擬南芥PKS2與CAM4蛋白互作研究

喬新榮段鴻斌劉柱明趙付安

（1.信陽農林學院，信陽 464000；2.河南省農業科學院經濟作物研究所，鄭州 450002）

擬南芥PKS2與CAM4蛋白互作研究

喬新榮1段鴻斌1劉柱明1趙付安2

（1.信陽農林學院，信陽 464000；2.河南省農業科學院經濟作物研究所，鄭州 450002）

植物藍光受體向光素（phototropin，PHOT）介導許多生理反應，現已從擬南芥中分離了其下游的一些信號轉導組分。前期研究表明，擬南芥光敏色素底物 PKS家族成員PKS1與部分Ca2+結合蛋白鈣調素（calmodulin，CAM）成員互作，參與PHOT2介導的強藍光誘導下胚軸向光反應。旨在探討PKS2和CAM4之間的互作關系，首先用RT-PCR技術得到PKS2和CAM4 的cDNA全長序列。通過酵母雙雜交和雙分子熒光互補技術，從體外與體內證實PKS2和CAM4能相互作用。此結果進一步豐富了PKS家族與CAM之間的聯系，為深入解析PHOT功能研究奠定基礎。

擬南芥；向光素；光敏色素底物；鈣調素

植物藍光受體向光素（phototropin，PHOT）介導植物諸多生理反應，PHOT1單獨介導弱藍光誘導的向光反應及下胚軸伸長的抑制，PHOT2是介導強藍光誘導葉綠體回避運動的基本光受體［1］。此外，二者以光強依賴方式共同調節植物的向光彎曲、氣孔開放、葉綠體聚集運動、葉片伸展及定位等生理反應［1］，使植物適應不同光環境，促進其生長發育。近年來，隨著PHOT下游信號成分的分離及功能探索，進一步推動了 PHOT信號轉導機制的深入研究。擬南芥中編碼光敏色素激酶底物的PKS（phytochrome kinase substrate）是一個小基因家族，共有4個成員PKS1-PKS4，它們最初鑒定是紅光受體激酶光敏色素（phytochrome，PHY）的底物，均定位于質膜，參與PHY介導的去黃化、根與下胚軸的生長定位［2-4］。近年來的研究表明，PKS 也參與藍光受體PHOT介導的生理反應。藍光刺激增強了下胚軸伸長區PKS1的表達量［5］。PKS1/2與PHOT1/2互作［6，7］，PKS1主要參與PHOT1介導的根和下胚軸的向光反應［5，8］，以及PHOT2介導的強藍光誘導向光彎曲［7］。PKS2主要在PHOT2信號路徑中調節葉片的伸展和定位［6］。

Ca2+廣泛存在于植物體內，是植物生長發育和環境刺激應答中心調節子［9］。許多試驗表明，Ca2+也參與藍光誘導的一些生理反應。例如，藍光誘導了胞質Ca2+的升高［10-12］，且此反應由PHOT介導［11，12］。單側藍光照射后的單子葉玉米胚芽鞘的背光面和向光面中Ca2+含量不同［13］。眾所周知，生長素在下胚軸的背光面和向光面的不對稱分布引起了向光彎曲［14］。但上述的研究表明Ca2+也可能參與PHOT介導的向光反應。鈣調素（calmodulin，CAM）是一類真核生物中廣泛存在且高度保守的Ca2+感受結合蛋白，擬南芥中7個CAM基因編碼4個CAM蛋白異構體（isoform），分別為CAM1/CAM4、CAM2/CAM3/CAM5、 CAM6和CAM7［15］。有證據表明CAM調節生長素極性運輸。為了挖掘Ca2+參與向光反應的直接證據，我們之前研究證明PKS1不但與生長素外流載體PIN1直接互作，而且與CAM4/5/7也互作，可能在PHOT2信號通路中參與調節下胚軸向光反應［7］。為了更進一步研究PHOT介導的信號轉導路徑中PKS家族與Ca2+之間更多的信息聯系，本研究利用酵母雙雜交（yeast two-hybird）和雙分子熒光互補（bimolecular fluorescence complementation，BIFC）技術，研究PKS2與CAM4之間的互作關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒 大腸桿菌（Escherichia coli）DH-5α；酵母菌（Saccharomyces cervisiae）菌株Y190；用于酵母互作的質粒載體pAS2和pACT2，用于雙分子熒光互補的載體YFPC和YFPN均為本實驗室保存。

1.1.2 試劑及試劑盒 限制性內切酶、Oligo（dT）、核酸分子量標準（Marker）、DNA凝膠純化回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自TaKaRa公司；Trizol試劑購自Invitrogen公司；高效連接試劑盒Soultion I、M-MLV反轉錄酶購自Promega公司；KOD-plus DNA聚合酶購自ToYoBo公司；抗生素氨芐青霉素（Amp），醋酸鋰（LiAC），鮭魚精DNA，PEG，X-gal及所用分析純購自Solarbio公司；Taq DNA聚合酶、dNTP、普通PCR buffer購自TIANGEN公司。

1.1.3 引物 酵母雙雜交試驗引物如下所示（下劃線是酶切位點）：

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA的合成 以擬南芥幼苗為材料，利用Trizol 法試劑說明書提取總RNA。參照M-MLV反轉錄酶說明書進行反轉錄，合成cDNA第一鏈，立即使用或-20℃保存備用。

1.2.2 載體構建 根據TAIR網站上提供的PKS2及CAM4的CDS序列，選擇體外互作的GAL4酵母雙雜交系統。利用PKS2為誘餌蛋白，CAM4為捕獲蛋白，用PrimerPremier5.0 設計引物，以PF1和 PR1為引物構建PKS2-pAS2載體，以CF1和CR1為引物構建CAM4-pACT2載體。利用PF2和 PR2為引物構建BIFC試驗中的PKS2-YFPC載體，CF2和CR2為引物構建CAM4-YFPN載體。

以制備好的cDNA為模板，利用上述引物分別擴增PKS1及CAM4基因序列，先利用普通Taq DNA聚合酶預擴增預期片段，再用高保真酶KODPlusDNA聚合酶，擴增回收。擴增條件為：94℃預變性5 min；94℃變性40 s，55-57℃復性40 s，72℃（68℃）延伸1-1.5 min，30個循環；72℃（68℃）延伸10 min。

然后將擴增產物回收純化，用相應的限制性內切酶對基因片段和載體酶切，回收后16℃連接4 h，將連接產物通過熱激法傳入到大腸桿菌DH5α，并涂布在含60 μg/mL的氨芐青霉素（Amp）抗性的LB培養基上選擇培養。菌落PCR和質粒PCR后，進行酶切驗證后，得到相應的重組克隆質粒送上海生工測序。

1.2.3 體外酵母雙雜交試驗

1.2.3.1 酵母感受態細胞的制備及轉化 參照Gietz和St Jean［16］的醋酸鋰法進行。將30℃培養條件下獲得OD≈2.0的50 mL酵母菌（Y190）液室溫下3 800 r/min離心5 min。然后重懸于25 mL水中，1 000 r/min離心5 min，得沉淀的細胞重懸在900 μL水中，13 000 r/min離心1 min。用0.1 mol/L LiAC重懸沉淀細胞，使其最終體積為1 mL，30℃溫育10 min。然后每100 μL 分裝至1.5 mL EP管中，離心后，向沉淀細胞中依次加入 240 μL 50% PEG，36 μL 1 mol/L LiAC，50 μL鮭魚精DNA，及各5 μL的兩個不同質粒，補水至360 μL。旋渦器上劇烈重懸細胞，然后置于30℃恒溫箱中溫育30 min，再置于42℃恒溫水浴池中熱激30 min，12 000 r/min離心1 min，棄上清，加適量滅菌ddH2O，輕輕重懸細胞。取20-200 μL涂于SD板上。

1.2.3.2 β-gal陽性克隆的顯色反應 當30℃恒溫培養箱中的酵母克隆直徑約為2 mm時，剪大小合適的尼龍膜，并作上標記，用鑷子輕輕擠壓在菌落表面，使克隆菌落粘至尼龍膜上。當尼龍膜完全浸濕后，取出用液氮冷卻10 s，室溫解凍，再冷卻，反復2-3次。用Z-buffer/X-gal溶液浸濕濾紙并置于潔凈的培養皿中。把菌落裂解好的尼龍膜貼于浸濕的濾紙上。置于30℃培養箱孵育，8 h前不時檢查藍色反應的出現。

1.2.4 BIFC試驗 參照Walter 等［17］方法，利用PEG介導的瞬時轉化法進行。取數個生長健壯的擬南芥葉片，切成細條，黑暗條件下，酶解細胞壁，離心收集原生質體，用冰冷的W5（154 mmol/L NaCl，125 mmol/L CaCl2，5 mmol/L KCl，5 mmol/L葡萄糖，0.03% MES，pH5.8）溶液輕柔洗滌。重懸后23℃，100×g離心1 min。棄上清，然后每管沉淀用0.5 mL MMg（15 mmol/L MgCl2，0.1% MES，0.4 mol/L 甘露醇，pH5.6）溶液重懸。每種質粒取約10 μg于1.5 mL EP管中，加100 μL重懸的原生質體，輕輕混勻。然后加入110 μL PEG/Ca（1 g PEG4000，0.75 mL H2O，0.625 mL 0.8 mol/L甘露醇，0.25 mL 1 mol/L CaCl2）溶液，輕柔混勻。室溫避光靜置20-30 min。加入1 mL W5溶液，混勻。在23℃，弱光條件下孵育12-18 h。然后常溫下100×g離心2 min，取50 μL左右溶液于小塑料器皿中，靜置片刻用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光。

2 結果

2.1 酵母雙雜交試驗重組載體的構建

用Trizol方法提取擬南芥幼苗RNA，以反轉錄的cDNA為模板，PCR擴增到1 329 bp的PKS2及480 bp的CAM4 CDS序列（分別如圖1，2所示的1號電泳條帶）。用Sma I和BamH I限制性內切酶雙酶切PKS2序列片段，以及pAS2質粒載體，得到重組菌落，挑單菌落進行過夜LB液體培養，提取質粒進行PCR和酶切（圖1中2號條帶）。用Nco I和Xho I限制性內切酶分別雙酶切CAM4基因片段和pACT2質粒，結果如圖2所示。將得到的PKS2-pAS2和CAM4-pAC2重組質粒送公司測序鑒定。

圖1 PKS2- pAS2載體構建

圖2 CAM4-pACT2載體構建

2.2 PKS2和CAM4酵母互作分析

為了檢測PKS2和CAM4蛋白是否相互作用，將PKS2構建到誘餌載體pAS2上形成PKS2-pAS2重組質粒并測序正確；將CAM4構建到pACT2上得到CAM4-pAS2重組質粒并測序正確。將PKS2-pAS2與CAM4-pACT2質粒、PKS2-pAS2與pACT2質粒、CAM4-pACT2與pAS2質粒共轉化酵母Y190中，同時將陽性對照［18］PHOT1-pAS2與NPH3-pACT2及陰性對照pAS2/pACT2分別共轉化酵母Y190，并涂布于SD平板上。30℃培養2-4 d后，挑選菌落轉接至YPD板上繼續生長2-4 d。進行β-gal 染色，結果（圖3）顯示，只有陽性對照和PKS2-pAS2/ CAM4-pACT2變藍，而其他不變藍，說明PKS2-pAS2和CAM4-pACT2單獨不能激活報告基因，只有PKS2-pAS2和pACT2-CAM4之間相互作用具有了轉錄激活活性。從而證明PKS2和CAM4蛋白存在相互作用。

圖3 PKS2與CAM4的酵母互作試驗

2.3 BIFC試驗載體構建

利用測序正確的PKS2-pAS2質粒為模板，用引物PF2、PR2及KOD-plus DNA 聚合酶 PCR擴增去掉終止密碼子的PKS2全長，將回收的目的條帶及YFPC空質粒載體分別利用BamH I和Sma I酶切，得到重組質粒PKS2-YFPC，雙酶切重組質粒電泳條帶如圖4所示。以測序正確的CAM4-pACT2為模板，利用引物CF2、CR2及KOD-plus DNA 聚合酶 PCR擴增去掉終止密碼子的CAM4全長cDNA，用BamH I和Sma I雙酶切回收的目的條帶及YFPN質粒載體，將構建的重組質粒CAM4-YFPN酶切驗證（圖5）。將酶切驗證正確的PKS2-YFPC和CAM4-YFPN重組質粒送公司測序。

圖4 PKS2-YFPC載體構建

圖5 CAM4-YFPN載體構建

2.4 PKS2和CAM4體內互作分析

為了進一步在植物體內驗證PKS2和CAM4的相互作用，采用BiFC試驗，將構建好的表達載體質粒PKS2-YFPC和CAM4-YFPN、陰性對照YFPC/YFPN及陽性對照［19］PHOT1-YFPC/ PHOT1-YFPN，通過PEG介導瞬時轉化法，共轉擬南芥原生質體，弱光處理12-18 h后，利用激光共聚焦觀察，陰性對照YFPC/YFPN未觀察到黃色熒光，而陽性對照PHOT1-YFPC/ PHOT1-YFPN和PKS2-YFPC/CAM4-YFPN觀察到了質膜上有黃色熒光（圖6），說明PKS2和CAM4在細胞質膜上互作。

3 討論

近年來，藍光受體PHOT介導生理反應的信號轉導機制研究已成為熱點之一。現已分離了多種PHOT下游信號蛋白［1，20］，但由于同源蛋白激酶受體PHOT1和PHOT2信號轉導途徑的交叉及特異性特點，使得對其下游信號蛋白功能的研究更為復雜及多樣性。例如，在研究PHOT介導的下胚軸向光彎曲反應中，NPH3蛋白是PHOT1、PHOT2下游共有信號，與二者生理互作，但RPT2蛋白僅與PHOT1互作，PP2A蛋白與PHOT2特異互作調節向光彎曲，PKS家族中，PKS1/2都與PHOT1/2互作，但PKS2側重于PHOT2介導的葉片伸展和定位。另外，PHOT信號與光敏素信號、生長素信號及Ca2+信號也存在關聯。因此，對PHOT信號轉導機制的研究還需進一步深入，尤其是與Ca2+信號互作的直接證據還很有限。前期工作研究表明，PKS家族中PKS1與Ca2+信號感受蛋白CAM4/5/7互作可能參與強藍光誘導PHOT2調節下胚軸向光彎曲。本研究利用酵母雙雜交和BIFC試驗證明PKS2能與CAM4互作。為了證明二者互作的準確性，下一步可制備PKS2抗體，利用免疫共沉淀方法進一步驗證二者互作關系。另一方面，進一步分析PKS2與CAM5、CAM6、 CAM7的互作反應，為PKS家族作為PHOT與Ca2+信號的中間介導子功能奠定基礎。

圖6 PKS2與CAM4的BIFC互作試驗

4 結論

本研究通過RT-PCR方法克隆獲得了擬南芥PKS2與CAM4的完整編碼序列，成功構建了用于酵母雙雜交系統及雙分子熒光互補試驗的PKS2和CAM4表達載體，并進行了PKS2和CAM4蛋白的互作試驗。結果表明，二者能直接相互作用。

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（責任編輯 李楠）

致 謝

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Research of PKS2 Interaction with CAM4 in Arabidopsis thailana

Qiao Xinrong1Duan Hongbin1Liu Zhuming1Zhao Fuan2
（1. Xinyang College of Agriculture and Forestry，Xinyang 464000；2. Cash Crop Research Institute， Henan Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou 450002）

Blue-light receptors phototropin （PHOT）mediate a wide set of physiological and developmental responses. As some PHOT downstream signal transduction components have been identified in Arabidopsis by genetic analyses， we have found that PKS1 of Phytochrome kinase substrate PKS family interacts with members of calmodulin （CAM）， which are Ca2+binding protein. In order to address the issue of how PKS2 interacts with CAM4， firstly cDNA full length sequences of PKS2 and CAM4 were obtained by RT-PCR technique. Then， it was confirmed that PKS2 could be interact with CAM4 by tests of yeast two-hybrid system and bimolecular fluorescence complementation. These date could contribute to enrich relation between PKS and CAM， which would provide base for further uncovering PHOT functions.

Arabidopsis thaliana；phototropin；phytochrome kinase substrate；calmodulin

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.013

2014-07-28

喬新榮，女，博士，講師，研究方向：植物分子育種及植物生理；E-mail：xirong806@163.com

趙付安，男，博士，研究員，研究方向：植物分子育種及植物生理；E-mail：fazcotton@163.com