松江鱸（Trachidermus fasciatus）髓樣分化因子MyD88基因克隆與組織表達分析

畢彩紅 張秋霞 于珊珊 陳學昭 劉春影 祝茜

（山東大學（威海）海洋學院，威海 264209）

松江鱸（Trachidermus fasciatus）髓樣分化因子MyD88基因克隆與組織表達分析

畢彩紅 張秋霞 于珊珊 陳學昭 劉春影 祝茜

（山東大學（威海）海洋學院，威海 264209）

髓樣分化因子（MyD88）是TOLL樣受體介導的信號通路中的一個關鍵接頭分子，通過激活核轉錄因子（nuclear factor-kappaB，NF-κB）而參與機體的先天免疫?？寺×怂山|的MyD88基因（命名為TfMyD88），并對該基因進行了生物信息學和表達模式分析。結果顯示，TfMyD88 cDNA序列全長1 555 bp，5' UTR長89 bp，3' UTR長599 bp；開放閱讀框長度為867 bp，編碼288個氨基酸。SMART軟件預測TfMyD88分子的N端為一個保守的死亡結構域（death domain，DD），C端存在典型的TIR（Toll/interleukin-1 receptor）結構域。TfMyD88與其它脊椎動物MyD88的氨基酸相似性達57.58%-82.64%，系統進化樹分析表明TfMyD88與同屬鱸形總目的花鱸和鱖魚聚在一起，所有魚類MyD88聚為一支。Real-time PCR檢測顯示TfMyD88廣泛表達于松江鱸各組織，但在鰓中的相對表達量最高；其次為脾臟和皮膚。LPS（lipopolysaccharide）刺激后，TfMyD88在松江鱸的血液、肝臟、皮膚、脾臟均出現明顯上調。刺激2 h后，在血液TfMyD88表達量升高了近60倍，在皮膚中的表達量也升高了27倍。上述結果表明TfMyD88可能參與松江鱸先天免疫。

松江鱸；MyD88；基因克??；先天免疫；LPS

魚類作為低等脊椎動物，主要依靠固有性免疫（innate immunity）抵抗外來病原微生物感染。固有性免疫是通過模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）特異性地識別病原體的病原相關分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）來啟動的。TOLL樣受體（toll like receptors，TLRs）是迄今研究最多的模式識別受體，它們能夠特異性地識別PAMPs，并將信號轉導入細胞內，引發胞內的級聯信號反應，最終活化核轉錄因子-κB（NF-κB），介導和引發炎癥應答［1］。髓樣分化因子MyD88是TLR信號轉導通路中關鍵的接頭分子［2，3］，由3個功能區域組成。C端為TIR（Tolllike/IL-1 receptor）結構域，該結構域為Toll/白細胞介素-1受體（interleukin-1 receptor，IL-1R）家族和死亡結構域家族成員所特有。當機體受到刺激后，TLRs會識別并結合相應的PAMP，由此導致TLRs的分子結構發生構象改變，TLRs胞漿中TIR結構域便會與MyD88 C端的TIR結構域相互作用形成TIRMyD88復合體。MyD88 N端是一死亡結構域（death domain，DD），該區域參與胞質信號傳導，在腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis factor receptor，TNF-R）家族的眾多成員中也有該結構域。TIR-MyD88復合體形成后，即通過DD結構域招募下游的IRAKs（IL-1 receptor associated kinase，IRAK），使其磷酸化而脫離MyD88，繼而與腫瘤壞死因子受體相關因子6（tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6）結合，從而啟動下游的一系列免疫反應［4-6］。MyD88還有一個連接DD和TIR結構域的中間區域，這一段區域可能參與了IFN-γR信號傳導［7］。

目前，已有多個哺乳動物［8，9］、禽類［10］、爬行類［11］等脊椎動物的MyD88分子相繼被鑒別。魚類中斑馬魚（Danio rerio）［12］、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）［13］、大黃魚（Pseudosciaena crocea）［14］、半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）［15］、條石鯛（Oplegnathus fasciatus）［16］、斜帶石斑（Epinephelus coioides）［17］和牙鲆（Paralichthys olivaceus）［18］等的MyD88基因也已被克隆鑒定。

松江鱸（Trachidermus fasciatus）是一種降海產卵洄游魚類，歷史上在我國沿海均有分布。但是近年來種群數量急劇降低，已被列為國家Ⅱ級保護動物。為恢復其自然種群，人工養殖勢在必行。然而，養殖過程中各種應激刺激的存在勢必會引起各種疾病的出現和蔓延，鑒于這種情況，本實驗室已經開展對松江鱸的免疫學研究，從固有性免疫的TLR信號通路入手，已對TLR信號通路中的白細胞介素-1受體相關激酶4（interleukin-1 receptor-associated kinase 4，IRAK4）和白介素1β（interleukin-1β，IL-1β）基因的性質和表達模式進行了研究分析［19］。本試驗則成功地克隆了松江鱸的TfMyD88全長cDNA序列，并進行了生物信息學分析；應用Real-time PCR技術對TfMyD88在松江鱸10種組織中的表達譜以及LPS刺激后的表達模式變化進行檢測和分析，旨在為開展其功能研究奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 9-10月齡松江鱸，取自山東文登埠口松江鱸自然保護區。在試驗開始之前，松江鱸預先在12℃-14℃的循環海水箱中飼養1周使其適應試驗條件。選取體重為15-23 g的正常個體，用三卡因甲基磺酸鹽（Sigma，St. Louis，MO，USA）麻醉后先用1 mL無菌注射器進行心臟采血，然后解剖魚體，取其心臟、肝臟、鰓、腸、皮膚、腎臟、脾臟、腦、卵等組織，立即投入液氮，爾后轉入-80℃冰箱保存，用于正常組織RNA提取。

1.1.2 主要試劑 RNA提取試劑盒（EZNATMMicro-Elute?total RNAKit II ）為美國QMEGA公司產品，逆轉錄酶（Reverse Transcriptase M-MLV）、RNA酶抑制劑、dNTP Mixture（10 mmol/L）、T4 DNA Ligase購自TaKaRa Biotechnology產品（日本），Taq酶、PCR mix kit、DL2000 DNA maker為廣州東盛生物科技有限公司產品，PCR產物回收Kit購自上海生工生物技術有限公司（下文簡稱上海生工），引物合成和測序均由上海生工完成。

1.2 方法

1.2.1 感染試驗 健康松江鱸100尾平均分為2組，一組腹腔注射LPS（lipopolysaccharide）（0.04 mg/kg），對照組以PBS（50 μL/條）取代LPS。刺激2、6、12、24、48、72和96 h后麻醉取樣（每個時間點每組取6尾）。首先用無菌注射器心臟取血，然后分別取其肝臟、皮膚、脾臟。將同一組別的相同組織保存在同一凍存管中，投入液氮，再轉入-80℃冰箱保存備用。

1.2.2 總RNA提取及cDNA合成 根據EZNATMMicroElute?total RNA Kit II試劑盒（QMEGA，USA）的操作說明，提取正常組織和刺激后各組織的總mRNA。cDNA的合成具體試驗方法參考文獻［20］。PCR所用引物（Smart F、Oligo-anchor R）見表1。

表1 本研究所用PCR引物序列

1.2.3 TfMyD88全長的克隆 參照GenBank中已發表的牙鲆（AB241074.1）、條石鯛（HM035064.1）、點帶石斑（HM590879.1）、花鱸（Lateolabrax japonicus）（JQ228862.1）、 大 黃 魚（Larimichthys crocea）（EU978950.1）、 鮸 魚（Miichthys miiuy）（JQ17835-6.1）、羅非魚（Oreochromis niloticus）（KJ130039.1）和鱖魚（Siniperca chuatsi）（HQ014593.1）的MyD88基因序列，用DNAman進行多序列比對，在結合Primer 5.0軟件在相對保守的區域設計兼并引物TfMFmiddle和TfMRmiddle。以肝臟cDNA為模板進行PCR，PCR條件為：94℃預變性5 min；94℃變性50 s，55℃退火45 s，72℃延伸90 s，30次循環；72℃延伸10 min。把純化的PCR產物與T載體pMD 18-T連接，轉入DH5α菌株中送到上海生工測序（測序引物M13-47和RV-M，見表1）。經BLAST得到中間片段后，再根據已知序列設計基因特異性后引物TfMR，與5' primer配對進行5' 末端的克隆；設計基因特異性前引物TfMF，與3' anchor配對進行3'末端克隆，克隆條件同前（上述各引物序列具體見表1）。PCR產物純化后送上海生工測序，得到5' 末端和3' 末端序列。

1.2.4 TfMyD88序列分析、結構預測和進化樹構建

TfMyD88 cDNA氨基酸的翻譯和蛋分子量及等電點的預測通過ExPASy（http：//www.au.expasy.org/）完成。通過SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）對蛋白的結構域進行預測。基于BLAST搜查同源序列對TfMyD88在氨基酸水平上進行同源比對和進化樹構建，同源序列比對通過ClustalW和BioEdit完成，進化樹通過MEGA4.0構建。1.2.5 實時定量PCR（Qrt-PCR）分析 根據已克隆測序的TfMyD88基因設計一對qRT-PCR的引物（QTfF，QTfR），將10正常個組織和刺激后的4個免疫相關組織（血液、肝臟、皮膚、脾臟）的RNA反轉錄成cDNA作為模板進行qRT-PCR。內參基因為β-Actin，所用引物ActinF和ActinR參考文獻［20］。反應體系為10 μL 2×SYBR Premix Ex TaqTM，2 μL 1∶50稀釋的cDNA，引物各4 μL。使用7300實時熒光定量PCR儀（美國，Applied Biosystems）進行松江鱸基因表達定量。PCR反應條件為：94℃3 min；94℃ 15 s，60℃ 60 s，40個循環。每個待測樣品cDNA設置3個平行。mRNA相對表達量根據2-ΔΔCt法計算［21］，使用t檢驗的方法分析差異顯著性，P＜0.05為可接受的顯著性差異標準。

2 結果

2.1 松江鱸TfMyD88的基因克隆和序列分析

利用兼并引物克隆得到長度為545 bp的cDNA序列，BLAST分析之后顯示該片段與鱖魚的MyD88有較高的同源性。利用基因特異性前引物TfMF和3' -anchor R配對克隆得到TfMyD88 cDNA序列完整的3'末端，長度為591 bp。利用基因特異性前引物TfMR和5'primer配對克隆得到TfMyD88 cDNA序列完整的5'末端，長度為422 bp。利用DNAman等軟件對已知中間序列、5' 末端和3'末端序列進行拼接，得到1 555 bp的TfMyD88全長cDNA序列，其中5' 非編碼區（5' UTR）長89 bp，3'非編碼區（3' UTR）長599 bp，開放閱讀框（ORF）長867 bp，編碼288個氨基酸（TfMyD88cDNA序列全長和推導的氨基酸序列，見圖1），編碼的蛋白推測的相對分子質量（MW）為33 103.2，理論等電點（pI）為5.08。利用SMART進行結構域預測，TfMyD88分子包括兩個結構域：N端的死亡結構域（DD），C端的TIR結構域。死亡結構域的位置為12-103氨基酸，TIR結構域為152-288氨基酸（圖2）。

圖1 TfMyD88序列全長及其推導的氨基酸序列

圖2 預測結構域示意圖

2.2 TfMyD88同源比對和系統進化樹構建

將TfMyD88蛋白的氨基酸序列與人（Homo sapiens）（AAB49967.1）、家鼠（Mus musculus）（AAC-53013.1）、斑胸草雀（Taeniopygia guttata）（XP_00-2196761.1）、中華鱉（Pelodiscus sinensis）（ADR742-34.1）、非洲爪蟾（Xenopus laevis）（NP_00108100-1.1）、斑馬魚（AAQ90476.1）、鯉魚（Cyprinus carpio）（ADE20131.1）、虹鱒（CAI48087.1）、青鳉（Oryzias latipes）（XP_004081134.1）、花鱸（AEY83971.1）和鱖魚（ADM25313.1）的MyD88氨基酸進行序列對比，結果（圖3）發現其相似度分別達到57.58%、59.93%、59.00%、58.8%、59.45%、68.51%、68.17%、68.51%、76.74%、78.33%和 82.64%。12個物種TIR結構域同源性更高，尤其是位于其中的box1、box2和box3序列高度保守，而box1中的FDA基序、box2中的“VLPG”和box3中的“FW”基序在各物種均保持不變。

通過MEGA4.0的Neighbor-joining法分析，用重復1 000次的計算方法構建了分子系統發育樹。結果（圖4）顯示，松江鱸TfMyD88與同為鱸形總目的花鱸和鱖魚的MyD88關系最近，所有魚類的MyD88單獨聚為進化樹的一大分支，其他脊椎動物MyD88聚為一支。

2.3 MyD88基因的表達分析

2.3.1 MyD88基因在不同組織中的表達模式 以持家基因β-actin為內參，經qRT-PCR分析（圖5）發現，MyD88廣泛表達于松江鱸各組織器官。其中，在鰓中的相對表達量最高，其次為脾臟和皮膚。

2.3.2 LPS刺激后TfMyD88的表達模式變化 用qRT-PCR的方法研究了受LPS刺激后，TfMyD88在松江鱸血液、肝臟、皮膚和脾臟中的表達模式變化。結果（圖6）顯示，TfMyD88在各器官表達均明顯上調，但上調模式有所不同。在皮膚中，LPS刺激2 h后，表達量即達到正常時的27倍，之后下調但一直高于正常值。在血液中，2 h時表達量達到正常的60倍，之后表達量快速降低至低于正常，只是在24 h有小幅度的上調，為正常時的1.6倍。在肝臟中，TfMyD88的表達量也在刺激后2 h快速上調，隨后慢慢下調，到24 h時恢復到正常水平，但隨后表達量發生2次升高，至96 h達到最高值，為正常時的10倍。在脾臟中，于刺激后12 h TfMyD88表達量才緩慢上調到正常時的2.6倍，然后恢復到正常水平，在72-96 h又出現小幅上調。

圖3 TfMyD88蛋白序列與其他物種的MyD88的多序列比對

3 討論

本研究首次成功克隆到松江鱸TfMyD88全長cDNA序列，其中ORF為867 bp，編碼288個氨基酸。用DNAman軟件分析發現，TfMyD88與其他硬骨魚的核苷酸序列同源性均在70%以上，其中與鱖魚的同源性高達82.64%，說明MyD88分子在基因進化過程中保守性較高。這可能是因為MyD88在TLR信號通路中，作為一個關鍵的接頭分子，在機體的先天免疫中發揮重要作用。

圖4 基于TfMyD88的系統進化樹分析

圖5 MyD88基因在松江鱸正常組織的表達模式

圖6 LPS刺激后MyD88在松江鱸不同組織的表達模式變化

結構域預測表明，TfMyD88存在N端的死亡結構域、C端的TIR結構域及其中間區域。TIR結構域有137個氨基酸，具有高度的保守性，這與Jault等［12］在斑馬魚中發現的結果相一致，這可能是TLR信號通路中TLRs與MyD88相互作用的結構基礎。其中，TfMyD88的box1序列為“FDAFICYCK”，這與其他魚類有一個氨基酸的差別，松江鱸box1最后一個氨基酸為賴氨酸（K），而其他魚類該位置是谷氨酰胺（Q），機制有待研究；box2序列為“LCVFDRDVLPGSC”，但box2的第4個氨基酸苯丙氨酸（F）在哺乳動物中卻是絲氨酸（S），該氨基酸是否對TIR互作有影響還未見報導。box2中第6位的精氨酸（R）、第7位的天冬氨酸（D）和第11位的甘氨酸（G）殘基能形成BB-loop區，在TIR-TIR的相互作用中十分重要［22］。可能正因如此，這3個氨基酸在各物種均保持不變。相對于box1和box2而言，box3的保守性比較低。但是“FW”基序的保守性極高，其在信號轉導中是否有重要作用還需要進一步研究。MyD88中間區域的作用已經越來越受到關注，MyD88與干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）誘導產生的細胞因子和趨化因有關［23］，其中參與到該過程的結構域據推測就是中間結構域［7］。TfMyD88的中間區域較哺乳動物少了2個氨基酸，缺失的兩個氨基酸是否影響MyD88在松江鱸IFN-γ信號通路中的作用也還需要進一步研究。

qRT-PCR結果顯示TfMyD88廣泛表達于松江鱸的10種組織，這與之前的研究報道相似，在牙鲆［24］、點帶石斑［25］、鮸魚［26］和半滑舌鰨［15］中均發現MyD88的廣泛表達。TfMyD88在鰓中的表達量最高，Tang等［26］對鮸魚研究發現，其MyD88在肝臟中的表達量最高，通過對牙鲆［24］的研究，其高表達量的組織包括鰓、頭腎、皮膚、脾臟和腸。從上述研究結果來看，雖然MyD88廣泛分布于動物體內的各器官組織，但是對于不同的物種，不同組織的表達量還是有一定的差異。相對來說，TfMyD88在松江鱸的鰓和血液中的表達較高，可能是因為鰓和皮膚作為機體的第一道物理屏障，首先與病原體接觸，TOLL樣受體信號路徑在此處識別病原體，在免疫監督防御中發揮重要作用。

受LPS刺激后，松江鱸皮膚和血液中的TfMyD88在刺激后2 h表達量迅速上調至最大值；肝臟中也在2 h有一個上調小高峰，在96 h達到最大表達量；脾臟中的TfMyD88是在刺激后12 h達到最大值。條石鯛受LPS刺激后，血液中的MyD88的最高表達量是出現在刺激后的12 h，脾臟的峰值是在刺激后3 h［16］；在牙鲆中，用LPS刺激外周血細胞，MyD88表達上調［24］。MyD88在免疫相關組織中的高量表達以及受到刺激后表達的快速上調都說明其可能在免疫反應中起重要作用。本實驗室曾研究發現，受LPS刺激后，松江鱸血液和皮膚中的IRAK4和IL-1β均在刺激后的2 h表達量上調至最大值，二者在肝臟和脾臟中的表達模式也與TfMyD88的表達模式高度相似［19］。這可能是因為與哺乳動物相同，松江鱸MyD88在TLR信號通路中，也是通過招募下游的IRAKs開啟免疫應答的。而且，受病原刺激后，TLR信號路徑于松江鱸不同的器官中啟動時間有所不同。

總之，本研究結果表明MyD88參與松江鱸的先天免疫，對病原的侵染具有快速的應答反應，但是對MyD88參與抗病的機制尚需進一步的研究。

4 結論

本研究首次成功克隆到松江鱸TfMyD88全長cDNA序列，TfMyD88 cDNA全長1 555 bp，編碼288個氨基酸。TfMyD88含有兩個結構域：死亡結構域（DD）和TIR結構域。TfMyD88廣泛表達于松江鱸各組織，但在鰓中表達最為豐富。LPS刺激后，在血液、肝臟、皮膚、脾臟 mRNA表達均明顯上調。

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（責任編輯 李楠）

Molecular Cloning and Expression Analysis of MyD88 in Roughskin Soulpin，Trachidermus fasciatus

Bi Caihong Zhang Qiuxia Yu Shanshan Chen Xuezhao Liu Chunying Zhu Qian
（School of Marine Science，Shandong University（Weihai），Weihai 264209）

Myeloid differentiation factor 88（TfMyD88） is a key adaptor protein in the Toll-madiated signaling passway. In this study，we cloned the full-length cDNA from the roughskin soulpin， Trachidermus fasciatus. The full-length of MyD88 was 1 555 bp， which contained an open reading frame（ORF） of 867 bp encoding a polypeptide of 288 amino acids. The deduced amino acid sequence has a conserved death domain（DD） at the N-terminal and a typical Toll/interleukin-1 receptor（TIR） domain at the C-terminal. The mRNA expression patterns of TfMyD88 in healthy and LPS challenged roughskin soulpin were detected using quantitative Real-time PCR. MyD88 was expressed broadly in the blood， heart， liver， gill， intestine， skin， musle， kidney， spleen， brain， with the highest expression in the gill. The expression of TfMyD88 post challenge with LPS（lipopolysaccharide） was detected in blood， liver， gill， skin and spleen. The up-regulation of the expression levels of TfMyD88 in all the detccted tissues after chanllaged by LPS suggests that MyD88 plays an important role in roughskin soulpin defenses against bacterial infection.

Trachidermus fasciatus；MyD88；gene clone；innate immunity；LPS

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.020

2014-06-24

威海市科技攻關計劃項目（0000413420608），威海市科委項目（1070432121313）

畢彩紅，女，碩士研究生，研究方向：海洋生物學；E-mail：huasa1cu@126.com

祝茜，博士，教授，博士生導師，研究方向：海洋生物學；E-mail：qianzhu@sdu.edu.cn