗證［J］.河南中醫，2014，34（3）:532.

［4］姚衛紅，張麗娜，劉美秀.清熱解毒類中成藥微生物限度檢查方法驗證［J］.中國藥物經濟學，2013，8（2）:152.

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B

1671-8194（2015）20-0051-02