青稞HbSnRK2.4的克隆及其序列特征與表達特性分析

曾興權王玉林徐齊君原紅軍韋澤秀尼瑪扎西

（1. 西藏自治區農牧科學院，拉薩 850002；2. 西藏自治區青稞種質改良和牦牛繁育重點實驗室，拉薩 850002；3.西藏自治區農牧科學院農業資源與環境研究所，拉薩 850002）

青稞HbSnRK2.4的克隆及其序列特征與表達特性分析

曾興權1，2王玉林1，2徐齊君1，2原紅軍1，2韋澤秀2，3尼瑪扎西1，2

（1. 西藏自治區農牧科學院，拉薩 850002；2. 西藏自治區青稞種質改良和牦牛繁育重點實驗室，拉薩 850002；3.西藏自治區農牧科學院農業資源與環境研究所，拉薩 850002）

干旱脅迫是制約農作物生產的重要限制因素之一，研究并增強作物的抗旱性具有重要意義。SnRK2（Sucrose nonfermenting 1-related protein kinase 2）基因編碼一類蔗糖非酵解型蛋白激酶，該酶在ABA信號轉錄途徑和抗滲透脅迫中起著重要作用。以青稞（Hordeum vulgare subsp. vulgare）抗旱品種喜馬拉雅10號為材料，利用RT-PCR技術克隆獲得了SnRK2基因全長cDNA序列，命名為HbSnRK2.4（登錄號：KJ699389）。生物信息學分析表明，該基因全長1 310 bp，編碼362個氨基酸序列，蛋白分子量為41.94 kD，等電點（pI）為5.96。Prosite Scan分析結果表明，HbSnRK2.4含有多個干旱脅迫響應蛋白的作用位點，如酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點、酪氨酸激酶磷酸化位點、蛋白激酶C磷酸化位點及N-豆蔻酰化位點等。利用實時定量PCR方法研究了HbSnRK2.4在干旱脅迫條件下及復水后不同時間點的表達情況，發現HbSnRK2.4在土壤絕對含水量為33.4%時表達量最高，隨著土壤絕對含水量的下降而下調表達；當達到作物正常生長所需的土壤絕對含水量時又開始上調表達；進行干旱脅迫后（＜15.5%）基因表達量下降；復水后8 h時恢復正常表達水平。

青稞；HbSnRK2.4；基因克隆；干旱脅迫；表達模式

干旱是我國較為嚴重的自然災害之一，它是影響農作物生長、限制農作物產量的非生物脅迫因子之一，能夠引起植物體內一系列生理代謝反應和生長的可逆性抑制，嚴重時引起植株不可逆的傷害甚至死亡［1］。每年在西藏雨季到來之前，青稞正處于拔節期，經常會受到干旱脅迫的影響。因此，為了提高青稞的產量和品質，選育抗旱青稞新品種，加強對抗旱相關基因的研究有著極其重要的現實意義。

作物的抗（耐）旱性是一個非常復雜的由多基因控制的性狀，涉及從信號轉導基因到轉錄調控基因，以及保護、防御、脅迫耐受基因的表達［2］。研究表明，干旱會顯著誘導植物ABA水平上升，這一激素信號將引導植物產生一系列的逆境響應［3］，如葉表氣孔的關閉和開度減小，最終在一定程度上增強植物對水分脅迫的耐受能力。在干旱脅迫中，由蛋白激酶介導的蛋白質的可逆磷酸化作為高等植物受滲透逆境誘導的主要信號轉導途徑之一，廣泛參與了植物對干旱、鹽脅迫、ABA、光等的應答反應。蔗糖非酵解型蛋白激酶（Sucrose non-fermenting 1-related protein kinase，SnRK）是一類廣泛存在于植物中的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與了植物體內多種信號途徑的轉導。根據序列相似性、結構域特征和細胞的功能，植物中的SnRK基因可分為3個 亞 組：SnRK1、SnRK2和SnRK3［4］，SnRK2和SnRK3是植物特有的蛋白激酶，參與植物對逆境脅迫的反應［5］。其中，SnRK2（Sucrose non-fermenting 1-related protein kinase 2）是一個相對較小的基因家族，在擬南芥中已發現10個SnRK2家族成員，5個參與ABA應答反應［6，7］，AtSnRK2.8/AtSnRK2C的過表達可以增強擬南芥的抗旱能力［8］；在水稻中也有10個SnRK2成員，依次命名為SAPK1-SAPK10，其中SAPK8、SAPK9和SAPK10可以被ABA激活［9］；在玉米中有11個SnRK2成員，5個受ABA激活［10］；在蘋果中有16個SnRK2成員，預測12個能夠響應ABA誘導［11］；此外，在小麥中發現PKABA1、TaSnRK2.4、TaSnRK2.8和TaSnRK2.9 等4種SnRK2基因與ABA信號傳導有關［12-14］，在燕麥中EeSnRK2.6可能參與逆境脅迫反應，增強植物的抗逆性［15］。

鑒于SnRK2蛋白激酶在植物抗逆反應中發揮的重要作用，近年來已有報道在多種植物中克隆到SnRK2家族的相關基因，但迄今未見西藏春青稞中ABA信號轉導途徑中關鍵基因SnRK2克隆及功能分析報道。本研究利用 RT-PCR 技術獲得了SnRK2基因的全長CDS序列，對其序列進行初步的生物信息學分析，通過Real Time PCR研究HbSnRK2.4在干旱脅迫下的表達模式。

1 材料與方法

1.1 材料

抗旱青稞種質‘喜馬拉雅10號’由西藏自治區農牧科學院提供。

1.2 方法

1.2.1 青稞的干旱脅迫處理 抗旱青稞種質喜馬拉雅10號由西藏自治區農牧科學院提供。待幼苗長至4葉期時開始進行自然干旱處理，采用稱重法計算土壤絕對持水量，每隔2 d稱量1次：從水分過剩土壤絕對持水量33.4%（C1），27.5%（C2），21.1%（C3）至青稞正常生長適宜土壤絕對持水量15.5%（C4），干旱脅迫9.8%（C5）和4.8%（C6），在各脅迫階段剪取植株葉片，于液氮中速凍，-70℃保存備用。同時，保留部分重度干旱脅迫（持水量4.8%）植株進行復水處理（恢復持水量至33.4%），分別于復水后2 h（C7）、4 h（C8）、8 h（C9）分別取樣，-70℃保存備用。

1.2.2 HbSnRK2.4基因的克隆與Real Time PCR 分析

根據不同時期干旱復水誘導轉錄組測序分析結果為基礎，利用Primer Premier 5.0 軟件設計特異引物S1，以不同時間點樣品的總RNA等量混合，經反轉錄得到的第一鏈cDNA為模板，得到上游片段。RT-PCR反應在S-1000 Thermal Cycler進行，反應體系采用20 μL PCR擴增體積：Taq DNA聚合酶（TaKaRa，5 U/μL） 0.2 μL，10×PCR反應緩沖液（TaKaRa） 2 μL，dNTP（10 mmol/L）1.6 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，cDNA 2 μL，滅菌水12.6 μL。PCR反應條件：94℃變性4 min；94℃變性50 s，51℃退火45 s，72℃延伸1 min，34個循環；72℃延伸10 min。回收目標片段，克隆、測序。

Real Time PCR分析步驟按照SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒說明書進行操作，定量PCR引物根據HbSnRK2.4的cDNA序列設計見表1，β-Tublin作為內參基因見表1。實時熒光PCR所獲得的數據處理采用雙標準曲線法引入斜率，根據張馳宇等［16］的公式進行計算。

表1 本研究中用到的引物

1.2.3 HbSnRK2.4基因的生物信息學分析 利用NCBI（http：//ncbi.nlm.nih.gov/）、ExPAsy（http：//www. expasy.org/tools/pi_tool.html）、TMHMM（http：//www. cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）、TargeP（http：//www. cbs.dtu.dk/services/SignalP）和PSORT（http：//psort. ims.u-tokyo.ac.jp/form.html）等網絡資源對HbSnRK2.4進行序列分析。根據推測的HbSnRK2.4氨基酸序列，利用MEGA5.1軟件進行氨基酸序列同源性比對和進化樹分析。

2 結果

2.1 HbSnRK2.4基因的克隆和生物信息學分析

以電子克隆延伸得到的序列結合大麥編碼SnRK2.4基因的cDNA序列為基礎設計特異引物，擴增春青稞苗期葉片的cDNA，獲得一個條帶1 310 bp的片段。經NCBI網站的ORF finder程序分析，5'-UTR和3'-UTR分別長21 bp和200 bp；基因ORF長1 089 bp，編碼一個362個氨基酸的多肽（圖1）。推測蛋白的預測分子量為41.94 kD，等電點（pI）為5.96。Prosite Scan分析結果表明，該蛋白含有Protein kinase domain profile 家族特征基序（圖1中下劃線部分）、蛋白激酶ATP結合區標記（圖1中雙劃線部分）、1個絲/蘇氨酸蛋白激酶活性區域標記（圖1中方框部分）、4個酪氨酸激酶磷酸化位點（40-46、94-102、140-146、334-341）、6個 蛋白激酶C磷酸化位點（54-56、172-174、246-248、250-252、307-309、358-360）、7個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點（96-99、172-175、222-225、250-253、285-288、290-293、319-322）、1個N-豆蔻酰化位點（110-115）、一個cAMP和cGMP依賴性的蛋白激酶磷酸化位點（247-250）。TMHMM預測該蛋白不含跨膜轉移功能區。Signal IP3.0 預測該蛋白沒有信號肽，不屬于分泌蛋白。PSORT亞細胞定位預測該基因所編碼蛋白位于細胞質。

Blastn分析發現，該序列與小麥、二穗短柄草、水稻、玉米、小米、高粱、山羊草、馬鈴薯和蓖麻等植物的SnRK2基因全長cDNA序列相似度分別為97%、94%、91%、89%、89%、85%、82%、81%和81%。推導的氨基酸序列同源比對分析結果（圖2）表明，該基因與小麥、二穗短柄草、水稻、玉米、小米、高粱、番茄、馬鈴薯和黃瓜等植物相似度分別為97%、94%、91%、89%、89%、85%、81%、81%和80%。基于氨基酸序列的系統進化樹表明，該基因與小麥、二穗短柄草和水稻中編碼蛋白激酶家族基因具有較近的親緣關系，而與高粱、番茄和馬鈴薯已克隆的蛋白激酶家族序列相似度相對較低，因此推斷得到了青稞絲/蘇氨酸蛋白激酶基因家族一個新成員的全長cDNA序列，將其命名為HbSnRK2.4（KJ699389）。

2.2 HbSnRK2.4基因表達模式分析

利用干旱脅迫和復水條件下9個處理時期的青稞苗期葉片，進一步對HbSnRK2.4基因的表達模式進行分析，結果（圖3）表明，HbSnRK2.4基因在土壤絕對含水量達到33.4%（C1）明顯上調表達，隨著土壤絕對含水量的下降而急劇下降，當達到一定程度后維持一定水平（C2、C3）；當土壤絕對含水量達到作物正常生長所需的土壤絕對含水量時又上調表達（C4）；干旱脅迫后，HbSnRK2.4的表達量隨著土壤絕對含水量的下降而又急劇下降，但隨著脅迫的加劇未出現明顯變化（C5、C6）；復水2 h后表達量有所增加（C7），隨著復水時間延長表達量逐漸恢復至正常水平 。這表明HbSnRK2.4基因可能參與調控水澇和干旱脅迫相關的過程。

圖1 HbSnRK2.4基因cDNA及其編碼氨基酸的全長序列

圖2 HbSnRK2.4與其它植物類SnRK基因構建的最小進化樹

3 討論

ABA作為植物體內重要的生長激素，不僅可以調節植物的生長發育，而且在對逆境脅迫的響應中也有著重要的作用［17］。SnRK2是一個相對較小、植物特有的一類Ser/Thr類蛋白激酶，是受滲透脅迫激活的一類蛋白激酶，參與植物體內多種信號途徑的轉導；SnRK2基因是ABA信號轉導途徑中的關鍵調控酶［18］，它受各種逆境脅迫誘導表達，在提高植物的抗逆性中發揮著至關重要的作用［19］。譚秦亮［20］克隆出編碼甘蔗SnRK2蛋白的基因SoSnRK2.1，發現該基因參與調控干旱、高鹽和低溫等脅迫過程，在甘蔗抗逆境脅迫中起重要作用。徐蓓等［15］從抗旱耐鹽性極強的長穗偃麥草中克隆了EeSnRK2.6基因的cDNA序列，該基因可能在參與逆境脅迫反應、增強植物的抗逆性中起著重要作用。在擬南芥中，SnRK2系列基因參與干旱和ABA的誘導過程，其中SnRK2.2、SnRK2.3、SnRK2.6、SnRK2.7和SnRK2.8可以同時被ABA激活，過表達SnRK2.8的擬南芥抗旱性明顯增強［20，21］。小麥TaSnRK2.8參與干旱、高鹽、低溫及ABA等信號轉導的過程，其過量表達可引起轉基因植株根部組織含水量、細胞膜穩定性、滲透勢等抗逆境生理的一系列變化［22］。陳娜娜等［11］對蘋果、擬南芥、水稻、玉米和煙草的SnRK2蛋白激酶進行了系統進化樹分析，認為SnRK2可以分成3個亞族。第一亞族包含18個成員，能夠響應滲透脅迫但不受ABA誘導；第二亞族包含15個成員，能夠響應滲透脅迫和NaCl誘導但ABA誘導的反應較微弱，過表達后能夠顯著提高植物的抗旱性；第三亞族包含14個成員，能夠強烈響應ABA誘導，在保衛細胞中高表達，調節氣孔的孔徑。此外，研究表明大豆中的SnRK2可以被高滲透逆境誘導激活［23］。

圖3 不同水分環境HbSnRK2.4基因表達模式Real Time PCR分析

針對SnRK2底物的研究表明，SnRK2可以使組蛋白（histone）、酪蛋白（casein）、髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein）及轉錄因子磷酸化，同時SnRK2也可以使自身磷酸化［24，25］。在水稻和擬南芥中證實了ABA應答轉錄因子（ABA responsive transcription factors，ABF/AREB）可以作為SnRK2的底物被磷酸化［26］。Shin［27］等研究發現，腺苷激酶（adenosine）、醛酮變位酶（Glyoxalase I）、核糖-5-磷酸異構酶（Ribose 5-phosphate isomerase）、60S核酸核糖體蛋白（60S acidic ribosomal protein P2）均可以作為底物被SnRK磷酸化，這一結果表明SnRK2除了通過活化轉錄因子調控基因的表達外，還可以直接激活新陳代謝相關的蛋白，從而使植物抵抗逆境。Shukla等［28］認為，根據SnRK2活性的差異，信號途徑可以分成兩個過程：首先，高滲透脅迫可以引發內源ABA的釋放，激活SnRK2，活化的SnRK2可以進一步使bZIP/ABRE/AREB轉錄因子家族磷酸化，從而引發一系列的轉錄和翻譯水平的活動；另一信號過程是不依賴于內源ABA的快速應答過程，SnRK2通過直接作用于相關基因，從而引發滲透脅迫下的應答過程。

本研究利用同源克隆的方法成功從西藏青稞抗旱種質中克隆到了HbSnRK2.4基因，該基因的表達量受干旱和復水的誘導，可能參與調控水澇和干旱脅迫相關的過程。然而對HbSnRK2.4具體的作用機制尚且不清楚，其是否依賴于內源ABA的響應發揮作用，還是直接作用于相關基因；HbSnRK2.4除了受干旱和復水條件的誘導外，其它逆境條件（如高鹽、高溫、高輻射、低溫等）是否也能誘導它的表達，因此，需要在此基礎上進一步加強研究。

4 結論

青稞HbSnPK2.4基因在進化上與小麥和二穗短柄草的SnRK基因具有比較近的親緣關系，與番茄和馬鈴薯等具有較遠的親緣關系；HbSnPK2.4基因的表達量同時受到干旱和水澇的誘導，很可能參與了青稞的抗旱過程。

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（責任編輯 李楠）

Cloning and Characterization of HbSnRK2.4 in Tibetan Hulless Barley（Hordeum vulgare L. var. nudum HK.f.）

Zeng Xingquan1，2Wang Yulin1，2Xu Qijun1，2Yuan Hongjun1，2Wei Zexiu2，3Ni Mazhaxi1，2
（1. Tibet Academy of Agriculture and Animal Husbandry Sciences，Lhasa 850002；2. Barley Improvement and Yak Breeding Key Laboratory of Tibet Autonomous Region，Lhasa 850002；3. Research Insititute of Agriculture Resource and Environment，Tibet Academy of Agriculture and Animal Husbandry Sciences，Lhasa 850002）

Drought stress has become one of the important factors that hamper the production of agriculture. Varieties with enhanced drought resistance can be an effective way to solve this problem. SnRK2 gene encoded a kind of Sucrose non-fermenting 1-related protein kinase，which have been thought to play an important role in the ABA signaling pathways and resistance to osmotic stress. However，the exact mechanism underlining is still to be elusive. We presented the isolation of a new SnRK2 gene from Hordeum vulgare subsp. vulgare，nominated as HbSnRK2.4（Accession No. Kj699389） by RT-PCR. The plants were proved to be highly drought tolerance. The gene was 1 310 base pair in length，encoding a peptide of 362 amino acids，about 41.94 kD in molecular weight and with pI=5.96. Results from Prosite Scan indicated that HbSnRK2.4 contains multiple loci of drought stress response cis-element such as casein Kinase II phosphorylation sites，tyrosine kinase phosphorylation sites，protein kinase c-phosphorylation and n-cardamom acylation locus. Expression patterns of HbSnRK2.4 were also investigated by RT-qPCR at serious waterlogging or drought and various time points after recovery. The highest expression level was observed in plants growing in soil absolute moisture 33.4%，which may brought waterlogging to tibet barley. As soil absolute moisture declined，transcriptsdecreased sharply. But when the soil water content turned to be normal for Hordeum vulgare（15.5%），HbSnRK2.4 restored to a higher level. When plants were drought stressed（＜15.5% of absolute moisture），the gene were repressed again. After recovery from draught stress，the plants possessed a normal expression level of HbSnRK2.4.

Tibetan hulless barley；HbSnRK2.4；drought stress；gene cloning；expression pattern

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.017

2014-07-21

“973”計劃前期研究專項（2012CB723006），國家科技支撐計劃（2012BAD03B01，2013BAD30B01），西藏財政專項（2014CZZ001）

曾興權，男，博士，副研究員，研究方向：青稞遺傳育種；E-mail：xingquanz_2@126.com

尼瑪扎西，男，博士，研究員，研究方向：青稞遺傳育種；E-mail：nima_zhaxi@sina.com