產毒真菌基因組研究進展

王龑劉陽劉伊寧

（1. 中國農業科學院農產品加工研究所，北京 100193；2. 農業部農產品加工重點實驗室，北京 100193）

產毒真菌基因組研究進展

王龑1，2劉陽1，2劉伊寧1

（1. 中國農業科學院農產品加工研究所，北京 100193；2. 農業部農產品加工重點實驗室，北京 100193）

真菌毒素是產毒真菌產生的次生代謝產物，以木霉、曲霉、毛霉、青霉和根霉為主的絲狀真菌是農產品中常見的產毒真菌。闡明農產品中產毒致病微生物的基因組序列信息是揭示真菌特殊遺傳性狀的基礎。截至2013年12月，共有子囊菌門中204個種和擔子菌門中62個種的基因組序列已經測序或公布，它們的基因組大小大部分在30-40 Mb。整理了部分已完成基因組測序的具有產毒能力或致病力的真菌基因組信息，并對真菌測序方案、主要產毒真菌及其比較基因組學的研究進展進行了綜述。

真菌；真菌毒素；農產品；基因組；比較基因組學

真菌毒素是天然產生的毒素，主要包括黃曲霉毒素、鐮刀菌毒素、赭曲霉毒素、棒曲霉毒素、玉米赤霉烯酮等，真菌毒素能夠污染幾乎所有種類的食用和飼用農產品，在我國，小麥、玉米、稻谷、花生等糧油產品受真菌毒素污染情況嚴重，此外，奶制品、堅果、干果、香辛料、水果等食品也易受到污染［1］。由于真菌毒素具有強毒性和致癌性，對人類和動物健康造成了巨大的威脅［2］。農產品中真菌毒素污染問題已成為世界各國高度關注的食品安全熱點。因此，合理控制和預防產毒真菌對于保障農產品安全具有重要意義。真菌基因組的闡明將為真菌特性的分析提供強有力的依據，為揭示真菌特殊性狀的遺傳基礎和分子機理奠定基礎。對于深入解析種植、生長、運輸、儲藏過程中產毒真菌菌群的發生和形成，真菌毒素的合成路徑及其調控機制、產毒真菌與農產品互作、危害儲糧品質的機理具有深遠的實際意義。

最近10年來真菌基因組學研究發生根本性的變化，真菌已成為真核生物基因組研究的最佳模式生物。本研究整理了部分已完成基因組序列測定的具有產毒能力真菌的信息，并對真菌測序方案、真菌毒素主要產毒菌及其比較基因組學的研究進展進行了綜述。

1 基因組研究技術進展

真菌多樣性豐富，基因組具有相對較小、重復序列高、易于突變等特點，因此，真菌基因組的測序研究是很有必要的。通過真菌基因組學的研究可以了解真菌各種代謝過程、遺傳機制和生命活動所需要的基本條件，以及微生物特殊功能如致病性的遺傳基礎等［3，4］。

真菌基因組測序分為基因組從頭測序（De novo）和基因組重測序（Genome re-sequencing）?；蚪M從頭測序是指不需要任何現有的序列資料就可以對某個微生物物種進行測序，利用生物信息學分析手段對序列進行拼裝，從而獲得該真菌的基因組圖譜［5］。基因組重測序是對基因組序列已知的真菌進行基因組測序，并在個體水平或群體水平進行差異性分析的方法。真菌基因組重測序能夠檢測全基因組的罕見變異。

隨著科學技術的發展，目前測序技術已經發展到第三代。第一代Sanger測序法，基本原理是基因組DNA經酶切后的片段亞克隆至2 kb 的小文庫和10-20 kb 的大文庫中。從兩端開始對克隆進行測序（即正義鏈和負義鏈），然后組裝成連續的疊連群（Contigs），最終形成完整的基因組［5］。第二代測序技術的核心思想是邊合成邊測序（Sequencing by Synthesis），即通過捕捉新合成的末端的標記來確定DNA的序列，在Sanger測序方法的基礎上，用不同顏色的熒光標記4種不同的dNTP，當DNA聚合酶合成互補鏈時，每添加一種dNTP就會釋放出不同的熒光，根據捕捉的熒光信號并經過特定的計算機軟件處理，從而獲得待測DNA的序列信息。現有的技術平臺主要包括Roche/454 FLX、Illumina/ Solexa Genome Analyzer和 Applied Biosystems SOLID system［6］。這3個技術平臺各有優點，454FLX的測序片段比較長，高質量的讀長（Read）能達到400 bp；Solexa測序性價比最高，不僅機器的售價比其他兩種低，而且運行成本也低，在數據量相同的情況下，成本只有454測序的1/10；SOLID測序的準確度高，原始堿基數據的準確度大于99.94%，而在15×覆蓋率時的準確度可以達到99.999%，是目前第二代測序技術中準確度最高的。第三代基因測序技術即基于納米孔的單分子讀取技術。熒光標記的脫氧核苷酸被摻入DNA鏈的時候，它的熒光就同時能在DNA鏈上探測到。當它與DNA鏈形成化學鍵的時候，它的熒光基團就被DNA聚合酶切除，熒光消失，合成的DNA鏈和天然的DNA鏈完全一樣。單分子的DNA聚合酶被固定在直徑只有幾十納米的納米孔內，當某一種熒光標記的脫氧核苷酸被摻入到DNA鏈時，這種特定顏色的熒光會持續一小段時間，直到新的化學鍵形成，即熒光基團被DNA聚合酶切除為止［5，7］。第三代測序技術主要有3個優勢：一是實現了DNA聚合酶自身的反應速度，一秒可以測10個堿基，測序速度是化學法測序的2萬倍；二是實現了DNA聚合酶自身的延續性，一個反應就可以測非常長的序列，讀長達幾千個堿基；三是測序精度非常高，達到99.9999%。此外，第三代測序可以直接測RNA的序列，大大降低體外逆轉錄產生的系統誤差；可以直接測甲基化的DNA序列，通過DNA聚合酶復制堿基時停頓的時間不同，判斷模板的C堿基是否甲基化［7］。

2 常見重要致病真菌基因組信息

隨著測序技術的發展和測序服務的普及，大量真菌基因組陸續完成測序和注釋，截止到2013年12月，在NCBI基因組數據庫中共有子囊菌門（Ascomycota）中204個種的基因組序列和擔子菌門（Basidiomycete）中62個種的基因組序列已經公布。子囊菌門中公布的基因組序列包括盤菌亞門（Pezizomycotina）的145個種和酵母亞門（Saccharomycotina）的59個種。

最早完成測序的種屬一般都是具有某一生物學功能并用于工業化生產的。真菌的基因組測序工作是從酵母開始的，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、 粟 酒 裂 殖 酵 母（Schizosaccharomyces pombe）是食品工業的常見菌，用于面包、酒類生產；粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）是生物學研究的模式菌株，分別在1965年、1997年、2002年和2003年測序完成［8-10］。米曲霉（Aspergillus orzaye）和煙曲霉（Aspergillus fumigatus）的全基因組序列于2005 年完成測序和注釋［11，12］。黑曲霉（Aspergillus niger）、 棒 曲 霉（Aspergillus clavatus）、黃曲霉（Aspergillus flavus）、寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）、構巢曲霉（Aspergillus nidulans）和土曲霉（Aspergillus terreus）等絲狀真菌基因組序列也相繼完成測序和/或注釋［4，13］。除曲霉屬外，產黃青霉（Penicillium chrysogenum）和鏈格孢菌（Alternaria brassicicola）的基因組也陸續完成測序［14］。表1 列出了已經完成的一些農產品中常見致病真菌的基因組測序、注釋的相關信息［8-10］。這些真菌的基因組大小大部分為 30-40 Mb，進一步進行比較基因組學研究，將有助于了解真菌的生物特性，解決農業、工業和醫學等領域的重大問題。

表1 農產品中常見致病真菌的基因組信息

3 部分完成全基因組序列測定的真菌

3.1 曲霉菌（Aspergillus）

曲霉菌屬于子囊菌門（Ascomycota）盤菌亞門（Pezizomycotina），目前測序研究的主要有曲霉屬9個種。棒曲霉生長在土壤、霉果皮、動物糞等基物上，產生可能使人類和動物致病的棒曲霉素（Patulin）；黃曲霉感染花生、玉米等谷物，產生高致癌的黃曲霉素（Aflatoxin）威脅人畜類健康；煙曲霉感染玉米和豆粕等谷物，是臨床上重要的條件致病真菌，過敏體質者、器官移植患者及免疫缺陷患者等更易感染；米曲霉產生蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、纖維素酶和植酸酶等復合酶，是生產在大腸桿菌中不能表達的真核生物活性蛋白的理想載體；黑曲霉用于工業生產檸檬酸、藥品、酶和食品，大部分菌株都產生有機酸和水解酶，部分菌株具有致病力，產生赭曲霉毒素（Ochratoxin）；白曲霉用于釀造燒酒，白曲霉生長在蒸熟的谷物培養基上，分泌多聚糖水解酶，把谷物中的淀粉物質轉化成糖類，與黑曲霉不同，白曲霉不產生赭曲霉毒素；構巢曲霉能誘導產生異核體或二倍體、有性和無性孢子，是遺傳學和生物化學研究的模式生物之一；土曲霉產生的次生代謝產物——他汀（Lovastatin），臨床上被廣泛應用于心臟病預防。這些曲霉近緣種的基因組大約為30-37 Mb，分布于5或8條染色體。

3.1.1 黃曲霉 黃曲霉菌是一種自然界中常見霉菌，其嚴重威脅人畜健康。黃曲霉普遍存在于花生、玉米或黃豆中，對作物造成嚴重霉害；同時會產生高致癌、致畸毒性的黃曲霉素（Aflatoxin）。黃曲霉素主要有B1、B2、G1、G2，以及另外兩種代謝產物M1、M2。其中AFB1是最危險的致癌物，在玉米、花生、棉花種子以及一些干果中常被檢測到。黃曲霉為單倍體，產生無性孢子，基因組約36 Mb，分布于8條染色體。

3.1.2 煙曲霉 煙曲霉在潮濕環境中普遍存在，可侵染棉鈴和蘋果等，引起果實腐爛，或寄藏于種子上，造成農產品單位產量和質量的下降，造成巨大的經濟損失。由于煙曲霉作為重要的人類致病菌，煙曲霉的基因組2005年被測序完成，在最近12年中煙曲霉導致的疾病發生率增加了14倍，尤其是過敏體質者、器官移植患者、艾滋病毒攜帶者、艾滋病患者、慢性肉芽腫病及重癥聯合免疫缺陷等患者更易感染。煙曲霉對其他哺乳動物也產生致病性，研究表明煙曲霉可以導致鳥類肺部和氣囊感染?；蚪M測序分析將有助于理解煙曲霉的生物學特性，識別煙曲霉致病性的分子機制。煙曲霉基因組約30 Mb，分布于8個染色體，可能有9 900-11 000個基因。

3.1.3 棒曲霉 棒曲霉可生長在土壤、果皮、動物糞便等基質物上，能夠產生使人類和動物畸變、癌變的棒曲霉素（Patulin）。目前這種毒素在果品、蔬菜、果蔬汁、果酒等食品中均有被發現，并引起世界各衛生組織極大的關注。棒曲霉與煙曲霉、土曲霉這兩大病原真菌親緣關系較近。棒曲霉為單倍體，基因組約28 Mb，分布于 5條染色體，大約有9 323個基因。

3.1.4 構巢曲霉 構巢曲霉也稱為小巢狀曲菌（Emericella nidulans），通常為單倍體，但能誘導為異核體或二倍體，產生有性和無性孢子，而其他大部分曲霉是無性的。構巢曲霉菌屬于同宗配合菌，即任何兩個菌株間均可直接進行交配產生子囊孢子。目前構巢曲霉是遺傳學和生物化學上研究得最廣泛的生物之一，已經得到了數百個基因的突變株。構巢曲霉也是研究細胞生物學的模式生物之一，它還用來表達哺乳動物基因。構巢曲霉中的乙醇脫氫酶基因lacA可調控啟動子，能夠被乙醇誘導表達，同時又能被葡萄糖抑制，是基因表達調控中重要的工具元件。研究構巢曲霉基因組將有助于了解構巢曲霉的生物學特性，與寄主的相互作用以及曲霉菌的致病性，還能促進疫苗和藥物的研制開發。構巢曲霉與黑曲霉、米曲霉、黃曲霉和煙曲霉等親緣關系較近。構巢曲霉基因組約31 Mb，分布于8條染色體，含11 000-12 000個基因。

3.1.5 黑曲霉 黑曲霉用于工業生產檸檬酸、藥品、酶和食品。黑曲霉具有表型多樣性，在全球均有發現，包括海洋和陸地菌株，廣泛分布于世界各地的糧食、植物性產品和土壤中，大部分菌株都產生有機酸和水解酶，有的菌株還可將羥基孕甾酮轉化為雄烯，部分菌株具有致病力，產生赭曲霉毒素（Ochratoxin）。生長適溫37℃，最低相對濕度為88%，能引致水分較高的糧食霉變。黑曲霉基因組約34 Mb，分布于8條染色體，含10 947個基因。

3.1.6 白曲霉（Aspergillus kawachii） 白曲霉用于釀造燒酒，是日本傳統的蒸餾酒，原料主要包括大米、大麥、番薯、馬鈴薯和蕎麥。在生產燒酒的過程中，白曲霉生長在蒸熟的谷物培養基上，分泌的酶包括各種多聚糖水解酶，把谷物中的淀粉物質轉化成糖類。白曲霉與黑曲霉在進化上親緣關系最近，在食品生產工業上使用，能夠產生大量的檸檬酸防止細菌污染。但是，與黑曲霉不同，不產生赭曲霉毒素。白曲霉基因組大小約36.5 Mb，含有11 475個基因。

3.1.7 土曲霉 絲狀真菌土曲霉能夠產生次生代謝產物他汀。在過去10年中，他汀類降膽固醇藥物在臨床上被廣泛應用于心臟病預防。目前應用的5個他汀類藥物中，土曲霉能發酵產生其中3個：普伐他汀（Pravastatin），辛伐他?。⊿imvastatin）和洛伐他?。↙ovastatin）。此外，土曲霉也能產生對人類和其他動物有害的棒曲霉素（Patulin）和橘霉素（Citrinin）。土曲霉是單倍體，基因組大約35 Mb，分布于 8條染色體，可能含有996個基因。

3.2 灰葡萄孢霉（Botryotinia fuckeliana）

灰葡萄孢霉是一種植物致病菌，可引起灰霉腐敗（Gray mold rot）或灰霉?。˙otrytis blight），感染超過200種植物，包括大部分的蔬菜、水果、多種喬木、灌木、花卉和雜草?；移咸焰呙乖谌蛟斐傻霓r作物損失占全部損失的20%，每年約有10-100億歐元。在特定環境下，灰葡萄孢霉可造成葡萄貴腐（Noble rot），這是釀造貴腐酒等餐后甜酒必需的?；移咸焰呙故墙z狀真菌單倍體，基因組約38 Mb，分布于30個染色體，可能有11 000-17 000個基因。

3.3 鏈格孢菌（Alternaria brassicicola）

鏈格孢菌是無性生殖有絲真菌，在蕓苔屬植物上引起黑斑病，包括花椰菜、甘藍、油菜和芥菜上均會發病，侵害葉、莖、莢。葉片染病病斑圓形至橢圓形，黑褐色，大小2-5 mm，具同心輪紋，濕度大時，病部生有黑灰色霉狀物，即病原菌分生孢子梗和分生孢子。病菌以菌絲體或分生孢子在病殘體或留種株上越冬，也可以分生孢子附著在種子表面越冬，翌年以分生孢子進行初侵染和再侵染，借氣流傳播致病，一般發生在農作物的夏季生長期。在采后油菜作物上因為鏈格孢菌引起的損失達60%以上。鏈格孢菌基因組約29.6 Mb，分布于9條染色體。

3.4 鐮刀菌

3.4.1 輪狀鐮刀霉菌（Fusarium verticillioides） 輪狀鐮刀霉菌又稱為串珠狀赤霉（Gibberella moniliformis），是全球性感染玉米的真菌。一定的環境條件，串珠鐮刀菌使玉米內核和穗腐爛，導致農作物重大的經濟損失。串珠狀赤霉也產生致癌物伏馬菌素（Fumonisin mycotoxins）。如果食用了含伏馬菌素的玉米可引起人類和動物多種疾病。串珠狀赤霉是單倍體，基因組約46 Mb，分布于11條染色體，可能含有16 000個基因。

3.4.2 禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum） 禾谷鐮刀菌又稱為玉蜀黍赤霉（Gibberella zeae），是小麥和大麥赤霉病的病原體。我國每年小麥赤霉病受害面積在4 00×104hm2以上，重發區已經由長江中下游向北擴展到山東、河南、河北等小麥主產區，2010年發病面積甚至超過約0.667×108hm2，給小麥生產造成巨大損失，嚴重影響籽粒品質。鐮刀菌產生的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol）嚴重威脅食品安全。DON毒素具有很強的細胞毒性和胚胎毒性，能引起人類食管癌、IgA腎病、克山病和大骨節病等。玉蜀黍赤霉還產生對人類及動物健康造成嚴重危害的嘔吐毒素（Vomitoxin）。玉蜀黍赤霉基因組約40 Mb，分布于4條染色體，可能有11 000-14 000個基因。

3.5 青霉（Penicillium）

3.5.1 指狀青霉（Penicillium digitatum） 指狀青霉是一種腐生真菌，是橘科水果采后重要的致病菌，能引起柑橘類綠霉病（Citrus green mould），世界范圍內90%的橘類水果損失是由指狀青霉引起的。指狀青霉的基因組測序有助于闡釋致病機制的遺傳基礎和高度的宿主特異性，檢測刺激代謝物基因簇，包括吲哚二萜，棒曲霉素鈣激活鉀通道阻斷劑。指狀青霉基因組約26 Mb，大約含有9 000個基因。

3.5.2 產黃青霉（Penicillium chrysogenum） 產黃青霉也稱為點青霉，是無性絲狀真菌，至今60年來一直用于生產青霉素，普遍的細菌類抗生素，是青霉素V和青霉素G商業的主要來源。菌株訓化用于提高青霉素的產量，主要是擴大基因組上產生青霉素的基因簇片段，目前青霉素的生物合成基因已經被清楚的鑒定注釋了。產黃青霉是單倍體，基因組約34.1 Mb，分布于4條染色體，可能有11 000-12 000個基因。

3.6 稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）

稻瘟病菌無性型稱Pyricularia grisea，是單倍體絲狀菌，是稻瘟病的病原體。稻瘟病是一種世界性水稻病害，每年因此病害損失的糧食可供養6 000萬人。由于水稻產量增加，近年來因稻瘟病造成的損失日益加大。雖然抗稻瘟病的水稻已經研究出來，但稻瘟病菌可迅速產生抗性。除了水稻，某些稻瘟病菌還可感染大麥、小麥、珍珠粟和草坪。稻瘟病菌是一種理想的研究植物病原真菌和宿主相互作用的模式生物。稻瘟病菌基因組約40 Mb，分布于7條染色體。

3.7 粗糙脈孢菌

粗糙脈孢菌屬于子囊菌亞門脈孢菌屬（Neurospora），是一種多細胞絲狀真菌，是20世紀現代遺傳學和分子生物學研究的模式物種。1941年Beadle和Tatum 兩位科學家通過X射線誘導處理粗糙脈孢菌，獲得了大量的營養缺陷突變體，在對這些突變體研究分析以后，提出了一個基因對應一種酶的假說。粗糙脈孢菌是單倍體雌雄異體子囊菌，僅能識別藍光/紫外光范圍，子囊孢子減數分裂產物的有序重排有利于基因重組分析。粗糙脈孢菌基因組約有40 Mb，分布于7條染色體。

3.8 穎枯殼針孢（Phaeosphaeria nodorum）

穎枯殼針孢無性型稱Stagonospora nodorum，屬于子囊菌半知菌亞門（Deuteromycotina），分生孢子器散生，是小麥的主要病害，主要為害小麥未成熟穗部和莖稈，也為害葉片和葉鞘，引起有重大經濟損害的禾草殼針孢葉斑病，也稱為小麥穎枯病。病害多發生于潮濕陰冷的氣候，多雨年份和潮濕地區發生尤其嚴重。穎枯殼針孢菌基因組約30 Mb，分布于24條染色體。

3.9 核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）

核盤菌屬于子囊菌亞門核盤菌屬（Sclerotinia），是已知具有最廣泛宿主的真菌病原體，危害作物和蔬菜，它引起如菜豆菌核?。╓hite mold of bean），向日葵爛盤型菌核?。℉ead rot of sunflower），油菜菌核?。╓hite mold of canola）和大豆菌核?。⊿clerotinia stem rot of soybean）。核盤菌是研究寄主-病原物相互作用的模型。核盤菌是單倍體，基因組38 Mb，分布于3條染色體。

3.10 里氏木霉（Trichoderma reesei）

絲狀真菌里氏木霉是多細胞的真核微生物，屬于半知菌亞門木霉屬（Trichoderm），其作為工業菌株用于分解不同植物材料的酶類，包括纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶等。里氏木霉對人體無毒性，在產酶條件下也不產生真菌毒素和抗生素，適合用于工業生產蛋白酶類。里氏木霉是單倍體，基因組33 Mb，分布于7條染色體。

3.11 禾柄銹菌（Puccinia graminis）

禾柄銹菌屬于擔子菌門，引起谷類作物，如小麥、燕麥、黑麥、大麥等的稈銹病。稈銹病，也稱為黑銹或稈黑銹病，是世界上最具破壞性的禾谷類作物病害。禾柄銹菌具有復雜的生命周期，包括5個孢子階段和兩個非常不同的宿主，即以雜草為初宿主，通常以小蘗屬植物為轉換寄主。因為初寄主專一性，禾柄銹菌有很多?；?，如Puccinia graminis f. sp.tritici可侵染小麥。禾柄銹菌為單倍體，基因組約80 Mb，分布于18條染色體。

3.12 玉米瘤黑粉菌（Ustilago maydis）

玉米瘤黑粉菌是一種擔子菌，通常以一種絲狀菌絲體存在，異宗配合。常為害玉米葉、稈、雄穗和果穗等部位的幼嫩組織，產生大小不一的病瘤，是我國玉米上分布最廣的主要病害之一，北方發生較為普遍而嚴重。在玉米瘤黑粉菌的生活史中，有兩種不同形態的細胞，即單倍體細胞（擔孢子）和雙核菌絲體。單倍體細胞沒有致病性，在特定培養基上芽殖產生“酵母”狀菌落。不同遺傳型的單倍體細胞融合形成雙核菌絲，雙核菌絲能在寄主植物體內迅速發育，刺激寄主組織形成腫瘤，并繼而經過細胞核融合，產生雙倍體的冬孢子。玉米瘤黑粉菌基因組約20 Mb，分布于23條染色體。

4 真菌基因組研究的應用及未來

比較基因組學（Comparative genomics）在對未知生物的基因組圖譜和測序基礎上，與已知基因和基因組結構進行比較，通過序列同源比對和計算機分析從而了解基因的功能、表達機理和物種進化。隨著已測序基因組數量的不斷增加，一方面，比較基因組學應用于基因鑒別及基因表達的調控元件的研究［15］；另一方面，比較基因組學能夠幫助鑒定親緣關系較近的物種之間的區別，包括致病性、次級代謝模式或其他特性［13，16，17］。大量預測到的微生物代謝物的生物合成基因所反映的不是標準的發酵條件下產生的，特殊條件下會激活這些基因。這些隱藏的基因簇大多編碼一些重要致病因子的生物合成，如毒素、藥物等，隨著高通量篩選平臺的發展，一些小分子在生物系統上的功能逐漸顯現出來?；蚪M挖掘和宏基因組分析技術，與相關基因分析工具組合分析大的生物合成基因簇，在異源源系中高效克隆表達，揭開棘手的或神秘的化合物的面紗，這個跨學科的研究領域已經打開了天然產物發現的新時代［18，19］。

基因組測序使得真菌次級代謝產物合成基因的鑒定快速發展，在絲狀真菌中，代謝相關基因一般是以基因簇（Genes clusters）的形式分布，經過基因組注釋后，在曲霉屬真菌中至少發現了30-40個典型基因簇存在，這些基因簇一般與聚酮體或非核糖體多肽的合成相關?；诤Ａ啃畔⒑捅容^基因組學的基因組采礦技術（Genome mining）能夠挖掘和鑒別一些真菌基因組中未知蛋白功能，在模式微生物構巢曲霉基因組隱藏的代謝途徑中分析發現了新的聚酮合酶-非核糖體肽合酶（PKS-NRPS）混合代謝物［3，20］。黑曲霉基因組數據經過精確的比對分析并結合代謝網絡的重構鑒定出了許多與DNA 復制、物質轉運和胞內/胞外酶生產相關的蛋白，豐富了黑曲霉發酵產檸檬酸的分子機制，同時預測出伏馬菌素和赭曲霉毒素A（OTA）合成的基因簇信息［4］。比較基因組學技術分析煙曲霉和米曲霉，提高了功能注釋和代謝途徑的模擬分析，分析表明3個物種間存在超過500個非編碼區域是保守的，為真菌基因組進化和基因調控研究提供新的理解［13］。

真菌毒素合成主要通過聚酮代謝PKS（Polyketide synthase）、NRPS非核糖體多肽合成（Nonribosomal peptide synthetase）、PKS-NRPS混合代謝、萜類化合物代謝、氨基酸相關代謝。PKS和NRPSs在大多數真菌基因組中都存在，導致了許多次生代謝物的物種多樣性，通常參與生物合成同一種代謝產物的基因位于同一個基因簇［21］。在克隆了幾個重要的黃曲霉毒素合成基因之后，黃曲霉毒素合成基因簇在黃曲霉和寄生曲霉中被發現［22］，有30個基因參與黃曲霉毒素的生物合成，黃曲霉毒素合成基因集中位于三號染色體大約75 kb的區域內，離端粒大約80 kb。碳黑曲霉（Aspergillus carbonarius）、赭曲霉（Aspergillus ochraceus）和疣狀青霉（Penicillium verrucosum）都能夠產生OTA，有研究認為PKS參與OTA合成的第一步，催化合成OTA的主體結構異香豆素。進化樹分析6個已知產OTA 菌株的PKSs序列的KS和AT結構域，證實不同真菌OTA PKS酶結構和進化的多樣性，KS和AT結構域被認為是PKS的保守區域，參與OTA的合成。Chiang等［3］采用基因組采礦技術結合代謝組學分析揭示了構巢曲霉中一個含有兩個真菌聚酮合酶的基因簇編碼一個聚酮化合物。經過比較基因組分析，在不同物種間僅有一小部分鑒定到的基因簇是保守的［23］。Callaghan等［24］采用基因組步移技術和序列比對分析，鑒定到在疣狀青霉上存在PKS基因，且與紅曲霉橘毒素合成基因簇同源性最高，在PKS上下游亦存在氧化還原蛋白和轉運蛋白，參與疣狀青霉OTA的合成。Atoui等［25］分析了9個赭曲霉和5個炭黑曲霉的KS結構域序列，結果表明KS結構域分布在5個不同的基因簇上，表明PKS基因具有不同的生物學功能。

Bhatnagar等［26］以解決黃曲霉毒素污染為例，綜述了采用基因組、蛋白組和代謝組的方法挖掘有用的信息，形成有效的戰略揭示真菌產生真菌毒素的機制，有助于開發具有真菌抗性的作物，減少作物的真菌毒素污染。Yu等［27］構建黃曲霉菌絲cDNA表達文庫，采用表達序列標簽（ESTs）技術分析營養和環境條件對黃曲霉毒素合成的影響，從7 218個表達序列中鑒定到110個序列影響黃曲霉毒素的合成。2011年，Yu等［28］采用RNA-Seq技術對不同溫度條件下黃曲霉轉錄組分析研究，表明在適合黃曲霉生長的37℃和適合黃曲霉產生黃曲霉毒素的30℃，存在1 153個差異表達基因，在30℃條件下30個黃曲霉毒素生物合成基因轉錄本的表達豐度是37℃條件下的3 300倍，鑒定到兩個溫度對毒素的負調控因子aflR和aflS。

大量真菌基因組陸續完成測序和注釋，產毒真菌的后基因組時代已經開啟，研究真菌基因組有助于人們理解不同生長環境下真菌的生理特性、形態差異、進化和代謝多樣性。后基因組學的研究，對于深入解析種植、生長、運輸、儲藏過程中產毒真菌菌群的發生和形成，真菌毒素的合成路徑及其調控機制、產毒真菌與農產品互作、危害儲糧品質的機理提供新的思路。

［1］Bennett JWKM. Mycotoxins［J］. Clin Microbiol Rev， 2003， 16：497-516.

［2］Hussein HS， Brasel JM. Toxicity， metabolism， and impact of mycotoxins on humans and animals［J］. Toxicology， 2001， 167：101-134.

［3］Chiang YM， Szewczyk E， Davidson AD， et al. A gene cluster containing two fungal polyketide synthases encodes the biosynthetic pathway for apolyketide， asperfuranone， in Aspergillus nidulans［J］. Journal of the American Chemical Society， 2009，131：2965-2970.

［4］Pel HJ， De Winde JH， Archer DB， et al. Genome sequencing and analysis of the versatile cell factory Aspergillus niger CBS 513.88［J］. Nature Biotechnology， 2007， 25：221-231.

［5］孫健冬， 高通量測序技術在農作物全基因組序列測定中的應用概覽［J］. 生物技術進展， 2012， 2（1）：11-15.

［6］王龑， 許文濤， 趙維薇， 等. 組學技術及其在食品科學中應用的研究進展［J］. 生物技術通報， 2011（11）：005.

［7］劉巖， 吳秉銓. 第三代測序技術：單分子即時測序［J］. 中華病理學雜志， 2011， 40（10）：718-720.

［8］Galagan JE， Calvo SE， Borkovich KA， et al. The genome sequence of the filamentous fungus Neurospora crassa［J］. Nature， 2003， 422：859-868.

［9］Wood V， Gwilliam R， Rajandream MA， et al. The genome sequence of Schizosaccharomyces pombe［J］. Nature， 2002， 415：871-880.

［10］余知和， 高元鋼， 曾昭清， 等. 真菌基因組學研究進展［J］.菌物學報， 2008， 27（5）：778-787.

［11］Nierman WC， Pain A， Anderson MJ， et al. Genomic sequence of the pathogenic and allergenic filamentous fungus Aspergillus fumigatus［J］. Nature， 2005， 438：1151-1156.

［12］Machida M， Asai K， Sano M， et al. Genome sequencing and analysis of Aspergillus oryzae［J］. Nature， 2005， 438：1157-1161.

［13］Galagan JE， Calvo SE， Cuomo C， et al. Sequencing of Aspergillus nidulans and comparative analysis with A. fumigatus and A. oryzae［J］. Nature， 2005， 438：1105-1115.

［14］Van den Berg MA， Albang R， Albermann K， et al. Genome sequencing and analysis of the filamentous fungus Penicillium chrysogenum［J］. Nature Biotechnology， 2008， 26：1161-1168.

［15］Andersen MR， Salazar MP， Schaap PJ， et al. Comparative genomics of citric-acid-producing Aspergillus niger ATCC 1015 versus enzyme-producing CBS 513.88［J］. Genome Research， 2011，21：885-897.

［16］Ma LJ， Van Der Does HC， Borkovich KA， et al. Comparative genomics reveals mobile pathogenicity chromosomes in Fusarium［J］. Nature， 2010， 464：367-373.

［17］Fedorova ND， Khaldi N， Joardar VS， et al. Genomic islands in the pathogenic filamentous fungus Aspergillus fumigatus［J］. Plos Genetics， 2008， 4：e1000046.

［18］Wilkinson B， Micklefield J. Mining and engineering natural-product biosynthetic pathways［J］. Nature Chemical Biology， 2007， 3：379-386.

［19］ Gross H. Genomic mining-a concept for the discovery of new bioactive natural products［J］. Current Opinion In Drug Discovery & Development， 2009， 12：207-219.

［20］ Bergmann S， Schümann J， Scherlach K， et al. Genomics-driven discovery of PKS-NRPS hybrid metabolites from Aspergillus nidulans［J］. Nature Chemical Biology， 2007， 3：213-217.

［21］ Gallo A， Knox BP， Bruno KS， et al. Identification and characterization of the polyketide synthase involved in ochratoxin A biosynthesis in Aspergillus carbonarius［J］. International Journal of Food Microbiology， 2014， 179：10-17.

［22］ Yu J. Current understanding on aflatoxin biosynthesis and future perspective in reducing aflatoxin contamination［J］. Toxins，2012， 4：1024-1057.

［23］ Brakhage AA， Schroeckh V. Fungal secondary metabolites strategies to activate silent gene clusters［J］. Fungal Genetics and Biology， 2011， 48：15-22.

［24］ O’Callaghan J， Coghlan A， Abbas A， et al. Functionalcharacterization of the polyketide synthase gene required for ochratoxin A biosynthesis in Penicillium verrucosum［J］. International Journal of Food Microbiology， 2013， 161：172-181.

［25］ Atoui A， Phong Dao H， Mathieu F， et al. Amplification and diversity analysis of ketosynthase domains of putative polyketide synthase genes in Aspergillus ochraceus and Aspergillus carbonarius producers of ochratoxin A［J］. Molecular Nutrition & Food Research， 2006， 50：488-493.

［26］ Bhatnagar D， Rajasekaran K， Payne G， et al. The ‘omics’ tools：genomics， proteomics， metabolomics and their potential for solving the aflatoxin contamination problem［J］. World Mycotoxin Journal， 2008， 1：3-12.

［27］ Yu J， Ronning CM， Wilkinson JR， et al. Gene profiling for studying the mechanism of aflatoxin biosynthesis in Aspergillus flavus and A. parasiticus［J］. Food Additives and Contaminants， 2007， 24：1035-1042.

［28］ Yu J， Fedorova ND， Montalbano BG， et al. Tight control of mycotoxin biosynthesis gene expression in Aspergillus flavus by temperature as revealed by RNA-Seq［J］. FEMS Microbiology Letters， 2011， 322：145-149.

（責任編輯 狄艷紅）

Advances in Studies on Genomics of Toxogenic Fungi

Wang Yan1，2Liu Yang1，2Liu Yining1
（1. Institute of Agro-Products Processing Science and Technology，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193；2. Key Laboratory of Agro-Products Processing，Ministry of Agriculture，Beijing 100193）

Mycotoxins， a group of toxins structurally related to secondary metabolites are produced by some fungal strains. It is mainly produced by filamentous fungi， including Trichoderma， Aspergillus， Chaetomium， Penicillium and Rhizopus， existed in agricultural products. Illustrating the genome sequence information of the pathogenic microorganisms in agricultural products， is essential to reveal fungal specific genetic traits. Until to December 2013， a total of 204 species in Ascomycetes and 62 species in Basidiomycete genomic information had been sequenced or published， genomes size from approximately 30 Mb to 40 Mb. This review here provides an overview of available genomic information of toxin-producing fungal or virulent fungus， summarizes the recent development in genome sequencing strategies and main fungal produced mycotoxin， and proposes the future direction of the comparative genomics research on fungi.

fungi；mycotoxin；agricultural products；genome；comparative genomics

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.004

2014-11-02

國家“973”計劃項目（2013CB127805），國家公益性行業（農業）科研專項（201203037），科技基礎性工作專項（2013FY113400）

王龑，女，博士，助理研究員，研究方向：農產品真菌毒素預防控制；E-mail：wangyan062006@163.com

劉陽，博士，研究員，研究方向：農產品真菌毒素防控和脫毒理論與技術及其應用；E-mail：liuyang01@caas.cn