家蠅Thymosin（THY）基因的克隆及原核表達

王宇吳高吉羅曼彭傳林修江帆尚小麗吳建偉

（1.貴陽醫學院基礎醫學院，貴陽 550004；2.貴州省疾病預防控制中心，貴陽 550004）

家蠅Thymosin（THY）基因的克隆及原核表達

王宇1、2吳高吉1羅曼1彭傳林1修江帆1尚小麗1吳建偉1

（1.貴陽醫學院基礎醫學院，貴陽 550004；2.貴州省疾病預防控制中心，貴陽 550004）

采用EST測序技術從構建的家蠅（Musca domestica）幼蟲cDNA質粒文庫中篩選到胸腺肽（Thymosin，THY）基因，以該基因的cDNA文庫質粒為模板，設計引物，通過PCR擴增，測序鑒定，獲得THY基因完整編碼序列。運用生物信息學方法對該基因及其編碼蛋白的基本理化性質、信號肽和亞細胞定位等方面進行預測和分析。構建pET-28a（+）-THY重組質粒，轉化到大腸桿菌BL21（DE3）中進行誘導表達。研究結果表明，THY基因ORF全長384 bp，編碼127個氨基酸，理論分子量14.3 kD，等電點為5.22，具有THY家族的蛋白保守結構域。構建重組原核質粒pET-28a（+）-THY，經IPTG誘導，蛋白在大腸桿菌中獲得表達，經親和層析柱純化獲得目的蛋白，Western blot檢測發現純化的目的蛋白大小正確。

家蠅；胸腺肽；克隆；原核表達

胸腺肽THY超家族（Thymosin superfamily）蛋白屬于保守的假想蛋白，迄今為止已經在果蠅（Drosophila melanogaster）、埃及伊蚊（Aedes aegypti）、家蠶（Bombyx mori）等昆蟲物種中發現含THY保守結構域的序列［1-3］。THY蛋白保守區序列與β族胸腺素（β-Thymosin，Tβ）有較高的同源性，Tβ是一種多功能分子，在促進創傷愈合、組織再生、抗細胞凋亡和抗炎癥等方面起到重要作用［4］。Tβ含有一個WH2結構域，為一個actin單體結合位點，含有WH2結構域的蛋白廣泛存在于各物種中，屬于肌動蛋白結合蛋白，在肌動蛋白動力學中發揮多樣調節作用［5，6］。在與肌動蛋白結合過程中，Tβ會改變構象，有利于識別分子靶標，可與免疫和細胞生長的級聯信號間相互傳遞信息［7，8］。通過調節肌動蛋白的動力學結構使得肌動蛋白骨架處在不斷重塑的過程中，進而在細胞運動能力、成纖維細胞遷移、內吞作用中發揮重要作用［9］。對家蠶THY的研究中發現其通過結合肌動蛋白在參與調節家蠶形態學結構的改變和生理功能的形成過程中起到重要的作用［1］。

家蠅呈世界性分布，是重要的媒介昆蟲，對環境適應能力強，有強大的先天性免疫系統及生長代謝調節功能。目前關于家蠅生長代謝發育調節基因的研究鮮有報道，同時未見家蠅THY基因的研究。本研究通過構建pET-28a（+）-THY原核表達載體，并對其原核表達產物進行純化獲得THY蛋白質，旨在為進一步研究家蠅THY蛋白的生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試蟲、載體和菌株 家蠅3齡幼蟲由貴陽醫學院病原生物學實驗室飼養，飼養溫度28℃，相對濕度65%，光照周期10L∶14D。pET-28a（+）質粒，大腸桿菌BL21（DE3）由貴陽醫學院病原生物學實驗室常規保存。

1.1.2 試劑 總RNA提取試劑盒（RNAiso PLUS）、逆轉錄試劑盒、Taq DNA聚合酶、DNA標志物（DL2000 DNA Marker）、瓊脂糖等購置于TaKaRa公司；蛋白Marker購自Fermentas公司；Ni-NTA Agarose 購自Merk公司；一抗兔抗His-Tag單克隆抗體、二抗辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgA抗體、DAB顯色試劑盒購自中杉金橋公司，其余所用的化學試劑（無水乙醇、三氯甲烷、異丙醇等）均為國產分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 THY基因的生物信息學分析 通過NCBI網站（http：//www.ncbi.blastX）獲取家蠅（Musca domestica XP_005179401.1）；果蠅（Drosophila melanogaster NP_525065.1）；埃及伊蚊（Aedes aegypti XP_00-1663844.1）；家蠶（Bombyx mori NP_001103818.1）；地中海實蠅（Ceratitis capitata XP_004527242.1）的THY同源蛋白序列進行序列比對，分析該基因蛋白的氨基酸序列與其他蛋白質氨基酸序列的相似性，判斷其是否為全長基因等；用 DNAclub軟件分析cDNA 序列和開放閱讀框；運用Signal P分析信號肽序列；運用PHD的在線分析工具分析蛋白保守結構域；利用蛋白分析專家系統（Expert protein analysis system，ExPASy）的在線分析軟件Protparam，分析預測蛋白質的氨基酸殘基性質、分子量及理論等電點等［10］。

1.2.2 總RNA提取及cDNA合成 總RNA的抽提按照TaKaRa公司的RNAiso PLUS說明書進行操作。總RNA經電泳檢測，GeneQuant公司核酸定量分析儀測定A260/A280比值及濃度，選取A260/A280比值范圍為1.8-2.0的樣本，以1 μg總RNA為模板，按照cDNA合成試劑盒說明書合成cDNA。

1.2.3 引物的設計合成、基因擴增 根據GenBank登錄號：用Premier 5.0設計引物，設計引物THY-F：5'-CGCGAATTCATGGCTGCACCTGCTCTT-3'，帶EcoR I酶切位點；THY -R：5'-CGCCTCGAGTTAACCTCTCTTTTCTTCCTCG-3'，帶XhoⅠ酶切位點。以cDNA為模板，應用上述設計的特異引物擴增目的基因，PCR 產物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定回收、測序鑒定。

1.2.4 重組原核表達質粒的構建及鑒定 將PCR產物膠回收后和原核表達質粒 pET-28a（+）用EcoR I和XhoⅠ進行雙酶切后回收，連接、轉化大腸埃希菌BL21/DE3感受態細胞，卡那霉素篩選陽性單克隆，提取的重組質粒進行雙酶切、PCR擴增和DNA測序鑒定后進行原核表達。

1.2.5 重組蛋白的誘導表達、純化及Western blot鑒定 挑取含有pET-28a（+）-THY重組質粒的 E.coli BL21/ DE3 的單菌落接種于含卡那霉素的 LB 液體培養基中（空質粒pET-28a（+） 的 BL21/DE3作為陰性對照），放入37℃搖床，搖至OD600約為0.6 時，取1 mL作為誘導前樣品，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，5 h后所有樣品離心后收集菌體處理后離心取上清行SDS-PAGE電泳分析。依據上述誘導表達方法對陽性克隆進行大量的誘導表達，離心收集菌體，冰上超聲裂解后離心收集上清并過濾，參照Ni-IDA Agarose說明書進行蛋白純化，收集蛋白洗脫液，SDS-PAGE電泳分析目的蛋白，將洗脫的蛋白經超濾管（分子截留為10 kD）離心濃縮目的蛋白，超濾后的蛋白-80℃保存備用。通過Western blot檢驗重組目的蛋白，用5%脫脂奶粉4℃過夜封閉；TBST沖洗，加入1∶500稀釋的抗His標簽的抗體（一抗），室溫孵育2 h；TBST沖洗后加入1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG抗體（二抗），室溫孵育1 h［11］。采用DAB顯色試劑盒顯色。

2 結果

2.1 家蠅THY基因的生物信息學分析

通過生物信息學分析，該cDNA序列ORF長為384 bp，編碼127個氨基酸（圖1）。其含有一個能夠識別結合位點的保守短基序LKHTET，該基序在哺乳動物及家蠶THY的研究中證實與肌動蛋白結合關系較密切。預測家蠅THY蛋白的理論分子量為14.3 kD，等電點為5.22，屬于酸性蛋白質。多重序列比對結果分析顯示，家蠅THY與其他物種來源的THY氨基酸序列同源性較高（與果蠅為82%，埃及伊蚊為70%，家蠶為74%，地中海實蠅為84%），均具有3個保守的Thymosin 超家族結構域（圖2）。在哺乳細胞體內表達的半衰期為30 h，在酵母和大腸桿菌中體內表達的半衰期分別大于20 h和10 h。在溶液中的不穩定指數為46.63，預測在溶液中性質不穩定。脂肪族指數71.57，總親水性平均系數GRAVY -0.993，蛋白質總體疏水性系數低。信號肽預測結果顯示無信號肽。

圖1 THY基因開放閱讀框cDNA序列及對應編碼的氨基酸序列

圖2 不同物種來源的THY氨基酸序列比對分析

2.2 原核重組質粒的鑒定

將重組質粒進行PCR和雙酶切鑒定，產物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。結果（圖3）顯示約380 bp處有一清晰的條帶，與目的基因的大小基本相符，測序證明重組質粒構建成功。

2.3 蛋白表達、純化及鑒定

將構建好的重組質粒轉化到BL21/DE3中表達，15% SDS-PAGE電泳分析結果（圖4第4、5泳道）所示，大約在18 kD（與His標簽約4 kD融合后）左右處出現表達條帶，將蛋白純化后超濾濃縮，結果如第7泳道所示，證明目的蛋白純化成功。對誘導表達后純化的融合蛋白做Western blot驗證，用DAB法在PVDF膜上顯色，結果顯示目的條帶單一且清晰，說明目的蛋白表達正確。蛋白濃度測定為0.35 mg/mL。

3 討論

昆蟲THY是一個多功能分子，具有創傷修復、、組織再生，通過結合肌動蛋白調節昆蟲的生理功能及形態結構，其序列具有高度保守性。對家蠶THY的研究發現其具有結合肌動蛋白進而影響家蠶生長發育的功能，同時其在體內的調節作用較強，是機體能夠維持內穩態的關鍵因子［1］。

圖3 重組質粒的PCR及雙酶切鑒定

圖4 THY重組蛋白的誘導表達

本研究從家蠅幼蟲cDNA文庫［12］中篩選到THY基因序列，全長384 bp，編碼127個氨基酸，理論分子量為14.3 kD，等電點為5.22，屬于酸性蛋白質。通過結構域預測顯示家蠅THY蛋白中含有3個Thymosin的功能域，屬于THY超家族。為進一步了解該蛋白的特性，將目的基因克隆入pET-28a（+）載體，構建pET-28a（+）-THY重組表達質粒，將重組質粒轉化到BL21感受態細胞中，用IPTG誘導表達得到相對分子質量約為18 kD的重組胸腺肽，并通過Western blot驗證顯示純化后的蛋白與目的蛋白大小一致。

Tβ中與肌動蛋白結合關系極為密切的六肽基序LKKTET在整個家族蛋白中很保守，這段序列扮演著識別結合位點的重要角色［13-16］。在家蠅THY和其他物種的THY蛋白結構域中也發現這樣的保守的序列（圖2已標注出六肽基序所在區，在昆蟲中多為LKHTET），推測在家蠅體內該基序也具有結合肌動蛋白的功能，通過阻斷該位點與肌動蛋白的結合有可能控制家蠅生長發育，從而為家蠅的防治提供新靶點。與THY高度同源的Tβ功能研究中也是圍繞其與肌動蛋白的關系展開的，研究顯示Tβ與免疫調節，腫瘤發生，細胞遷移，血管生存，創傷愈合等有密切關系的生物學活性［17］，這些研究結果為下一步家蠅THY的功能研究提供理論基礎。

4 結論

本研究克隆了家蠅THY基因，全長384 bp，編碼127個氨基酸，成功構建pET-28a（+）-THY重組質粒并在大腸桿菌中進行表達，親和層析法純化了目的蛋白THY，繼而用Western blot驗證獲得的目的蛋白。

［1］ Zhang WP， Zhang CR， Lv ZB， et al. Molecular characterization，tissue distribution， subcellular localization and actin-sequestering function of a thymosin protein from silkwom［J］. PLoS ONE， 2012，7（2）：e31040.

［2］Clark AG， Eisen MB， Smith DR， et al. Evolution of genes and genomes on the Drosophila phylogeny［J］. Nature， 2007， 450：203-218.

［3］Holt RA， Subramanian GM， Halpern A， et al. The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae［J］. Science， 2002，298：129-149.

［4］丁大有， 馬素永， 許松山， 等. 胸腺素β4與藥物開發［J］. 生命的化學， 2012， 32（1）：67-71.

［5］Paunola E， Mattila PK， Lappalainen P. WH2 domain：a small，versatile adapter for actin monomers［J］. FEBS Lett， 2002， 513（1）：92-97.

［6］Koshikawa S， Cornette R， Matsumoto T， et al. The homolog of Ciboulot in the termite（Hodotermopsis sjostedti）：a multimeric β-thymosin involved in soldier-specific morphogenesis［J］. BMC Developmental Biology， 2010， 10：63.

［7］Dedova IV， Nikolaeva OP， Safer D， et al. Thymosin beta4 induces a conformational change in actin monomers［J］. Biophys J， 2006， 90（3）：985-992.

［8］Irobi E， Aguda AH， Larsson M， et al. Structural basis of actin sequestration by thymosin-β4：implications for WH2 proteins［J］. EMBO J， 2004， 23（18）：3599-3608.

［9］Dominguez R. The beta-thymosin/WH2 fold：multifunctionality and structure［J］. Ann NY Acad Sci， 2007， 111（2）：86-94.

［10］國果， 吳沁怡， 吳建偉， 等. 家蠅泛素結合酶基因的生物信息學分析［J］. 生物技術通報， 2014（2）：107-111.

［11］ 劉小寧， 李芬， 趙文博， 等. 棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）FK506結合蛋白基因的克隆、表達與純化［J］. 生物技術通報，2014（4）：115-120.

［12］劉紅美， 張潔， 王贇， 等. 熱脅迫后家蠅幼蟲cDNA文庫構建與隨機EST測序分析［J］. 免疫學雜志， 2010， 9：772-775.

［13］Aguda AH， Xue B， Trobi E， et al. The structural basis of actin interaction with multiple WH2/beta-thymosin motif-containing proteins［J］. Structure， 2006， 14（3）：469-476.

［14］Dhaese S， Vandepoele K， Waterschoot D， et al. The mouse thymosin beta15 gene family displays unique complexity and encodes a functional thymosin repeat［J］. J Mol Biol， 2009， 387：809-825.

［15］Zoubek RE， Hannappel E. Subcellular distribution of thymosin beta4［J］. Ann NY Acad Sci， 2007， 1112：442-450.

［16］Rossenu S， Leyman S， Dewitte D， et al. A phage display based method for determination of relative affinities of mutants，application of the actin-binding motifs in thymosin beta 4 and the villin headpiece［J］. J Biol Chem， 2003， 278（19）：16642-16650.

［17］王春卉， 宋海峰， 劉秀文. β族胸腺素研究進展［J］. 中國新藥雜志， 2006， 15（8）：580-584.

（責任編輯 李楠）

Cloning and Prokaryotic Expression of Musca domestica Thymosin Gene

Wang Yu1，2Wu Gaoji1Luo Man1Peng Chuanlin1Xiu Jiangfan1Shang Xiaoli1Wu Jianwei1
（1. Basic Medical College，Guiyang Medical College，Guiyang 550004；2. Guizhou Provincial Center for Disease Control Prevention，Guiyang 550004）

In order to clone and analyze the prokaryotic expression of thymosin gene from Musca domestica， the thymosin gene which was isolated from Musca domestica cDNA library， was analyzed by the bioinformatics methods in the following aspects， including general physical and chemical properties， signal peptide and subcellular localization. The expression construct pET-28a（+）-THY was preformed. The open reading frame of the thymosin gene was 384 bp that encoded a putative protein with 127 amino acids. The protein with predicted molecular weight 14.3 kD and pI of 5.22， has the conserved thymosin domain that belongs to thymosin family. The result showed that the recombinant prokaryotic expression vector pET-28a （+）-THY was successfully constructed and fusion protein was expressed in E. coli. SDS-PAGE and Western blot analysis indicated that the fusion protein that purified using Ni2+affinity chromatography had the predicted size.

Musca domestica；thymosin；cloning；prokaryotic expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.021

2014-07-01

國家科技支撐計劃（2011BAC06B12），國家自然科學基金項目（81360254）

王宇，男，博士研究生，研究方向：昆蟲分子生物學；E-mail：wangzhongyuwy@163.com

吳建偉，男，博士，研究方向：昆蟲免疫學及生物活性物質利用；E-mail：wjw@gmc.edu.cn