利用原生質體融合技術選育淀粉發酵產DHA的新型裂殖壺菌

王迪路福平王海軍李德茂陳樹林張可

（1. 天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2. 中國科學院天津工業生物技術研究所 天津市工業生物系統與過程工程重點實驗室，天津 300308）

利用原生質體融合技術選育淀粉發酵產DHA的新型裂殖壺菌

王迪1路福平1王海軍1李德茂2陳樹林2張可2

（1. 天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2. 中國科學院天津工業生物技術研究所 天津市工業生物系統與過程工程重點實驗室，天津 300308）

以生產DHA的裂殖壺菌（Schizochxtrium）B4D1和黑曲霉（Aspergillus niger）CGMCC 3.316為出發菌株，利用原生質體融合技術選育可以利用淀粉發酵生產DHA的新型裂殖壺菌。用裂解酶制得了兩親本的原生質體，通過研究兩親本培養時間、培養方法、酶解時間等條件對原生質體產量影響的基礎上，以PEG介導進行了原生質體的融合，最終確定了原生質體融合最佳條件為40%的 PEG6000，融合溫度30℃，融合時間為10 min，在此條件下融合率可達1.9%。通過比較菌落外觀、顏色、形態以及分離培養篩選獲得了一株利用淀粉裂殖壺菌融合子。經過RAPD驗證表明B4D1與CGMCC 3.316發生了重組，融合菌株表達了更多源于B4D1的遺傳信息。

裂殖壺菌；DHA；原生質體；融合；淀粉

二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，簡稱DHA），是人體所必需的一種多不飽和脂肪酸，能夠輔助嬰幼兒腦細胞發育，而且還具抗衰老和降低血脂、改善血液循環、抑制腫瘤等功效［1，2］。因此，DHA己經廣泛應用于生產嬰幼兒食品、保健食品和輔助治療劑等產品。由于裂殖壺菌DHA含量高、生長快、易于培養、對人畜無毒害，目前是一種極具生產前景的DHA微生物資源［3］。

國內外的研究主要集中在用裂殖壺菌以葡萄糖為底物高效發酵產DHA［4，5］，但是葡萄糖原料比較貴，導致產品價格比較高。淀粉相對于葡萄糖來講是一種量大、價廉的底物，通常在工業生產中，必需先將淀粉以酶法或酸法制成淀粉水解糖，再加以利用［6］。如果能選育出可直接以淀粉為碳源生產DHA的優良菌株，將會大大簡化生產程序，降低生產成本。

原生質體融合是一種基因重組技術，指通過人為的方法，將遺傳性狀不同的兩個細胞的原生質體進行融合，借以獲得兼有雙親遺傳性狀的穩定重組子的過程。這種方法打破了微生物的種界界限，可發生在種內、種間，甚至親緣很遠的兩個物種之間，可以擴大融合頻率和幅度，是一種常見的育種方法。原生質體融合與常規雜交相比有很多優勢，不但能顯著提高重組頻率，而且具有定向育種的含義，目前該技術已成為細胞生物學迅速發展的方向之一［7］。

針對裂殖壺菌不能利用淀粉的問題，本試驗采用原生質體融合技術，選取高效利用淀粉的黑曲霉和DHA高產菌株裂殖壺菌B4D1，通過兩親本對碳源的利用不同，滅活后進行原生質體融合，篩選出能以淀粉為碳源生產DHA的融合菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 裂殖壺菌 B4D1本實驗室保存；黑曲霉CGMCC 3.316購于中國科學院微生物研究所普通菌種保藏中心。

1.1.2 培養基 斜面培養基：PDA培養基。菌絲生長培養基［8］：1.2%葡萄糖，0.2% KH2PO4，0.05% MgSO4，0.04% NaH2PO4，0.1% NH4NO3，0.1%微量元素（4% CuSO4，1.1% ZnSO4，0.6% MnSO4，0.1% FeSO4，0.03% CoCl2，0.06% H3BO3，pH5.8）。淀粉培養基：可溶性淀粉5 g/L，蛋白陳10 g/L，酵母粉5 g/L，海水晶15 g/L，瓊脂20 g/L，用HPBS配置。以上培養基121℃滅菌20 min。

GYP培養基［9］：葡萄糖20 g/L，蛋白陳10 g/L，酵母粉5 g/L，海水晶15 g/L，115℃滅菌20 min。

高滲培養基用高滲緩沖液HPBS配置，固體培養基添加2%瓊脂［10］。

1.1.3 試劑 緩沖溶液PBS：0.2 mol/L磷酸緩沖溶液，pH5.8，121℃滅菌 20 min。高滲緩沖液HPBS： PBS中添加0.7 mol/L的KCl。預處理劑0.3% β 巰基乙醇-0.1% EDTA［11］：于PBS中添加0.1% EDTA，121℃滅菌20 min。臨用前添加0.3% β 巰基乙醇。酶液［12］：溶壁酶（Lysing enzyme）購自Sigma公司。稱取裂解酶，懸于HPBS中充分振蕩并靜置，使之完全溶解，至濃度為5 mg/mL。經0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，保存于4℃冰箱備用。促溶劑：PEG6000用HPBS配制成一定質量濃度的的溶液，121℃滅菌20 min。

1.1.4 主要儀器設備 超凈工作臺、高壓滅菌鍋、恒溫搖床、恒溫水浴箱、顯微鏡、離心機、紫外凝膠成像儀、研缽、培養皿、移液槍、試管、錐形瓶、離心管等。

1.2 方法

1.2.1 菌體培養及收集 黑曲霉菌絲培養：將原始菌種轉接至PDA斜面固體培養基上，待孢子生長成熟后，用PBS洗脫孢子，調整孢子濃度為108個/mL，以10%的接種量接入菌絲生長培養基中，250 mL三角瓶裝液量50 mL，搖床轉速200 r/min，培養溫度30℃，培養時間12-15 h，收集培養液置于滅菌的50 mL離心管中，4 000 r/min 離心10 min，用PBS緩沖液洗滌離心2次［13］，棄上清液，保留菌絲體。

裂殖壺菌菌體培養：將B4D1菌株接種于GYP液體培養基，25℃、180 r/min 條件下培養24-48 h，收集培養液15 mL于滅菌的50 mL離心管中，4 000 r/min離心10 min，用PBS緩沖液洗滌離心兩次，收集菌體。

1.2.2 原生質體的制備 黑曲霉原生質體的制備：向黑曲霉菌絲體中加入酶液，酶液按照 Wmycelium/ Venzymesolution=1∶10（g/mL）加入［14］，25-38℃，100 r/min恒溫振蕩酶解，酶解結束后，酶解液經4層高級擦鏡紙過濾，濾液離心（4 000 r/min，10 min），高滲緩沖液HPBS洗滌兩次，棄上清，收集原生質體并重懸于10 mL高滲緩沖液HPBS中，血球板計數。

裂殖壺菌原生質體制備：經洗滌的菌體加入預處理劑［7］10 mL，30℃，180 r/min恒溫振蕩30 min，用HPBS緩沖也洗滌離心（4 000 r/min，10 min），加入酶液至菌體濃度為107/mL，25-38℃，100 r/min恒溫振蕩酶解一段時間，酶解結束后，酶解液離心（4 000 r/min，10 min）［7］。用高滲緩沖液HPBS洗滌兩次，重懸于10 mL高滲緩沖液HPBS中。取1 mL原生質體懸液，經高滲溶液HPBS適當稀釋，用再生培養基傾注法培養2-4 d，計算菌落數。

1.2.3 黑曲霉原生質體滅活 取黑曲霉原生質體細胞懸液5 mL在55℃水浴中，不同時間滅活后，經高滲溶液HPBS適當稀釋，用再生培養基傾注法測定細胞數，計算致死率。

1.2.4 原生質體融合 取B4D1原生質體和滅活后的黑曲霉原生質體懸液（濃度106個/mL）在離心管中等量混合，于 4℃冷凍離心機中4 000 r/min 離心10 min，棄上清，加入促溶劑，混勻后放入20-40℃、轉速為 100 r/min 的恒溫搖床中數分鐘以待融合；取出融合后的原生質體懸液4℃冷凍離心后用HPBS緩沖液離心洗滌兩次，以將融合劑洗凈，將洗滌后的原生質體重懸于 HPBS緩沖液中，得到融合后的原生質體用高滲淀粉培養基傾注法25℃培養3-5 d，檢出融合子，測定細胞數［15］。

1.2.5 計算公式 原生質體形成率、再生率、滅活率和融合率的計算公式參考文獻［2，16］。

1.2.6 融合子篩選 挑選能夠在高滲淀粉培養平板上生長的菌落，根據裂殖壺菌菌落形態初步檢出融合子，然后轉接入含有200 μL GYP 培養基的96孔板中，于 25℃ 180 r/min發酵3 d。以出發菌株B4D1作為對照，用尼羅紅檢測初步檢測油脂含量［17］，篩選油脂產量較高的融合子接入淀粉培養基，發酵6 d，氣相檢測DHA。

氣相色譜法條件為：島津GC-2010氣相色譜儀，色 譜 柱：SP-2560（100.0 m×0.25 mm×0.20 μm）。N2為載氣，采用程序升溫，起始溫度140℃，保持5 min，然后以4℃/min的速度升至240℃，保持11 min。FID檢測器，進樣口溫度為250℃，檢測器溫度為280℃。采用分流進樣，分流比為30，進樣量為1 μL。

1.2.7 融合菌株的穩定性檢驗 對篩選得到的融合菌株連續傳代10次，測定細胞干重和油脂含量，檢驗融合子的遺傳穩定性。

1.2.8 融合菌株的鑒定 應用 RAPD 技術對融合菌株進行鑒定，分析親本與融合菌株之間的遺傳相似性和遺傳距離［18］。

RAPD 的引物篩選：用20個10 bp的寡核苷酸引物對親本基因組 DNA 進行 PCR 擴增，從中篩選擴增條帶清晰、重復性好、多態性高的引物，用于全部樣本的擴增。反應體系（25 μL）：DNA 模板 0.5 μL，2×EasyTaq PCR SuperMix 12.5 μL，隨機引物 0.5 μL，無菌雙蒸水 11.5 μL。反應程序為：94℃預變性5 min；94℃ 變性 30 s，37℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，40 個循環；72℃延伸 8 min，4℃保存。

PCR 擴增反應結束后，采用 1×TAE 電泳緩沖液，用 1%瓊脂糖凝膠在電壓為 120 V 的電場中電泳 20 min，GoldView染色。在紫外凝膠成像儀上觀察并拍照，記錄結果。

數據處理：按照公式相似系數Sxy=2· Nxy/（Nx+Ny）×100%獲得各樣品間的遺傳相似度，其中Nxy是比較后兩種材料x和y共有的DNA片段數目，Nx和Ny分別為材料x和y各自的DNA擴增片段數目。再由 D=1-S 獲得相應的遺傳距離［6］。

1.2.9 培養基淀粉含量的測定 將融合子在淀粉培養基中發酵培養，每隔24 h取樣測定培養基中淀粉含量，方法參考文獻［19］。

2 結果

2.1 裂殖壺菌和黑曲霉原生質體制備與再生條件的確定

2.1.1 菌齡對原生質體形成的影響 細胞壁的成分和結構在細胞不同的時期有所不同，因而細胞對酶的敏感性有差異。通過測定生長曲線及不同培養時期細胞原生質體形成率，發現裂殖壺菌和黑曲霉原生質體化的較適菌齡分別為36 h和15 h左右，約處于對數生長早期。

2.1.2 酶解溫度和時間對原生質體形成的影響 選擇原生質體最佳的制備條件不僅要使原生質體制備率達到最高，同時還要考慮原生質體再生率不能過低，因此原生質體制備條件要在選擇保證原生質體再生率的同時選擇原生質體制備率最高的條件。由圖1-圖4結果可確定裂殖壺菌B4D1的最佳原生質體制備條件：酶作用溫度為 32℃，酶作用時間為 60 min，黑曲霉的最佳原生質體制備條件：酶作用溫度為 32℃，酶作用時間為2.5 h。

圖1 裂殖壺菌原生質體制備作用溫度

圖2 黑曲霉原生質體制備作用溫度

圖3 裂殖壺菌原生質體制備作用時間

圖4 黑曲霉原生質體制備作用時間

2.2 黑曲霉原生質體的滅活及融合條件的確定

2.2.1 原生質體滅活條件的選擇 滅活的目的是為了標記融合子，即讓親本黑曲霉原生質體全部致死，而經過融合后所生長的即為融合二倍體，所以滅活率需達到 100%。原生質體熱滅活的試驗結果，如圖5所示。為保證原生質體的滅活率為 100%，最后確定黑曲霉高溫滅活溫度為 55℃，時間為20 min。

圖5 不同作用時間對黑曲霉原生質體的滅活效果

2.2.2 促溶劑PEG6000質量分數的影響 由于PEG6000對原生質體的毒性和原生質體對有機質穩定劑的敏感性，PEG6000質量分數不能過大，否則融合頻率會迅速下降。由圖6可知，融合率隨PEG6000 濃度升高增加到1.9%當濃度超過60%時，融合率下降到0.7%。因此選擇 PEG6000 濃度為40%作為原生質體融合時的 PEG 濃度。

圖6 PEG濃度對融合率的影響

2.2.3 融合時間的影響 分別選取1、5、10、15和20 min進行融合，測定融合率如圖7 所示，隨著融合時間增加到10 min時，融合率提高到1.2%，當融合時間繼續增加到20 min 時，原生質體的融合率則降為0.3%，因此為了獲得最大的融合率，選擇10 min 作為原生質體的融合時間。

圖7 融合時間對融合率的影響

2.2.4 融合溫度的影響 溫度在一定程度上影響原生質體融合率，較高的溫度可以增加性細胞膜流動性，降低 PEG 黏度，有助于原生質體的融合。由圖8可知，融合溫度上升到 30℃時，原生質體融合率提高到1.1%。溫度繼續升高后，融合率降低至0.6%。因此選擇 30℃作為融合溫度。

圖8 融合溫度對融合率的影響

2.3 融合子的獲得

2.3.1 融合子篩選 由于裂殖壺菌不能利用淀粉，因而無法在淀粉篩選培養基上生長，只有融合了黑曲霉的新型裂殖壺菌才能生長，從原生質體融合后的淀粉高滲培養基平板上，分離篩選了5株在25℃生長旺盛，菌落形態與黑曲霉菌株不同而與裂殖壺菌形態相同的淡黃色菌株，編號為M-1-M-5，然后接種到含200 μL的GYP培養基的96孔板進行發酵培養，B4D1為對照，用尼羅紅檢測油脂含量，結果表明M-3菌株油脂含量和親本B4D1產油量相當。將M-3發酵6 d后，經氣相色譜法檢測（圖9），對比DHA標準品可知，融合得到的新型裂殖壺菌具有產DHA能力，而且其可以在淀粉為碳源的培養基上生長，具有雙親本的特性。

圖9 融合子M-3油脂氣相色譜圖

2.3.2 融合菌株穩定性分析 融合菌株M-3經過10次傳代，仍然能夠在淀粉培養基上穩定生長，并且由表1可以看出產油性狀穩定。

表1 M-3培養1代和5代干重和油脂含量的比較

2.4 融合子M-3的RAPD分析

2.4.1 RAPD擴增結果 從20個隨機引物中篩選出條帶清晰、穩定性好的8個引物，分別為P1（GTTTCGCTCC）、P4（GGACTGGAGT）、P5（TGCGCCCTTC）、P10（CTGCTGGGAC）、P11（GTAGACCCGT）、P15（GGAGGGTGTT）、P19（ACCCCCGAAG）、P20（GGACCCTTAC），對親本B4D1、CGMCC 3.316及融合子M-3的基因組DNA進行PCR擴增，擴增出的隨機片段大都在500-2000 bp，結果見圖10。親本B4D1、CGMCC 3.316及其融合子M-3基因組DNA擴增的RAPD帶譜存在差異。同一引物對兩親本和融合子擴增的RAPD條帶也存在一定的差異。融合子M-3的條帶有的與B4D1相同，有的與CGMCC 3.316相同，說明融合子M-3的基因組DNA既有與B4D1同源的序列，又有與CGMCC 3.316同源的序列。表明在基因水平上，B4D1與CGMCC 3.316發生了重組，得到了融合菌株M-3。

圖10 部分引物對親本及其融合子的 RAPD 擴增圖譜

2.4.2 遺傳相似系數分析 根據表2的數據計算M-3與兩親本的相似系數：SSM=0.698，SMC=0.34，SSC=0.182；DSM=0.302，DMC=0.66；DSC=0.818。融合菌株 M-3與親本B4D1的遺傳相似系數大于與親本CGMCC3.316的遺傳相似系數，表明融合菌株M-3與親本B4D1的遺傳關系更近，或者M-3表達了更多源于B4D1的遺傳信息。

表2 八種隨機引物的擴增譜帶

2.5 培養基剩余淀粉含量測定

用淀粉培養基培養融合子M-3，測定培養基中剩余淀粉含量結果見圖11。由圖11可看出，隨著時間增加，淀粉含量不斷減少，從最初5 g/L減少到2.91 g/L，說明融合子可以利用淀粉。

圖11 培養基中淀粉含量隨時間變化曲線

3 討論

原生質體融合技術具有重組頻率高，遺傳物質完善，容易獲得性狀優良和生產量高的融合菌等優點，已被廣泛應用于各種研究工作中。本試驗通過利用雙親對某種碳源利用狀況的差異作為篩選標記進行原生質體融合，得到了同時可以產油脂以及以淀粉作為碳源生長的融合菌株M-3，大大減輕了背景干擾，提高了菌種篩選效率。

徐新立等［20］將油脂高產菌深黃被孢霉3.3410和具有高纖維素活性的黑曲霉SL2-111進行原生質體融合，篩選得到能直接利用纖維素原料的產油菌株。其黑曲霉原生質體制備濃度達到7.2×107個/mL，再生率達到28.6%，而本試驗只達到8.7×105個/mL的原生質體濃度和28.4%的再生率。后續研究需要進一步提高黑曲霉原生質體的制備率以及再生率。張淑君等［21］利用桑樹內生菜豆殼球孢菌分別與綠色木霉及長柄木霉進行融合，同樣獲得了以纖維素鈉作為唯一碳源產油脂的融合菌株，油脂產量及含量均高于親本。本試驗得到的融合菌株，能夠產油脂尤其是DHA，后續研究需進一步融合菌株繼續融合或誘變，以提高融合率，從而得到更多的融合子進行篩選。本試驗證明了利用原生質體融合進行菌株選育的可行性。后期還應探討其最佳培養條件和發酵條件，以最終能將其應用于生產，發揮經濟效益。

4 結論

本研究確定了原生質體融合最佳條件為40%的PEG6000，融合溫度 30℃，融合時間為10 min，在此條件下融合率可達1.9%。篩選出一株可以在淀粉為碳源的培養基上生長的融合子，經過氣相色譜檢測其可以生產DHA。通過RAPD驗證表明B4D1與CGMCC 3.316發生了重組，融合菌株表達了更多源于B4D1的遺傳信息。

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（責任編輯 李楠）

Screening a New Type of Schizochxtrium Strain Producing DHA Using Starch by Protoplast Fusion Technology

Wang Di1Lu Fuping1Wang Haijun1Li Demao2Chen Shulin2Zhang Ke2
（1. College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457；2. Tianjin Key Laboratory for Industrial Biological Systems and Bioprocessing Engineering，Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308）

Schizochxtrium B4D1 and Aspergillus niger CGMCC 3.316 as original strains， a new strain of Schizochxtrium was selected using starch for producing DHA. The protoplasts from two parents strains were obtained respectively with Lysing enzyme. The study was investigated on the effect of culture time， culture method， enzymolysis time on the protoplasts preparation. Finally， the protoplasts fusion was done under the PEG mediated condition. The optimum condition of protoplast fusion was as follows：PEG6000 concentration of 40%， fusion temperature of 30℃， fusion time of 10 min. Furthermore， the fusion rate reached 1.9% at the optimum condition. Through comparing its colony characteristics， color， morphology and purified spore culture， a new strain has been selected using starch as carbon source. RAPD verification showed that the fusant having integrated genome of B4D1 and CGMCC 3.316 expressed more genetic information from B4D1.

Schizochytrium；DHA；protoplast；fusion；starch

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.012

2014-07-28

國家“863”計劃（2014AA021701），國際合作重點項目（2014DFA61040）

王迪，女，碩士研究生，研究方向：輕工技術與工程（發酵）；E-mail：wangdi0808@hotmail.com

李德茂，男，博士，副研究員，研究方向：工業生物系統工程；E-mail：li_dm@tib.cas.cn