有性雜交選育銀耳優良菌株的初步研究

賀元川陳仕江楊勇賀宗毅張德利柴佳炎

（1. 重慶市中藥研究院，重慶 400065；2. 重慶黔江朵朵潤耳責任有限公司，重慶 409000）

有性雜交選育銀耳優良菌株的初步研究

賀元川1陳仕江1楊勇1賀宗毅1張德利1柴佳炎2

（1. 重慶市中藥研究院，重慶 400065；2. 重慶黔江朵朵潤耳責任有限公司，重慶 409000）

為了解決銀耳栽培生產中存在菌株優良性狀單一，生產效率較低等問題，采用銀科1#和Tr21兩個不同品種菌株為親本菌株，通過單孢子分離選取50個有性孢子單核體、兩兩配對有性雜交試驗，顯微觀察鏡檢鑒定，統計雜交成功率為36%、雜交菌株與親本的拮抗試驗選育出7株雜交株，栽培對比農藝性狀評價選育出1株（GT3）比親本菌株生長快，生物轉化率較高的菌株。試驗結果表明有性雜交育種可作為一種行之有效的篩選銀耳優良菌株的方法。

銀耳；單孢分離；有性雜交；優良菌株

銀耳（Tremella fuciformis）又稱白木耳。在真菌分類學中隸屬于擔子菌門（Basidiomycota）、銀耳綱（Tremellomycetes）、銀耳目（Tremellales）、銀耳科（Tremellaceae）。銀耳是一種藥用價值極高的藥食真菌，性平、味甘淡、無毒，具有提高肝臟解毒能力、保護肝臟、增強機體抗腫瘤能力、扶正固本的功效，歷來是一種高級滋養補品［1］。銀耳在藥食用菌產量中占重要地位，其栽培業成為福建古田、四川通江、重慶黔江等地的重要產業。近年來由于育種工作選育的滯后，嚴重影響了該產業的發展，因此對銀耳高產優質菌株的篩選和選育工作勢在必行。目前的栽培銀耳品種普遍存在菌種衰退快、產量不高、抗逆性差、適應性弱等現象，已嚴重影響銀耳的產量與品質，阻礙了銀耳產業的健康發展［2］。

藥食用菌的常用育種途徑主要有：野生馴化、孢子分離、雜交育種，其他如原生質體融合技術、基因工程育種、誘變育種等新技術，手段也在不斷的嘗試中。雜交育種自20世紀80年代以來，香菇、金針菇、木耳等食用菌新品種都通過雜交育種，并陸續投入生產，加快了我國成為食用菌超級大國的步伐。目前雜交育種在食用菌新菌株選育中占有重要的地位，逐漸成為食用菌新品種篩選的有力手段和方法［3］。銀耳屬于雙因子控制的四極性異宗配合菌類，一個擔子能產生4個不同極性的有性孢子，它們之間交配反應受兩套因子控制，A（a）和B（b），A因子控制配對芽孢萌發管的產生，B因子控制配對產生的萌發管是否形成具有鎖狀聯合的雙核菌絲。只有擔孢子雜交后獲得AaBb等位基因的雙核菌絲才能成功出耳［4］。但是銀耳育種的報道有太空育種，誘變育種等，當時僅限于實驗室研究，由于變異的不定向，不穩定導致后期篩選工作繁雜，尚未將穩定菌株應用于實際生產當中［5］。雜交育種將親本的優良菌株整合到雜交株中，對于篩選具有多個優良特性的雜交株提供了參考。本研究擬篩選具有優良特性的親本菌株，采用單孢子分離、有性孢子雜交育種、顯微鑒別等技術篩選出雜交菌株，并通過栽培試驗，比較農藝性狀等，以進一步篩選出具有二者親本優良特性的雜交菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 Tr21：子實體成熟時耳片舒展，較白，無小耳蕾，蒂頭黃，耳片下垂，彈性強，菊花形，朵直徑10-14 cm，產量高，單朵鮮重90-150 g，栽培周期35-42 d，抗逆性強，生物轉化率約0.93%-1.34%（干重），子實體形態見圖1。銀科1#：子實體成熟時耳片舒展，米黃色，無小耳蕾，蒂頭黃，耳片肥厚，彈性強，牡丹花形，朵型圓整，直徑10-15 cm，產量較高，單朵鮮重90-120 g，栽培周期33-40 d，生物轉化率0.93%-1.25%（干重），子實體形態見圖2。

圖1 Tr21菌株子實體

圖2 銀科1#菌株子實體

1.1.2 培養基配方

1.1.2.1 PDA培養基（1 L） 去皮土豆200 g，蔗糖20 g，蛋白胨5 g，瓊脂20 g，硫酸鎂3 g，磷酸二氫鉀2 g，pH5.2-5.8。

1.1.2.2 CM培養基（1 L） 香灰木屑100 g，去皮土豆200 g，蔗糖20 g，蛋白胨5 g，瓊脂15-18 g，硫酸鎂3 g，磷酸二氫鉀2 g，pH5.2-5.8。

1.1.2.3 栽培種培養基 青杠木屑78%，麩皮20%，蔗糖1%，石膏1.2%，硫酸鎂0.3%，磷酸二氫鉀0.2%，水分65%。

1.1.2.4 栽培袋培養基 棉耔殼83.5%，麩皮15%，石膏1.5%，蔗糖1%，硫酸鎂0.3%，磷酸二氫鉀0.2%，水65%。

1.2 方法

1.2.1 單孢子分離 選取發育健壯，無病蟲害的成熟的耳片，在超凈工作臺內用無菌水充分洗滌，然后用無菌濾紙吸干水分，采用鉤懸法在小三角瓶內收集孢子。取少量無菌水至三角瓶中，充分混勻，計數，梯度稀釋至10-5/mL，從各梯度中分別吸取150 μL孢子懸浮液于CM平板上面并涂布均勻，于25℃恒溫培養7-10 d，挑選萌發菌絲的菌落鏡檢，觀察有無鎖狀聯合，挑取單孢子萌發的菌落用于后續試驗。

1.2.2 雜交配對 隨機挑取銀科1#和Tr21菌株的單孢子兩兩配對雜交，在同一CM平板上相距0.5 cm接種，于25℃下培養，當兩種單核菌絲接觸萌發菌絲后鏡檢，有鎖狀聯合的菌絲表明配對成功，將其挑至斜面培養，培養后備用。

1.2.3 拮抗試驗 在PDA培養基平板內，采用三點接種法分別接種2個親本菌株與雜交新菌株。每2點間隔1 cm，接種后25℃恒溫箱內培養，觀察記錄各菌株間拮抗狀況。

1.2.4 酶活力的測定 按照上述培養料的配方，采用常規方法進行栽培種的培養，測定雜交菌株與對應香灰菌配比后長滿瓶是白毛團和混合菌絲的纖維素酶，漆酶，多酚氧化酶的活力。分別在菌種瓶中間均勻取白毛團和混合菌絲各5 g（鮮重），加入25 mL蒸餾水并攪勻，浸提2 h后進行抽濾，抽濾后的溶液即為菌絲粗酶液。酶活力測定的具體原理和方法參照施特爾馬赫B著、錢嘉淵譯的《酶的測定方法》［6］。

1.2.5 栽培對比試驗 將雜交菌株與親本進行栽培對比試驗，每個菌株3個重復，每個重復3袋，每袋干料300 g，測定各菌株的子實體產量，培養周期，計數生物學效率，對每個菌株的子實體隨機取樣，測定各個菌株的鮮重和子實體形態特征，以篩選出優于親本的優良菌株。

2 結果

2.1 單孢子分離結果

圖3顯示了單孢子分離平板生長情況，早期萌發菌絲鏡檢可發現鎖狀聯合；前期似酵母樣的菌落，后期逐漸萌發菌絲，無鎖狀聯合，熒光顯微觀察，酵母樣菌落為單核細胞，被確定為單孢子萌發菌絲。早期萌發的菌落可能是親本孢子液體涂布沒有完全分離所致，形成雙核菌絲以及具有鎖狀聯合特征。

圖3 單孢子分離試驗結果

2.2 單孢子配對試驗結果

根據雜交株具有雙核菌絲和鎖狀聯合特征，以及雙核菌絲和單核菌絲萌發速度的差異，借助顯微鏡鏡鏡檢鑒定，共篩選出18株雜交菌株，有性雜交成功率達到36%。根據銀耳的雙因子四極性特點，尚未配對的菌株是因為配對中缺乏完全配對的因子，導致無法萌發出雙核，鎖狀聯合的菌絲［4］。

2.3 拮抗試驗結果

18株雜交菌株與親本拮抗試驗的結果顯示，其中7株雜交菌株與2個親本存在明顯的拮抗線，11株無顯著的拮抗線。拮抗線是不親和的菌株共同培養是在交界處形成的隔離，阻礙遺傳上明顯不同的菌株融合，保持了個體遺傳上的獨立和穩定。雜交菌株與親本菌株之間形成拮抗線表明遺傳物質差異較大，則可能為篩選的新品種［7］。將有明顯拮抗線的雜交菌株依次編號GTi（i=1，2，3……），轉管備用。

2.4 雜交菌株的酶活力測定結果

將7株菌株分別與親本的香灰菌配對制備銀耳栽培種，當栽培種生長完成時，測定白毛團的纖維素酶活力和香灰菌絲的漆酶和多酚氧化酶活力，同時接種至栽培袋進行栽培對比試驗。表1顯示不同雜交菌株的酶活力，其中GT1、GT6、GT7菌株的纖維素酶活力介于親本之間，GT4比兩個親本的酶活力都低，GT2、GT3、GT5纖維素酶的活力略高于親本，由此可見，有性雜交并不是簡單的遺傳物質的組合。漆酶和多酚氧化酶的活力與對應親本的酶活力進行t檢驗分析，其值均大于0.05，無顯著差異。

2.5 栽培試驗比較結果

7株雜交菌株與2親本進行了小規模的栽培對比試驗，測定了栽培種酶活力，統計生長周期，單朵直徑，耳片情況，單朵直徑、鮮重和生物學效應等農藝性狀，表2顯示了相關數據信息。整理數據分析發現雜交菌株GT3的鮮重，耳片展片完全，彈性較好，生長周期較短，抗污染能力較好，鮮重和轉化率與親本相比略高；其余菌株有的生長周期延長，生物學效率降低，為表現出親本各自的優勢。GT3可能具備開發為優良菌株的潛力，該菌株的穩定性還需進一步的證實。

表2 雜交菌株栽培對比試驗結果

3 討論

本試驗完成了銀耳有性孢子分離，配對篩選，從50個單孢子菌落配對僅僅獲得18個菌株，在18個菌株種僅7個雜交菌株和親本菌株有明顯的拮抗現象，表明此雜交菌株與親本菌株遺傳物質具有明顯區別，有可能為選育的新品種［8］。栽培種酶活力測定結果顯示，某些菌株纖維素酶活力較親本強，多數介于二者之間，少數低于親本。從栽培試驗中發現纖維素酶活力高，生長周期相對縮短，漆酶、多酚氧化酶活性相對變化較小，但是活力高，提供營養物質可能較多，對生物學效率提供具有一定的意義［9-11］。綜合栽培時間、生物轉化率等農藝學參考因子，GT3雜交菌株具有生長周期短，生物轉化率高和抗逆性強等優良特征，該雜交菌株與兩種香灰菌株均可配對，關于該菌株的穩定性、是否能優良菌株應用于生產還需要進一步試驗［12，13］。

4 結論

本研究通過銀耳有性孢子的分離、有性孢子雜交育種、農藝性狀的評價等篩選出一株具有生長周期短，生物轉化率高，抗逆性強的雜交菌株。該菌株與親本有明顯的拮抗現象，酶活力較親本縮短。

［1］ 國家中醫藥管理局《中華本草》編委會.中華本草［M］.上海：上海科技出版社， 1998：515-519.

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［5］劉佳. 通江銀耳乘“神八”育種是否成功需要3年驗證［N］.四川日報， 2011-11-22（21302）.

［6］ 施特爾馬赫（German ）（錢嘉淵譯）. 酶的測定方法［M］.北京：中國輕工業出版社， 1992：10-280.

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［11］ 賀元川， 陳仕江， 楊勇， 等.香灰菌傳代對銀耳栽培的影響［J］.江蘇農業科學， 2014， 42（4）：201-202.

［12］ 鄧優錦， 王慶福， 劉福陽，等.不同香灰菌與銀耳的配對研究［J］.食藥用菌， 2012， 20（1）：25-27.

［13］張漢文.淺談提升銀耳菌種穩定性及其技術線路的探討［C］.國際食（藥）用菌生物科學高峰論壇暨第二屆中國（古田）食用菌節-紀念中國食用菌協會成立二十周年論文集， 137-138.

（責任編輯 李楠）

Sexual Hybridization Breeding Selection for Good Quality Strain of Tremella fuciformis

He Yuanchuan1Chen Shijiang1Yang Yong1He Zongyi1Zhang Deli1Chai Jiayan2
（1. Chongqing Academy of Chinese Material Medica，Chongqing 400065；2. Chongqing Duoduoruner Co.，Ltd，Chongqing 409000）

During the process of Tremella fuciformis cultivation， some problems， such as low yield and long cultivation time， often are followed with different strains. The aim of this study is to mix good properties of different strain together to new strains by sexual hybridization method. Based comparison of yield， fresh ear ventral color and mature culture， yinke 1#and Tr21 were selected as parents strains with good properties. 50 single spores were isolated from fresh ear and partnered each other following single hybridization principle. 17 combinations are identified with an optical microscope examination and 7 genetic characteristics of hybrid strains are different from parent strains by Antagonism experiment. The results of agronomic traits comparison showed that cultivation period， diameter and the yield of hybrid strains GT3are significantly different from the parents， and the production has exceeded the parent strains more than 3%. GT3can be used as an excellent hybrid strains reserves and has the potential to develop into a new species. Sexual hybridization breeding would be effective way to select good quality strain.

Tremella fuciformis；single spore isolation；sexual hybridization；good quality strain

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.022

2014-08-21

重慶市科技攻關項目（JA-12-21-1）

賀元川，女，碩士，助理研究員，研究方向：藥食用菌培養及活性物質；E-mail：heyuanchuan@126.com

陳仕江，男，研究員，研究方向：藥食用菌的培植；E-mail：shijiangchen@163.com