實時熒光定量PCR快速檢測四種蛀果性害蟲

王鳳軍劉莎莎馮俊麗

（1.庫爾勒出入境檢驗檢疫局，庫爾勒 841000；2.浙江理工大學生物工程研究所，杭州 310018）

實時熒光定量PCR快速檢測四種蛀果性害蟲

王鳳軍1劉莎莎2馮俊麗2

（1.庫爾勒出入境檢驗檢疫局，庫爾勒 841000；2.浙江理工大學生物工程研究所，杭州 310018）

蘋果蠹蛾、香梨優斑螟、梨小食心蟲及地老虎是危害新疆香梨等產品的重要害蟲，前3種也屬于國際上檢驗檢疫重要蟲害。目前，國內主要依靠蟲體的形態特征對其進行鑒定，缺少分子生物學檢測手段，這限制了我國香梨等產品的生產和出口貿易發展。首先得到這4種害蟲的16S rDNA COI基因片段，在差異序列設計特異性的引物和探針，利用實時熒光定量PCR技術建立快速分子檢測試驗體系，依據標準曲線分析檢測體系的重復性和靈敏性。結果表明，蘋果蠹蛾、香梨優斑螟、梨小食心蟲及地老虎最低檢出限分別在1.605×10-2、0.729×10-2、0.475×10-2和0.818×10-2ng/μL，滿足檢驗檢疫日常檢測需求。為克服實際檢測過程中經常會出現某一蟲的殘片樣本或者幾種蟲聚集在一起的混合樣本，使用了單頭、多頭DNA樣本及4種害蟲的混合DNA樣本進行檢測分析，進一步驗證了該方法的特異性，可靠性和可適用性。

蘋果蠹蛾；香梨優斑螟；梨小食心蟲；地老虎；實時熒光定量PCR

庫爾勒香梨是新疆巴州特色優質水果，已有1 400多年的栽培歷史，現種植面積約4.667×104hm2，作為新疆唯一獲準進入北美等高端市場的水果，已出口至東南亞、美洲、澳洲等20多個國家。在香梨出口貿易中，各主要香梨輸入國都與我方簽署有雙邊植物檢疫議定書，比較關注蘋果蠹蛾（Laspeyresiapomonella L.）、梨小 食心蟲（Grapholitha molesta Busck）、香梨優斑螟（Euzophera pyriella Yang）等主要蟲害。

目前，憑借形態學特征只能區分成蟲和晚齡期害蟲，大多數有害生物較短暫的幼蟲階段很難依靠形態學特征精確區分。蘋果蠹蛾、梨小食心蟲、香梨優斑螟等有害生物的幼蟲基本在香梨采收時大量出現，有時僅剩殘體，而香梨輸入國對截獲的檢疫性有害生物和一般有害生物的貨物處理、制裁和出口限制等差別很大。此類害蟲的鑒定方法不成熟和分辨率低增加了香梨出口風險。近年來，國際上一些學者利用分子生物學方法對部分害蟲進行鑒定，如新西蘭Chen等［1］利用跨物種PCR擴增的方法，分析了蘋果蠹蛾、梨小食心蟲等4種近似種的33個微衛星位點，用于區分這些昆蟲的種群和其基因流；美國Barcenas等［2］利用通用引物對蘋果蠹蛾、杏小卷蛾、櫻小卷蛾等幾種國際檢疫性害蟲COI基因一段保守性序列（約470 bp）進行了克隆、測序、分析、比對，設計了針對每種害蟲的特異性熒光定量PCR引物和探針序列，能準確檢測和區分這幾種害蟲。

為改變香梨在出口貿易中有害生物檢測鑒定的被動局面，本研究建立了簡易可行、準確快速的試驗檢測平臺，能夠精確區分出口香梨中可能存在的形態學相似的有害生物，降低香梨出口風險。

1 材料與方法

1.1 材料

蘋果蠹蛾、香梨優斑螟、梨小食心蟲、地老虎DNA均由庫爾勒出入境檢驗檢疫局提供。

DNA提取試劑盒（Qiagen公司）；TaKaRa TaqTMHot Start Version（TaKaRa公司）；Recombinant Taq DNA Polymerase TaKaRa TaqTM（TaKaRa公司）；50 bp DNA Ladder（TaKaRa公司）；TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒（TaKaRa公司）；TaKaRa Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）試劑盒（TaKaRa公司）。PCR儀：Bio-Rad公司；凝膠成像分析系統：TANON公司；ABI7500實時熒光定量PCR儀：美國應用生物系統公司；ND2000C核酸蛋白分析儀：美國熱電公司；1-14ED小型離心機：德國Sigma 公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品DNA提取 庫爾勒出入境檢驗檢疫局在沙依東園藝場，庫爾勒市和農二師各團場注冊果園開展有害生物調查，收集蘋果蠹蛾、梨小食心蟲、香梨優斑螟等有害生物的幼蟲到成蟲各階段的蟲體及殘骸樣本，經傳統形態學鑒定后分類保存；使用DNeasy Blood & Tissue Kit試劑盒提取總DNA，并經DNA電泳和核酸蛋白分析儀檢測提取的質量和濃度。樣品提取時所用的肌肉組織量：蘋果蠹蛾：單頭 2.5-5.0 mg，多頭（4-5只）16-18 mg；梨小食心蟲：單頭1 mg，多頭（12-13只）12-16 mg；香梨優斑螟：單頭2 mg，多頭（3-5只）10 mg；地老虎：單頭10 mg；單頭加30 μL緩沖液進行洗脫，多頭加60 μL緩沖液洗脫。DNA溶液于-20℃保存備用。

1.2.2 引物和探針設計 從NCBI數據庫檢索蘋果蠹蛾、梨小食心蟲、香梨優斑螟、地老虎COI特征序列，經BLAST后用DNA-star等軟件比較其序列同源性，篩選出合理的目的片段基因后導入Primer premier 5.0進行引物設計，使用通用引物擴增COI基因片段，通過克隆測序，比對分析序列差異性，并在差異性區域設計種屬特異性的引物，引物合成由TaKaRa（大連，中國）公司完成，表1所示。

表1 本試驗所用引物序列

1.2.3 目的基因的定性PCR擴增檢測 用1.2.2設計的4對引物分別對4種樣品DNA進行PCR擴增，檢測設計引物的特異性。反應體系：在200 μL 薄壁管中依次加入10×LA PCR BufferⅡ2 μL，dNTP mixture 3.2 μL，上下游引物各0.5 μL，模板1 μL，Taq HS 0.2 μL，加ddH2O至20 μL。反應程序為：94℃預熱1 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，共35個循環；最后72℃延伸5 min。反應結束后取5 μL擴增反應液，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。將PCR產物送Invitrogen公司測序，每種測序2-3個重復。

1.2.4 DNA測序與探針設計 蘋果蠹蛾、梨小食心蟲、香梨優斑螟以及地老虎的PCR產物測序結果經分析后，通過NCBI中的BLAST比對，篩選出合理的目標片段基因，再導入ABI Primer Express 3.0和DNAMAN軟件進行探針設計。在上下游引物間區域設計種屬特異性的熒光探針，委托TaKaRa公司合成，表2所示。

表2 本試驗所用探針序列

1.2.5 實時熒光定量PCR反應 反應體系（20 μL）含Premix Ex Taq（Probe qPCR）（2×） 10.0 μL，上下游引物（10 μmol/L）0.4 μL，探針（10 μmol/L）0.8 μL，ROX Reference Dye（50×） 0.4 μL，DNA 模板1.0 μL，ddH2O 7.0 μL。反應參數設置為：95℃預變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火/延伸34 s，共40個循環。每個反應3個重復。

1.2.6 用標準曲線進行反應評估 4種蛀果害蟲的DNA經系列梯度稀釋后擴增，得出Ct值，構建標準曲線，判定反應的效率、重復性和檢測范圍。本試驗將4種DNA分別進行5個濃度稀釋（1×、10×、100×、1 000×、104×），稀釋后進行熒光定量PCR擴增。繪制標準曲線，計算出樣本標準差（s），并分析結果。

1.2.7 單多頭DNA檢測 將每種DNA按單多頭分別進行擴增反應，檢驗DNA的單多頭取樣對后續擴增反應以及對引物探針特異性的影響。

1.2.8 DNA混合試驗檢測 將4種DNA進行混合，用4對引物以及對應的探針擴增，檢測混合樣本對擴增反應以及特異性的影響。

1.2.9 數據處理 實時熒光定量PCR反應結束后，由軟件ABI7500 Sequence Detection Software自動對試驗數據進行分析，得到各個反應的Ct值。在1.2.6反應結束后，制作關于DNA濃度對數和Ct值的標準曲線，計算標準曲線的斜率和R2值，檢測曲線的線性程度，以及推算出對應的每種DNA的擴增效率，檢測擴增反應的靈敏性和特異性。

2 結果

2.1 普通定性PCR檢測結果

蘋果蠹蛾、香梨優斑螟、梨小食心蟲及地老虎的PCR產物測序結果經分析后，通過NCBI中的BLAST比對COI特征序列，序列同源性分別達99%（如與蘋果蠹蛾FJ217755.2、FJ217756.2和FJ217764.2等序列比對）、97%（如與香梨優斑螟KC215198.1、KC442311.1和KC442309.1等序列比對）、99%（如與梨小食心蟲AB603521.1、HQ5384-66.1和JF733841.1等序列比對）、99%（如與地老虎JX392593.1、JX392592.1和JX392591.1等序列比對）。并且，用針對蘋果蠹蛾、香梨優斑螟、梨小食心蟲和地老虎COI特征序列設計的4組引物對應擴增4種COI序列片段，電泳結果（圖1）中都只出現一條帶，表明4對引物的擴增特異性

2.2 實時熒光定量PCR檢測結果

利用所選擇的引物和探針序列進行熒光PCR擴增驗證，得到的擴增曲線（圖2），每一組引物和探針只能擴增目的DNA，其余對照樣品無熒光信號，結果表明設計的引物和探針可以保證擴增的特異性。

2.3 重復性和靈敏性檢測結果

根據熒光定量PCR反應得到的Ct值，繪制出了4個檢測基因的標準曲線（圖3）。標準曲線R2分別為0.998 9、0.997 6、0.990 0和0.973 8，斜率分別為-3.351 1、-3.275 3、-3.402 0和-3.105 4，計算出4個檢測基因在檢測濃度范圍內的擴增效率分別為98.79%、101.98%、96.74%和109.9%。結果表明，蘋果蠹蛾、香梨優斑螟、梨小食心蟲及地老虎DNA溶液分別在1.605×10-2-160.5、0.729×10-2-72.9、0.475×10-2-47.52和0.818×10-2-81.78 ng/μL的檢測范圍內，熒光定量PCR起始模板濃度和Ct值之間具有較好的線性關系。由此確定這4個檢測基因分別在模板質量濃度為1.605×10-2、0.729×10-2、0.475×10-2和0.818×10-2ng/μL時為有效擴增，即該質量濃度為最低檢出限。

圖1 引物對應擴增蘋果蠹蛾、香梨優斑螟、梨小食心蟲和地老虎COI DNA的定性PCR檢測結果

圖2 蘋果蠹蛾（A）、香梨優斑螟（B）、梨小食心蟲（C）和地老虎（D）COI 基因片段的實時熒光定量PCR擴增曲線

2.4 四種害蟲的熒光定量PCR檢測

將所建立的熒光定量PCR檢測體系應用于蘋果蠹蛾、香梨優斑螟、梨小食心蟲和地老虎的日常檢測。將這4種害蟲的單、多頭DNA樣品和混合DNA樣品分別用4組引物和探針組合擴增，結果顯示各樣品只有特異的引物和探針組合才能得到擴增，各個反應的PCR擴增Ct值匯總如表3所示。

3 討論

蘋果蠹蛾、梨小食心蟲、香梨優斑螟等有害生物的幼蟲基本在香梨采收時大量出現，有時僅剩殘體，而香梨輸入國對截獲的檢疫性有害生物和一般有害生物的貨物處理、制裁和出口限制等差別很大。針對此類害蟲的鑒定方法不成熟和分辨率低大大增加了香梨出口的風險。檢疫性害蟲的傳統鑒定方法是通過形態學特征來識別，主要依賴于經驗豐富的昆蟲分類學專家。但對于殘片、蟲卵、形態學上難以區分的幼蟲，形態學的鑒定就受到局限，同時鑒定所需時間長，不適合檢驗檢疫部門快速檢疫通關的要求［3］。近年來，以COI 條形碼為目的片段，通過設計特異引物的特異性PCR檢測鑒定方法已經開始用于一些昆蟲種類的鑒定和區分［4-6］。

圖3 蘋果蠹蛾（A）、香梨優斑螟（B）、梨小食心蟲（C）和地老虎（D）DNA溶液在檢測范圍內的標準曲線

表3 四種害蟲熒光定量PCR檢測結果

在熒光定量PCR試驗分析體系的建立過程中，引物的設計是關鍵一步，要考慮到諸多因素。其中，Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度，以55-80℃為宜，上下游引物間的Tm值差異最好在10℃以內。G+C含量一般以40%-60%為好，上下游引物間的G+C含量差異在20%以內最好，這樣可以適當提高引物的特異性。一般退火溫度比Tm值低5-15℃［7］。另外，要避免引物中含有連續的G或C，但在引物的末端可以含G或C。本試驗采用的4對引物的退火溫度大多控制在56℃左右，這樣就保證了它們在同樣的PCR體系中能很好的擴增，達到檢測目的。在PCR擴增反應的優化過程中，采用了適當提高退火溫度的方法，盡可能保證引物的特異性。本試驗所建立的熒光定量PCR擴增體系對蘋果蠹蛾、香梨優斑螟、梨小食心蟲和地老虎的檢測特異性強，每組引物和探針只能擴增目的DNA，其他干擾DNA無熒光信號。

檢出限是指檢測系統中可檢測的最低分析物濃度，又稱分析靈敏度［8］，分為定性和定量檢測低限，其中定性檢測低限可再分為絕對和相對檢測低限兩種。絕對檢測低限是指能被檢測到的最低數量的原始模板拷貝或濃度。實時熒光定量PCR通過建立模板DNA濃度稀釋梯度的標準曲線計算檢出限。將標準曲線上的斜率代入公式E=10（-1/slope）-1，計算擴增效率，理想的擴增效率應在90%-110%之間［9，10］，本研究4個檢測基因擴增效率分別為98.79%、101.98%、96.74%和109.9%，在可接受的PCR擴增效率范圍內［9］。在最高稀釋度的樣品中，4個檢測基因均得到擴增，Ct值接近檢測臨界限（Ct=35）［8，11］，結果表明本試驗建立的分子檢測體系靈敏度較高，4種害蟲的最低檢出限分別在1.605×10-2、0.729×10-2、0.475×10-2和 0.818× 10-2ng/μL，滿足檢驗檢疫日常檢測需求。

由于在實際檢測過程中，經常出現某一蟲的殘片樣本或者幾種蟲聚集在一起的混合樣本，本試驗使用了單頭、多頭DNA樣本及4種害蟲的混合DNA樣本進行檢測分析，驗證了該方法的特異性，可靠性和可適用性。此外，在實際的檢驗檢疫工作中，對于未知害蟲樣本，為節約試劑和縮短檢測時間，有可能需要用多對引物和探針組合來進行檢測。

4 結論

本研究通過設計引物和探針，DNA測序，實時熒光定量PCR反應，建立了蘋果蠹蛾、梨小食心蟲、香梨優斑螟和地老虎4種害蟲分子生物學鑒定方法，克服了只能通過形態學鑒定的限制。本試驗還通過繪制標準曲線、單多頭檢測以及混合DNA檢測，多方面驗證引物和探針的特異性，檢測體系的重復性和靈敏性。

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（責任編輯 狄艷紅）

Rapid Identification of Four Kinds of Decay Fruit Moths by Real-time Fluorescence Quantitative PCR

Wang Fengjun1Liu Shasha2Feng Junli2
（1. Korla Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Korla 841000；2. Institute of Bioengineering，Zhejiang Sci-Tech University，Hangzhou，Zhejiang 310018）

Laspeyresia pomonella， Euzophera pyriella Yang， Grapholitha molesta and Blank cutworm are important pets of fragrant pears and other fruits in Xinjiang， and they are also internationally important pests on inspection and quarantine. However， the identification relies mainly on morphological characters up to date. The lack of molecular detection methods greatly limits the international export trading of fragrant pears and related products. The 16S rDNA COI fragments from the four pests were cloned and sequenced. Then， specific primers and probes were designed according to the sequencing data， and the fluorescence Real-time quantification PCR detection system was established. The results demonstrates the limits of detection concentration of Laspeyresia pomonella， Euzophera pyriella Yang， Grapholitha molesta and Blank cutworm in this system are respectively 1.605×10-2，0.729×10-2，0.475×10-2and 0.818×10-2ng/μL， meeting the demand of inspection and quarantine routine testing. To overcome the residual bodies of some insects and some pieces mixed samples， or several insects together mixed samples appeared in actual testing process， DNA extracted from single， multiple and mixed pest samples were detected and evaluated， further verifying the specificity of this method， the reliability and applicability.

Laspeyresia pomonella；Euzophera pyriella Yang；Grapholitha molesta；Blank cutworm；Real-time fluorescence quantitative PCR

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.011

2014-09-26

國家質量監督檢驗檢疫總局資助項目（2012IK290），庫爾勒市重點科技項目

王鳳軍，女，碩士，工程師，研究方向：植物病害和轉基因檢測；E-mail：wfj0808@126.com，劉莎莎為共同第一作者

馮俊麗，女，博士，研究方向：病原微生物的分子檢測、檢驗檢疫害蟲的分子鑒定；E-mail：fengjunli0722@foxmail.com