甘肅河西地區西門塔爾雜交類群NGB基因第3外顯子的遺傳變異研究

梁春花劉霞孫雪婧羅玉柱高雪晉杜曉華

（1. 甘肅農業大學動物醫學院，蘭州 730070；2. 甘肅農業大學生命科學技術學院，蘭州 730070；3. 甘肅省草食動物生物技術重點實驗室，蘭州 730070）

甘肅河西地區西門塔爾雜交類群NGB基因第3外顯子的遺傳變異研究

梁春花1，3劉霞2，3孫雪婧1，3羅玉柱3高雪晉2杜曉華1，3

（1. 甘肅農業大學動物醫學院，蘭州 730070；2. 甘肅農業大學生命科學技術學院，蘭州 730070；3. 甘肅省草食動物生物技術重點實驗室，蘭州 730070）

旨在對甘肅河西的臨澤、甘州、武威、金昌、高臺5個地區283頭西門塔爾雜交類群NGB基因第3外顯子的遺傳多態性及變異特征進行系統分析，采用PCR-SSCP方法檢測了283頭西門塔爾雜交類群NGB基因第3外顯子和部分內含子的多態性，且對群體內各等位基因進行了測序。結果顯示，5個地區西門塔爾雜交類群共檢測出5個等位基因（A、B、C、D、E），表現為5種基因型（AA、AB、AC、AD、AE）。其中甘州、武威、金昌西門塔爾雜交類群NGB基因均只檢測到AA、AB 2種基因型，高臺西門塔爾雜交類群檢測到AA、AE 2種基因型，臨澤西門塔爾雜交類群檢測到AA、AB、AC、AD 4種基因型。A等位基因和AA基因型的頻率在5個群體中最高，為優勢基因和優勢基因型。對不同SSCP帶型的對應片段進行測序分析，共發現6個核苷酸突變位點（75 bp C→T，78 bp C→G，128 bp G→A，214 bp G→A，232 bp C→T，233 bp G→A），其中第75 bp和第78 bp處的突變位點位于內含子區域，其余4處突變位點均位于外顯子區域。第214 bp處的核苷酸突變導致甘氨酸（Gly）突變為絲氨酸（Ser），第232 bp處核苷酸突變導致精氨酸（Arg）突變為色氨酸（Trp），第233 bp處核苷酸突變導致精氨酸（Arg）突變為谷氨酰胺（Gln），經χ2檢驗結果顯示，5個地區的西門塔爾雜交類群在此3個突變位點上都處于Hardy-Weinberg平衡狀態（P＞0.05）。群體遺傳學分析結果表明，臨澤、甘州、武威、金昌、高臺西門塔爾雜交類群的多態信息含量（PIC）分別為0.0582、0.0196、0.0196 、0.0161、0.0159，均屬于低度多態（PIC＜0.25）。

西門塔爾雜交類群；NGB基因；外顯子；遺傳變異

2000年德國科學家Burmester等［1］首次在Nature上報道人和小鼠腦內存在第3種攜氧球蛋白——腦紅蛋白（neuroglobin，NGB）。此后，科學家們逐漸發現NGB存在于各種哺乳動物、鳥類、爬蟲類、兩棲類、魚類等。NGB主要在腦組織中表達，能夠可逆地結合氧，從而特異性地向腦組織供氧。缺氧能夠誘導NGB的表達，而高表達的NGB則能夠保護神經元免受缺氧損傷，從而在神經系統缺氧/缺血損傷中具有重要的神經保護功能，已成為國內外學者研究的熱點［2-5］，但有關NGB作用的生理機制仍不明確。

西門塔爾牛原產于瑞士西門山谷地帶（Simon Valley），其屬大型乳、肉、役兼用品種，是世界第二大牛種。甘肅河西地區自1980年開始引用西門塔爾牛凍精進行雜交改良本地黃牛的產肉產奶性能［6］，通過30多年持續不斷地級進改良和導入選育，基本形成了適應甘肅河西地區的西門塔爾雜交類群。目前，國內外對NGB基因的研究多見于人和大鼠，對牦牛、藏羚羊、高原兔、藏雞等也都有相關的研究［7-13］，但有關西門塔爾牛NGB基因的研究尚未見報道。本試驗采用PCR-SSCP方法，對甘肅河西地區西門塔爾雜交類群NGB基因第3外顯子的遺傳變異規律進行了研究，其結果能夠為進一步了解西門塔爾雜交類群NGB基因的遺傳特性提供有價值的理論依據，對于探討NGB基因在缺氧/缺血狀態下的保護性生理機制也具有一定的理論與實踐意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物血樣 隨機選取甘肅河西5個地區共283頭西門塔爾雜交類群。其中，臨澤地區50頭（臨澤縣位于甘肅省河西走廊中部，海拔1380-2 278 m）、甘州地區50頭（甘州區位于甘肅省河西走廊中部，平均海拔1 474 m）、武威地區60頭（武威市位于河西走廊東端，海拔1 440-3 263 m）、金昌地區61頭（金昌市位于甘肅省河西走廊東端，海拔1 500-4 442 m）、高臺地區62頭（高臺縣位于甘肅省河西走廊中部，黑河終段下游，海拔1 260-3 140 m），頸靜脈采血10 mL，ACD（酸性檸檬酸葡萄糖）法抗凝，-70℃凍存。

1.1.2 試劑與儀器 蛋白酶K、Tris平衡酚購自大連寶生物工程有限公司；硼酸、乙二胺四乙酸（EDTA）購自Amersco公司；過硫酸銨購自煙臺市雙雙化工有限公司；去離子甲酰胺、TEMED購自Sigma公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙稀酰胺購自上海生工生物工程股份有限公司；2×Power Taq PCR Master Mix購自北京百泰克生物技術公司；Accurate Run 100 bp-I DNA ladder購自上海捷瑞生物工程有限公司；其他常規試劑均為進口或國產分析純級產品。

移液槍購自德國Eppendorf公司；梯度PCR儀購自美國ABI公司；DYY-11電泳儀、DYCP-31DN水平電泳槽購自北京六一儀器廠；A-6030凝膠成像分析系統購自韓國BIONEER公司；PROTEAN Ⅱ xi Cell雙垂直電泳槽、042BR10095 PowerPac Universal電泳儀購自美國BIO-RAD公司；F12加熱/制冷循環儀購自德國JULABO公司。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 用常規酚-氯仿抽提法從凍存血樣中提取基因組DNA，-20℃保存備用。

1.2.2 引物設計與PCR擴增 參考GenBank中普通牛NGB基因序列（登錄號：AC_000167.1），用Primer 3.0引物設計軟件設計西門塔爾雜交類群NGB基因第3外顯子的引物，上游引物：5'-ACACAGGCTGCCTTTTGTCT-3'、下游引物：5'-GGGAGAGATGAACAGGTGGA-3'，預擴增片段大小約為356 bp，包括兩端的部分內含子區域，引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

PCR反應體系為20 μL：ddH2O 7.4 μL，上游和下游引物各0.4 μL，2×Power Taq PCR Master Mix 11 μL，模板DNA 0.8 μL。PCR反應程序為：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環；72℃終延伸7 min，-4℃保存。PCR產物用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 PCR-SSCP分析 取2 μL的PCR產物加入8 μL的上樣緩沖液（980 mL/L去離子甲酰胺，0.25 g/L溴 酚 藍，0.25 g/L二 甲 苯 青，pH8.0、0.01 mol/L EDTA），105℃變性10 min，迅速冰浴5 min后上樣于濃度為14%的100 g/L（Acr∶Bis的質量比為39∶1）的非變性聚丙烯酰胺凝膠，18℃、260 V電泳21 h，銀染法顯色后拍照。

觀察電泳結果，選取條帶不同的PCR產物送往北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序。

1.2.4 統計分析 運用Popgene 1.32軟件計算基因型頻率（Genotype frequency）、基因頻率（Allele frequency）、基因雜合度（Heterozygosity，He）、有效等位基因數（Effective number of alleles，Ne）以及進行Hardy-Weinberg平衡的χ2檢驗等；用PIC_Calc 0.6軟件計算多態信息含量（Polymorphism information content，PIC）；使用Lasergene7.1軟件包中的Meg-Align軟件進行同源性分析及構建系統進化樹［14］。

2 結果

2.1 NGB基因第3外顯子的PCR擴增

甘肅河西5個地區西門塔爾雜交類群NGB基因第3外顯子的擴增產物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果（圖1）與預擴增片段大小一致且條帶清晰明亮，可直接用于SSCP分析。

圖1 西門塔爾雜交類群NGB基因第3外顯子的PCR擴增

2.2 SSCP檢測

SSCP檢測結果（圖2）顯示，甘肅河西5個地區的283頭西門塔爾雜交類群中共發現AA、AB、AC、AD、AE 5種基因型，受A、B、C、D、E 5個等位基因控制。

圖2 西門塔爾雜交類群NGB基因第3外顯子PCR-SSCP檢測

對具有多態性的PCR產物進行測序，得到西門塔爾雜交類群NGB基因第3外顯子356 bp的核苷酸序列，其中A等位基因序列與普通牛（登錄號：AC_000167.1）的相應序列一致。將不同等位基因的測序結果進行比對（圖3），發現與A等位基因相比，B等位基因在第128 bp處發生了G→A突變，但未引起氨基酸序列的變化，為同義突變；C等位基因在第214 bp處發生了G→A突變，導致甘氨酸（Gly）突變為絲氨酸（Ser）；D等位基因在第232 bp處發生了C→T突變，導致精氨酸（Arg）突變為色氨酸（Trp）；E等位基因在第233 bp處發生了G→A突變，導致精氨酸（Arg）突變為谷氨酰胺（Gln），在第75 bp和第78 bp處（即內含子區域）分別發生了C→T和C→G突變。

2.3 遺傳多樣性分析

5個地區西門塔爾雜交類群NGB基因第3外顯子等位基因的基因型頻率和基因頻率分布，見表1。群體中發現AA、AB、AC、AD、AE 5種基因型，受A、B、C、D、E 5個等位基因控制。甘州、武威、金昌西門塔爾雜交類群中均只檢測到AA、AB兩種基因型，高臺西門塔爾雜交類群檢測到AA、AE兩種基因型，臨澤西門塔爾雜交類群檢測到AA、AB、AC、AD 4種基因型，5個地區均只發現AA一種純合基因型，其余均為雜合型。A等位基因和AA基因型的頻率在5個群體中最高，為優勢基因和優勢基因型。5個地區西門塔爾雜交類群NGB基因第3外顯子多態性群體遺傳結構分布，見表2。遺傳雜合度（He）、有效等位基因數（Ne）和多態信息含量（PIC）是評價群體遺傳變異的重要指標，不同的遺傳參數體現各群體的遺傳差異性。由表2可知，武威地區西門塔爾雜交類群的群體雜合度和有效等位基因數最大，表示其遺傳多樣性最豐富，遺傳變異程度最高，具有較大的遺傳選擇潛力；甘州西門塔爾雜交類群的群體雜合度和有效等位基因數最低，其遺傳變異程度最小。多態信息含量（PIC）是衡量標記多態性較好的指標，不同地區西門塔爾雜交類群的PIC值在0.015 9-0.058 2之間，甘肅河西5個地區西門塔爾雜交類群均表現為低度多態（PIC＜0.25）。Hardy-Weinberg平衡檢驗結果顯示，5個地區的西門塔爾雜交類群均處于平衡狀態（P＞0.05）。

圖3 西門塔爾雜交類群NGB基因第3外顯子等位基因的核苷酸序列比對

表1 5個地區西門塔爾雜交類群NGB基因第3外顯子的基因頻率和基因型頻率

表2 NGB基因第3外顯子多態性群體遺傳結構

2.4 西門塔爾牛雜交類群NGB基因編碼區核苷酸序列同源性及系統發育分析

西門塔爾牛雜交類群與8個物種NGB基因編碼區核苷酸序列同源性，見表3。西門塔爾雜交類群與牦牛和綿羊的同源性最高，分別為98.3%、99.2%，與野豬、猴、人、黑猩猩、兔、雞同源性依次降低，分別為92.5%、93.3%、92.5%、91.7%、91.7%、72.5%。9個物種NGB基因編碼區核苷酸序列的系統進化樹，見圖4。西門塔爾雜交類群與牦牛和綿羊親緣關系最近，而與野豬、猴、人、黑猩猩、兔、雞親緣關系依次漸遠，其NGB基因編碼區核苷酸序列的系統發育樹與生物進化的物種樹以及動物分類學觀點也基本一致。

表3 西門塔爾雜交類群與8個物種NGB基因編碼區核苷酸序列同源性（%）比較

圖4 九個物種NGB基因編碼區核苷酸序列的系統進化樹

3 討論

本研究采用PCR-SSCP方法分析了甘肅河西5個地區283頭西門塔爾雜交類群NGB基因第3外顯子的遺傳多態性，研究結果顯示，河西不同地區西門塔爾雜交類群NGB基因第3外顯子具有一定的遺傳多樣性。共發現6個核苷酸突變位點（75 bp C→ T，78 bp C→ G，128 bp G→ A，214 bp G→A，232 bp C→T，233 bp G→A），其中第75 bp和第78 bp處突變位點落在內含子區域，可能會對NGB基因的表達調控產生一定的影響。其余4處突變位點均落在外顯子區域，第128 bp處的核苷酸突變未導致氨基酸的改變，為同義突變。第214 bp處的核苷酸突變導致甘氨酸（Gly）突變為絲氨酸（Ser），第232 bp處的核苷酸突變導致精氨酸（Arg）突變為色氨酸（Trp），第233 bp處的核苷酸突變導致精氨酸（Arg）突變為谷氨酰胺（Gln），這些氨基酸突變形成的原因可能與河西各地區的生態環境、地理條件和選育方法等不同有關。其中第232 bp處的核苷酸突變導致精氨酸（Arg）突變為色氨酸（Trp），其側鏈上增加了苯環結構，可能引起蛋白質的空間位阻效應，導致其結構發生改變。這些氨基酸的突變是否會對整個NGB的功能及其在群體中的遺傳效應產生影響，還有待更進一步的研究證實。

根據核苷酸突變位點的不同，形成了AA、AB、AC、AD、AE 5種基因型，受A、B、C、D、E 5個等位基因控制。甘州、武威、金昌西門塔爾雜交類群發現了AA、AB 2種基因型，高臺西門塔爾雜交類群發現了AA、AE 2種基因型，臨澤西門塔爾雜交類群發現了AA、AB、AC、AD 4種基因型。在第233 bp位點只有高臺西門塔爾雜交類群發現了E等位基因，第214 bp和第232 bp位點僅臨澤西門塔爾雜交類群發現了C、D等位基因，可能與這兩個地區西門塔爾雜交類群的育成歷史有關，高臺西門塔爾雜交類群中的E等位基因和臨澤西門塔爾雜交類群中的C、D等位基因是雜交培育過程中固定下來的，而其它地區的西門塔爾雜交類群中并未檢測到C、D、E等位基因，說明高臺和臨澤西門塔爾雜交類群與其它地區西門塔爾雜交類群之間的基因交流很少，屬于封閉群體。甘肅河西5個地區西門塔爾雜交類群中僅發現一種AA型純合體，其基因型頻率遠高于AB、AC、AD和AE基因型，可能是由于等位基因B、C、D和E在進化及群體遺傳過程中受到一定的選擇壓力，其純合個體因某種原因被自然選擇或人工選擇所淘汰，導致其純合型在群體遺傳過程中被稀釋或消失，閆永紅等［15］推測該過程可能是一種完全淘汰隱性基因的選擇效應，而A等位基因在長期的人工選育過程中則受到正向選擇，處于優勢地位。A等位基因的基因頻率范圍為0.966 7-0.991 9，屬于優勢等位基因。其余4個等位基因的基因頻率范圍為0.008 1-0.033 3，其等位基因頻率極低，原因可能是甘肅河西地區西門塔爾雜交類群不斷地進行雜交改良，隨著代數的增加而導致等位基因B、C、D、E逐漸被稀釋。在甘肅河西地區西門塔爾雜交類群NGB基因第3外顯子區域發現了第128 bp處G/A的轉換、第214 bp 處G/A的轉換、第232 bp處 C/T的轉換、第233 bp處G/A的轉換，這4處突變類型均為轉換，說明其突變類型比較保守，有利于保持其群體的遺傳穩定性。

多態信息含量（PIC）、雜合度（He）和有效等位基因數（Ne）都可用來度量群體內遺傳變異，其值的高低反映了群體內個體的均質度，其數值越高，說明遺傳變異性就越大，對環境的適應能力越強，具有較大的選擇潛力，應用于遺傳育種效果越好。根據PIC＞0.5為高度多態，PIC＜0.25為低度多態，0.25＜PIC＜0.5則為中度多態［16］。本研究中，甘肅河西5個地區西門塔爾雜交類群NGB基因第3外顯子基因座位均呈現低度多態（PIC＜0.25），說明5個地區西門塔爾雜交類群在此基因座位的遺傳多樣性偏低，這可能由于甘肅河西地區引進西門塔爾牛時間較短，繁育次數和代數不多，導致基因多樣性較低。武威地區西門塔爾雜交類群的群體雜合度和有效等位基因數最大，遺傳多樣性最豐富，遺傳變異程度最高，遺傳潛力大；甘州地區西門塔爾雜交類群的群體雜合度和有效等位基因數最低，其遺傳變異程度最小，說明該地區的西門塔爾雜交類群遺傳一致性較好。χ2檢驗結果顯示，甘肅河西5個地區西門塔爾雜交類群均處于Hardy-Weinberg平衡狀態（P＞0.05），可能是由于這5個地區的西門塔爾雜交類群經過長期的雜交改良，選擇壓力相對趨于穩定，因此在人工選擇、遷徙和遺傳漂變等各種因素的作用下該基因座位處于動態平衡中。

本研究顯示，西門塔爾雜交類群與牦牛和綿羊NGB基因編碼區核苷酸序列的同源性最大，親緣關系最近，而與野豬、猴、人、黑猩猩、兔、雞的同源性依次降低，親緣關系也依次漸遠。說明NGB基因編碼區在長期的生物進化過程中存在一定的差異性，可能會導致NGB基因發生遺傳變異。為進一步探討西門塔爾雜交類群NGB基因的遺傳特性提供一定的理論依據。

4 結論

本試驗運用PCR-SSCP方法對甘肅河西5個地區西門塔爾雜交類群NGB基因第3外顯子進行了多態性分析，結果表明，該基因座位共發現5個核苷酸突變位點，受A、B、C、D、E 5個等位基因控制，存在AA、AB、AC、AD、AE 5種基因型。A等位基因和AA基因型為優勢基因和優勢基因型。該基因座位在5個地區的西門塔爾雜交類群群體中PIC值均呈低度多態（PIC＜0.25）。NGB基因編碼區在長期的生物進化過程中存在一定的差異性，可能會導致NGB基因發生遺傳變異。

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（責任編輯 李楠）

Genetic Variation Study of NGB Gene Exon 3 of Simmental Cattle Hybrid Taxon in Gansu Hexi Regions

Liang Chunhua1，3Liu Xia2，3Sun Xuejing1，3Luo Yuzhu3Gao Xuejin2Du Xiaohua1，3
（1. Gansu Agricultural University College of Veterinary Medicine，Lanzhou 730070；2. Gansu Agricultural University College of Life Science and Technology，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070；3. Gansu Key Laboratory of Herbivorous Animal Biotechnology，Lanzhou 730070）

This study was designed to systematically analyze the genetic polymorphism and variability of NGB gene exon 3 of 283 Simmental cattle hybrid taxon in Gansu Linze， Ganzhou， Wuwei， Jinchang， and Gaotai. DNA fragment containing the exon 3 and part of intron of NGB gene was amplified and genotyped using PCR single-strand conformational polymorphism（SSCP） method. Representative alleles were sequenced for verification of their variations in DNA sequences. The results displayed that there were 5 alleles（A， B， C， D and E）detected， combined five genotypes as AA， AB， AC， AD and AE. Among them， samples from Ganzhou， Wuwei and Jinchang were detected AA and AB genotypes， AA and AE genotypes in Gaotai and AA， AB， AC and AD genotypes in Linze. Allele A was the predominant allele and AA was the predominant genotype in five breeds. Sequence of the SSCP showed 6 mutations in the DNA fragment（75 bp C→T， 78 bp C→G，128 bp G→A， 214 bp G→A， 232 bp C→T， and 233 bp G→A）. In which， C→T at 75 bp and C→G at 78 bp were located in intron，while the other mutations were located in exon. G→A mutation at 214 bp， C→T mutation at 232 bp and G→A mutation at 233 bp were lead to Gly→Ser， Arg→Trp and Arg→Gln， respectively. Chi-square testing indicated the three gene mutation were all in Hardy-Weinberg equilibrium（P＞ 0.05）. Population genetics analysis showed the polymorphism information content were 0.0582， 0.0196， 0.0196， 0.0161 and 0.0159 in Linze， Ganzhou， Wuwei， Jinchang， Gaotai， respectively， which was at low polymorphism（PIC ＜0.25）.

Simmental cattle hybrid taxon；NGB gene；exon；genetic variation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.018

2014-10-29

甘肅省高等學?；究蒲袠I務費資助項目（2013），甘肅省教育廳研究生導師項目（1102-04）

梁春花，女，碩士研究生，研究方向：基礎獸醫學；E-mail：liang835216@163.com

杜曉華，男，副教授，碩士生導師，研究方向：基礎獸醫學與動物發育生物學；E-mail：duxh@gsau.edu.cn