免疫標記法在汗潛手印的顯現與成分檢測中的應用進展

湯鳳梅，馬榮梁，馮永杰，吳 浩，曲會英，劉 寰

（1.公安部物證鑒定中心，北京100038；2.遼寧警察學院，遼寧 大連116036；3.江蘇省公安廳 刑警總隊，江蘇 南京 210000）

手印是指人手指、掌表面的乳突紋、屈肌褶紋、皺紋等皮膚花紋結構在力的作用下接觸客體時所形成的能反映花紋結構與外形結構特點的印痕總稱，包括指頭印、指節印、手掌印等。手印，作為刑偵領域最重要的物證之一，在人身認定中發揮重要的作用。形成汗潛手印的物質主要是指掌皮膚汗腺分泌的汗液，包括水、多種無機物和有機物，如氯化鈉、尿素和各種氨基酸。汗潛手印物質中實際上還包括脂類物質，如脂肪酸、甘油、固醇等。雖然指掌面沒有皮脂腺，但是人們在日常生活習慣中會經常接觸皮脂較多的部位（例如頭面部），于是指掌表面的脂類物質留存在手印紋線中[1]。

針對手印物質中的各種成分，已經建立了粉末顯現法、茚三酮顯現法、DFO顯現法以及502膠熏顯法等傳統方法。在實際工作中，現場潛在手印的顯現主要存在兩個難題：一是某些疑難復雜客體表面上的手印，采用現有方法的顯現效果難以令人滿意；二是手印顯現的靈敏度仍然有待提高，以顯現痕量汗液物質形成的手印或陳舊手印等。各國學者正努力從兩個方面來解決上述難題：一是研發新材料、建立新技術，來提高顯現方法的靈敏度，同時拓展方法適用客體范圍；二是充分發掘汗潛手印提供的潛在信息，不僅僅局限于手印的形態，更深入研究手印物質中的特殊成分，通過對特殊成分的測定確定嫌疑人的生活習慣，即通過手印物質對嫌疑人進行描繪。因此，免疫標記法應運而生，與傳統方法相比，該方法不僅能夠顯現汗潛手印，同時，基于抗原抗體特異性反應，還能完成手印物質中某些特定成分的測定，以此作為依據，推斷嫌疑人接觸過或食用過何種毒品，或者具有哪些生活習慣，例如吸煙，或者患有某種疾病等。

1 免疫標記技術（Immunolabelling technique）

該技術是以放射性同位素、熒光素、酶、生物素、膠體金、化學發光元素、鐵蛋白等作為示蹤物標記抗體（或抗原），通過抗原抗體特異性反應，并借助精密儀器對示蹤物進行測定，借此鑒定未知抗原（或抗體）[2]。近年來，針對汗潛手印的顯現與成分檢測所采用的示蹤物主要以熒光素為主，即采用免疫熒光技術，該技術主要分為直接免疫熒光法和間接免疫熒光法。

直接免疫熒光法是將熒光素標記的抗體直接與相應抗原反應。該方法雖然具有簡單、快速、特異性好的優點，但是，針對每種抗原需制備相應的熒光抗體，因此，該方法在汗潛手印顯現中的應用鮮有報道。

為了克服直接免疫熒光法的不足，發展了間接免疫熒光法，該方法則是將熒光素標記到與一抗特異性結合的二抗上，制備一種熒光標記的二抗。這種二抗可以用于檢測同種動物的多種抗原抗體系統，因此，在汗潛手印的顯現中應用較多。間接免疫熒光法主要分為三個步驟：第一步，用未標記的一抗進行孵育，部分抗體與存在的抗原進行特異性結合，洗滌去掉未結合的抗體；第二步，加入熒光標記的二抗再次孵育，此時標記的二抗與一抗相結合，然后，洗滌去掉未結合的二抗；最后，對結合在抗體上的標記物進行定性。若手印物質中有抗原存在時，標記物通常導致熒光手印的生成。當無抗原存在時，則不會發生抗原與一抗的結合，也不會發生一抗和二抗試劑的結合，因此沒有熒光信號產生。

2 間接免疫標記法在汗潛手印的顯現與成分檢測中的應用

最早將免疫技術應用于汗潛手印的研究起源于1977年，Ishiyam[3]與其研究團隊，針對分泌型人群（即能分泌血型抗原的人群），利用抗體（凝集素），通過抗原抗體反應產生凝集現象，即混合細胞凝集反應（mixed cell agglutination reaction，MCAR），對透明膠帶粘面上的手印物質進行血型分析，研究的意外結果是顯現出汗潛手印。Tshiyam等還進一步考察紙張客體，采用茚三酮顯現后，繼續采用MCAR技術比單獨使用茚三酮的顯現要靈敏很多，效果有顯著提高。近年來，國內外學者對免疫標記技術在汗潛手印的顯現與成分檢測的研究主要圍繞以下幾種組分[3]：氨基酸、蛋白質和多肽（角蛋白、組織蛋白酶、皮離蛋白、人血清白蛋白等）、尼古丁代謝產物（可替寧）、毒品（四氫大麻酚，美沙酮）及其代謝產物（美沙酮代謝產物EDDP，嗎啡，苯甲酰芽子堿）等。

2.1 氨基酸

手印物質中，氨基酸類物質濃度可達0.3～2.5 mg/L。Spindler等[4]利用抗L-氨基酸抗體（anti-L-amino acid antibodies），來顯現鋁箔、玻璃、瓷磚上的汗潛手印，原理如圖1所示。首先，分別通過直接吸附法和間接共價法兩種方法將抗體（一抗）修飾到16 nm的金納米顆粒（gold nanoparticles，AuNPs）上，制備出抗體修飾的AuNPs溶液。然后，將該溶液滴加到汗潛手印表面，手印物質中的氨基酸與AuNPs上的抗體發生特異性結合。最后，加入熒光紅610標記的二抗，二抗與一抗相結合。在590nm波長的光源激發下，通過650nm的濾色片，觀察得到熒光手印。研究表明該方法適合幾個月以上或者未知手印的顯現，對3個月以內的新鮮手印顯現效果不好，主要是由于兩個原因：其一，手印物質被免疫試劑溶解并引起擴散；其二，采用的沖洗溶劑對抗體溶解度低，引起的背景染色。后來，作者采用磷酸鹽緩沖溶液作為沖洗溶劑，能有效降低背景染色。

圖1 采用兩種方法制備的功能化金納米粒子顯現汗潛手印[4]（根據參考文獻[4]，已獲得轉載許可，版權歸 Royal Society of Chemistry所有。）

2.2 蛋白質和多肽

與氨基酸相比，對蛋白質和多肽的研究更為廣泛，主要有以下幾種：角蛋白（Keratin）來自于細胞脫落過程；組織蛋白酶Cathepsin-D來自于細胞脫落過程和汗液；皮離蛋白（Dermcidin）來自汗液；人血清白蛋白（Human serum albumin）一種載體蛋白[5]；表皮細胞生長因子（Epidermal growth factor，EGF）是一種低分子量的多肽，由53個氨基酸分子組成，在細胞生長、增殖、分化和修復中發揮重要作用；溶菌酶（Lysozyme）是人體汗腺分泌的一種抗菌酶，是免疫系統固有防御體系的一部分，主要通過破壞細胞壁中的N-乙酰胞壁酸（N-acetylmuramic acid，NAM）的 1位碳原子和 N-乙酰葡萄糖胺（N-acetyl-d-glucosamine，NAG）的 4 位碳原子間的β1-4糖苷鍵，來破壞革蘭氏陽性細菌的細胞壁[6]。

2009年，Drapel等[5]分別針對手印物質中的角蛋白、組織蛋白酶和皮離蛋白，采用Invitrogen生產的商品化試劑盒Chrome Breeze immunodetection kits，按照試劑盒操作手冊，將聚偏二氟乙烯膜（PVDF）膜和紙張上的手印顯現出來。在此研究基礎上，van Dam等[7]與其研究團隊進行了更深入的研究。首先，在滲透性的硝酸纖維素膜（NCM）上捺印汗潛手印，分別只針對手印物質中的皮離蛋白/人血清白蛋白，采用相應的鼠的單克隆IgM抗皮離蛋白抗體/IgG2a抗人血清白蛋白抗體進行結合，在采用異硫氰酸熒光素（Fluorescein isothiocyanate，FITC）標記的羊抗鼠的IgM/IgG二抗與之結合，在特定波長的光源激發下，顯現出熒光手印。然后，van Dam等[7]分別采用熒光探針Lightning-Link Rapid DyLight 350和Cy3與兩種抗體相結合，同時對NCM膜/玻璃片上的手印物質中的兩種蛋白進行標記，在不同的波長的光源激發下，顯現出熒光手印。

由于顯現出的熒光手印只能顯現出兩種蛋白的分布點，間接反映出汗孔的分布，而反映出來的細節特征很少，所以，van Dam等[8]進一步設想了該免疫標記法是否可以與傳統顯現方法相結合，先采用傳統方法對汗潛指紋進行顯現，玻璃片上采用磁性粉顯現，NCM膜上采用茚三酮顯現，然后針對皮離蛋白，采用熒光免疫標記的方法進行顯現，NCM膜上的顯現效果（見圖2）。研究結果表明該免疫標記法與這兩種傳統顯現方法具有很好的兼容性，效果上可以互補。針對NCM膜和玻璃片這兩種客體，van Dam等[9]進一步考查了免疫標記法與其他傳統手印顯現方法的匹配性。先采用傳統顯現方法，然后針對手印中的皮離蛋白，采用免疫標記法進行顯現。其中，滲透性的NCM膜上的手印，采用茚滿二酮-鋅鹽（IND-ZnCl），茚滿二酮-鋅鹽-茚三酮（IND-NIN），物理顯影液（physical developer，PD）進行顯現；非滲透性的玻璃片上的手印，采用502膠熏顯，502膠熏顯-基礎黃染色（CABY），熒光502膠熏顯（Lumi-CA）和聚腈基丙烯酸酯熏顯（Poly-CA）進行顯現。研究結果表明只有Lumi-CA和Poly-CA顯現方法不推薦與免疫標記相結合，顯現效果不好。van Dam等[10]還進一步考察了免疫標記法適用的客體范圍，研究了非滲透客體（鋁箔、不銹鋼鑰匙、塑料瓶、垃圾袋、包裝袋、自封袋），半滲透性客體（瓷磚和薄紙板），滲透性客體（復印紙和熱敏紙），結果表明：薄紙板和復印紙不適合免疫標記法顯現，其他客體均能夠顯現出具有鑒定價值的手印；載體表面的多孔性和疏水性可以影響免疫標記方法的應用，載體表面孔的尺寸影響手印物質的吸附，因此影響抗原的測定；示蹤物的選擇要進行試驗，有些結果違反常規，當客體具有熒光性，例如熱敏紙和復印紙，可以采用辣根過氧化物酶（HRP）代替FITC和Cy3作為示蹤物。

圖2 NCM膜上采用茚三酮顯現與免疫標記顯現相兼容[8]（根據參考文獻[8]，已獲得轉載許可，版權歸 Wiley-VCH Verlag GmbH&Co.KGaA所有）

目前，國內采用免疫標記法顯現指紋的相關研究比較少，2014年，He等[6]建立了免疫多金屬沉積（Immunological Multimetal Deposition，iMMD）顯現膠帶上的汗潛手印的方法，采用抗體修飾的金納米粒子（antibody-AuNPs）與手印物質中的抗原反應，然后通過銀染（Silver staining）的方法進行顯現出黑色紋線的手印。其中AuNPs不僅作為抗體的載體，用來進行識別生物分子，同時，也作為自動金相沉積的成核點，即單質銀在AuNPs表面進行沉積。He等采用人免疫球蛋白（Human immunoglobulin G，hIgG）對膠帶上的汗潛手印進行浸染，來優化iMMD的反應條件。研究發現：抗原和抗體的結合時間增長，顯現效果變好，但是結合時間過長，背景顏色也變深，可能是由于AuNPs與底物的非特異性結合，并且銀染時引起銀的沉積；免疫反應時的溫度對iMMD的效果影響不大；顯現效果隨antibody-AuNPs的濃度的增加而增強；銀染時間長，顯現效果好，但過長背景也變黑了。最后針對手印物質中的表皮細胞生長因子（Epidermal growth factor，EGF）和溶菌酶（Lysozyme），He 等[6]分別采用對應抗體修飾的金納米粒子進行iMMD反應，顯現出手印（見圖3）。該方法具有靈敏度高（手印物質中ng級的成分），快速和特異性強等優點。

圖3 免疫多金屬沉積法顯現膠帶上的汗潛手印[6]（根據參考文獻[6]，已獲得轉載許可，版權歸 Wiley-VCH Verlag GmbH&Co.KGaA所有）

2.3 尼古丁代謝產物——可替寧制

針對吸煙者汗液里的一種尼古丁代謝產物可替寧（cotinine），Russell[11-14]與其研究團隊進行了深入的研究。Leggett等[11]制備出抗可替寧抗體修飾的納米金顆粒（anti-cotinine AuNPs）：采用雙功能交聯劑3-（2-吡啶二巰基）丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯（SPDP）將protein A交聯在納米金顆粒上，然后在protein A上交聯抗可替寧抗體。anti-cotinine AuNPs與手印物質中的可替寧發生抗原抗體的特異性免疫反應，然后加入熒光標記的二抗進行反應，顯現出玻璃片上的汗潛手印。將抗可替寧抗體修飾到AuNPs表面，在其表面覆蓋大約50～60個抗體，提高了抗體抗原結合物的活性，并為熒光標記的二抗提供更多位點，所以熒光信號增強，可以觀察到二級特征（細節特征）和三級特征（汗孔）。如果不結合納米金顆粒，只能證明吸煙經歷，但是顯現出手印不具備同一認定的條件。在陰性對照試驗中，采用anti-cotinine AuNPs顯現不吸煙者的汗液手印，結果顯現不出手印，證明抗原與抗體的特異性結合。在此研究基礎上，Hazarika等[12]建立了15 min快速檢測可替寧的方法：采用商品化的蛋白A/G包覆的磁性顆粒代替納米金顆粒，修飾上抗可替寧抗體，結合熒光標記的二抗，顯現玻璃片上的汗潛手印。Hazarika等考察抗體抗原反應時間對顯現效果的影響發現，孵育反應10min時，手印紋線由白色變為黃色，所以加上沖洗步驟，可以在15min顯現出玻璃片的汗潛手印，并確定可替寧的存在（見圖4）。

圖4 以可替寧為抗原采用免疫標記法顯現玻璃片上吸煙者的汗潛手印[12]（根據參考文獻[12]，已獲得轉載許可，版權歸 Royal Society of Chemistry所有）

Boddis等[13]將該方法應用于白色瓷盤客體，吸煙者汗液中有可替寧存在，能夠顯現出熒光手印；不吸煙者汗液中沒有可替寧，原則上顯現不出手印，但是實際上顯現出“負”的結果，即顯現出熒光手印，但是陰陽紋線顛倒。除了考察免疫標記法適用的客體范圍，Boddis等[14]還考察了保存條件對顯現效果的影響。針對吸煙者玻璃片上的汗潛手印，Boddis等考察了4周內，4種不同條件下的顯現效果：室溫光照，室溫黑暗，55℃黑暗，-20℃黑暗。55℃黑暗條件下保存的手印顯現效果最好，可能是去除了揮發性物質，同時抑制了細菌對脂類、蛋白質的降解以及鯊烯（squalene）的氧化。而-20℃黑暗，手印顯現質量下降，超過2周顯現質量不好。室溫光照的情況下，手印物質脫水，粘滯性增加，細菌和UV使其中的脂類和蛋白質物質發生氧化，從而引起手印物質的降解。在UV下，手印物質中的鯊烯發生過氧化反應，生成環氧化物和過氧化氫物，進一步降解生成丙二醛，甲醛，乙醛，丙酮，這些物質化學性質活潑，具有揮發性，進而引起手印物質的降解。研究表明手印物質降解由光和細菌共同作用，黑暗條件下，手印物質發生氧化和降解的速度比較慢。

2.4 毒品及其代謝產物

免疫標記法在顯現含有可替寧的手印中發揮了很大的作用，因此，Russell[15-16]與其研究團隊將該方法應用于手印中毒品及其代謝產物的檢測。Pompi等[15]分別針對吸毒者汗潛手印中的四氫大麻酚（THC，大麻的主要成分），美沙酮和其代謝產物（EDDP，2-亞乙基-1，5-二甲基-3，3-二苯基吡咯烷），苯甲酰芽子堿（可卡因的代謝產物），采用商品化的蛋白A/G包覆的磁性顆粒，修飾上對應的抗體，與手印物質中的抗原發生反應，然后結合熒光標記的二抗，顯現出手印（見圖5）。后來，同時針對吸毒者汗潛手印中的嗎啡（海洛因的代謝產物）和苯甲酰芽子堿（可卡因的代謝產物），Hazarika等[16]采用商品化的蛋白A/G包覆的磁性顆粒，分別修飾上對應抗體，將手印劃分為兩個區域，每個區域采用對應的抗體和二抗進行反應，顯現出手印。該方法能夠同時證明手印物質中存在兩種代謝產物。Russell與其團隊的研究成果在行業領域中受到高度評價[17-18]，該方法有很廣泛的應用前景，不僅可以應用于可替寧和毒品的檢驗，還有望應用于爆炸物，以及可以作為診斷指示物的其他代謝產物和激素等。該方法還可能針對手印物質中RNA和DNA，與 STR（short tandem repeat）技術相結合。

圖5 以四氫大麻酚為抗原采用免疫標記法顯現玻璃片上的汗潛手印[15]（根據參考文獻[15]，已獲得轉載許可，版權歸 Wiley-VCH Verlag GmbH&Co.KGaA所有）

3 免疫標記法的影響因素

在采用免疫標記法顯現汗潛手印時，有時會出現非特異性結合，特別是采用載體顆粒時，可能非功能化的顆粒（即沒有抗體修飾的顆粒）也會顯現出手印，出現假陽性結果，對偵查起到誤導作用[7]。以金納米粒子為例，雖然被廣泛用于手印顯現中，但是被手印物質吸附的機理還不明確，目前存在兩種不同的觀點。普遍認為是酸性條件下（pH 3左右），手印物質中含有氨基基團的成分（例如氨基酸、蛋白質等）質子化，帶正電；金納米粒子由于吸附檸檬酸根離子帶負電，從而被吸附到手印物質上。2014年，Moret[19]和其研究團隊深入的研究納米粒子顯現汗潛手印的機理，提出了截然不同的觀點。與金納米顆粒相比，二氧化硅納米顆粒表面更容易被修飾 （例如在其內部可以引入染料），能夠研究更多的影響因素，所以Moret等采用二氧化硅納米粒子進行機理研究。通過考察PH、Zeta電位、修飾基團（-COOH，-（COOH）2，-SO3H，-OP（O）（ONa）CH3）、離子強度等條件，證明二氧化硅納米粒子被手印物質吸附是由于化學反應：納米粒子表面的羥基與手印物質的氨基發生反應，生成酰胺鍵，并且此反應容易被二酰亞胺類物質（如EDC/NHS（N-ethyl-N′-（3-dimethylaminopropyl） carbodiimide hydrochloride/N-hydroxysuccinimide）催化。以往的研究報道已經證明，載體顆粒在顯現手印時起到信號放大的作用[11]，但是對非功能化載體顆粒的反應機理缺乏研究，所以，在建立免疫標記方法時，實驗設計需要考慮多方面因素。

3.1 如何驗證抗原與抗體為特異性結合

通常采用對照實驗（Control experiment）來驗證抗原抗體的特異性結合，主要包括陽性對照（Positive control）、陰性對照（Negative control）、同型對照（Isotype control）三種實驗[7]。其中，陽性對照一般直接采用抗原的標準溶液利用免疫標記的方法進行顯現標記，證明能夠有熒光物質生成。陰性對照，則采用確定不含已知抗原的手印樣本進行免疫標記。以可替寧為例，它只存在于吸煙者的手印物質中，那么陰性對照實驗則采用不吸煙者的汗潛手印，進行免疫標記，來驗證：沒有抗原存在時，是顯現不出熒光手印的。有時也做空白對照，即對含有抗原的手印樣本，不加一抗或者同時不加一抗和二抗，來驗證二抗是否會與手印物質或者與背景發生非特異性結合，以及手印物質是否會自發熒光。空白對照也屬于陰性對照實驗。同型對照則使用與一抗相同種屬來源、相同亞型、相同劑量和相同的免疫球蛋白及亞型的免疫球蛋白，代替一抗。例如標記手印物質中的皮離蛋白，如果一抗采用鼠的單克隆的IgM抗皮離蛋白抗體，二抗采用羊抗鼠的IgM FITC，則同型對照可以采用鼠的單克隆的IgM代替一抗，也可以采用鼠的單克隆的IgM FITC同時代替一抗和二抗。

3.2 盡可能減少客體表面的背景染色

本文已經提到引起背景染色的原因主要有兩個[4]：一是免疫試劑引起手印物質擴散，二是沖洗時，未和抗原結合的功能化的顆粒沒有被沖洗掉，而停留在客體表面上，這主要是因為所采用的溶劑對功能化顆粒的溶解度低所引起的。所以，沖洗時需要對洗脫方式和洗脫溶劑進行優化。

3.3 盡可能地降低非特異性反應的效果

對手印物質中的蛋白作為抗原進行標記時，通常先進行封阻（blocking），然后在進行抗原抗體反應，常采用牛血清白蛋白或脫脂奶粉將可能引起吸附的位點進行封閉，盡可能地降低非特異性反應的效果。

4 展望

針對汗潛手印物質中的特定成分，采用功能化的顆粒材料（如金納米和磁性顆粒），通過免疫標記的方法，顯現出汗潛手印，同時，確定特定成分的存在。與傳統方法相比，免疫標記法的亮點在于能深入研究手印物質中的某種或某些特殊成分。以此作為依據，刑偵人員可以推斷嫌疑人接觸過或食用過何種毒品，或者具有哪些生活習慣，為偵破案件提供方向，縮小偵查范圍。免疫標記法與某些傳統方法可以相兼容，所以，可以先采用傳統方法進行顯現汗潛手印，然后通過免疫標記法確定手印物質中是否有某些特定成分，兩種方法共同為同一認定提供依據。該方法還可以對免疫分析法測定手印物質中的某種特定成分的含量提供技術支持[20]。免疫標記法也存在著不足之處，例如，使用的抗體成本相對較高，操作步驟也比相對傳統方法復雜。

國外相關學者和科研團隊對免疫標記法已經進行了相關的研究，但是已報到的文獻中，對不同的免疫標記方法適用客體的范圍、出現假陽性結果、與傳統方法的兼容性、保存時間和條件的影響等問題依然有待研究。國內關于免疫標記法在汗潛手印的顯現與成分檢測的研究比較少[21]，更缺乏系統深入的研究。目前，國內關于功能化的金納米材料的合成、表征和應用的研究比較多[22-23]，免疫標記法用于顯現汗潛手印以及對其中特定成分的檢測也逐漸引起相關學者的關注[18，24]。免疫標記法能夠在顯現手印的同時，為刻畫嫌疑人提供依據，為偵查提供方向，并且具有高靈敏度和高選擇性的優點，將會在指紋顯現領域發揮更廣泛的應用。

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