一株解磷細菌的篩選、鑒定及其溶磷培養條件的優化

黃達明 李倩 管國強 張志才 錢靜亞 宋慶春

（江蘇大學食品與生物工程學院，鎮江 212013）

一株解磷細菌的篩選、鑒定及其溶磷培養條件的優化

黃達明 李倩 管國強 張志才 錢靜亞 宋慶春

（江蘇大學食品與生物工程學院，鎮江 212013）

從土壤作物根際篩選分離出的一株解磷能力較強的溶磷菌P0417，對其進行16S rDNA基因水平上的初步鑒定，測定其溶解磷的能力，并對該菌的溶磷培養基條件進行優化。結果表明，經序列分析，確定該菌株P0417為洋蔥伯克霍爾德氏菌。且其溶磷能力與培養液pH呈顯著相關性，當培養基條件為葡萄糖10 g/L、草酸銨0.5 g/L、NaCl 1.0 g/L時，菌株P0417對Ca3（PO4）2鹽培養基具有較好的解磷能力，其解磷能力可達791.84 μg/mL。

溶磷細菌；篩選；鑒定；條件優化；解磷能力

磷（P）是植物生長必需的礦物質元素之一，在植物體內以多種方式參與植物體內的光合作用和生理生化過程，對促進植物的生長發育和新陳代謝具有重要作用［1］。在我國，有74%的耕地土壤缺磷，土壤中95%以上的磷為無效形式，植物很難直接吸收利用［2］，且施入的磷肥當季作物利用率為5%-25%，大部分磷與土壤中的Ca2+、Fe3+、Fe2+和Al3+結合，形成難溶性磷酸鹽［3］。

土壤微生物是土壤有機質轉化的執行者，又是植物營養元素的活性庫［4］。土壤中能解磷的微生物種類比較多，主要包括細菌、真菌和放線菌等［5］。目前報道的具有溶解Ca3（PO4）2的菌株主要包括芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、腸桿菌屬（Enterobacter）和伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia）等［6］。不同的微生物解磷能力有較大的差異［7］，其溶磷量可達142.1-643.2 μg/mL［3，7，9］。其作用途徑大多是依靠自身的代謝產物或與其他生物協同溶解土壤中的難溶性磷素，提高土壤中磷素的利用效率，減少化學肥料的施用量，對環境進行微生物修復，提高作物產量。微生物的解磷機制復雜多樣，因菌株的不同而有所不同［8］。解磷細菌能夠增加土壤有效磷含量，有三種觀點：第一種觀點是產酸機制，目前被人們廣泛接受；第二種觀點認為微生物的解磷作用主要是由于在其代謝過程中分泌質子的緣故，使介質的pH值降低；第三種觀點認為微生物的解磷過程是一個動態的分段過程［9］。

目前，有關溶磷微生物的分離，篩選和應用的研究大都局限于農作物，在林木根際篩選和應用溶磷微生物的報道極少。許多科學家分別從不同的方面對微生物菌肥進行研究［10，11］，如進行高效解磷能力菌株的分離、將不同種類微生物混合而研究其組合效應等，所以篩選出具有高效溶磷能力的菌株顯得尤為重要。本研究對篩選自桂樹根際土壤的溶磷菌鑒定并進行溶解磷酸鈣能力的測定，并對溶磷菌的培養條件進行優化，旨在為開發利用林木根際溶磷微生物資源及綠色無公害微生物肥料的生產提供高效穩定的菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試土壤 供試土壤為黑色土壤，于2013年9月采樣，采用五點采樣法采集桂花樹下根際粘附的土壤，充分混合后分成2份：一份4℃冷藏保存，一份土樣風干后過2 mm篩備用。

1.1.2 培養基 分離培養基（PKO培養基）：葡萄糖10 g，Ca3（PO4）210 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，（NH4）2SO40.5 g，瓊脂粉15 g，pH值7.0-7.2，水1 000 mL［Ca3（PO4）2單獨滅菌后加入］。保存培養基（LB培養基）：酵母膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 10 g，水1 000 mL，瓊脂15 g。

1.1.3 溶磷菌株的篩選分離 稱取1 g土樣溶于99 mL無菌水中，振蕩30 min后取上清液用10倍稀釋法分別配置10-3、10-4、10-5、10-6和10-7g/mL的土壤懸液，各取0.1 mL分別涂布到分離培養基上［12］，28℃培養10 d，觀察出現溶磷圈的菌落，并將出現溶磷圈的菌株利用平板劃線法分離純化后，4℃下保存于LB斜面培養基中［13］。

1.2 方法

1.2.1 溶磷菌溶磷能力的測定

1.2.1.1 定性測定 溶磷圈法。將保存于LB培養基中的菌株活化后，用無菌牙簽接種于含磷酸鈣的PKO固體培養基上，倒置于28℃培養箱中培養10 d，記錄溶磷圈直徑（D）、菌落直徑（d），并計算D/d值大小以初步確定菌株的溶磷能力。

1.2.1.2 定量測定 將菌株用LB液體培養基制成菌懸液（濃度約為109cell/mL，即波長660 nm，OD值1.0），按菌懸液與PKO液體培養基比例為 1∶100 接種，即每100 mL培養基接菌懸液1 mL，每菌株3次重復，以不接菌空白PKO液體培養基為對照。在28℃，150 r/min下搖床培養5 d后，取2 mL發酵液4 000 r/min離心10 min，采用鉬藍比色法［12］測定上清液有效磷含量，同時根據磷標準曲線［14］計算溶磷量，并測定上清液pH值。

1.2.2 菌株的鑒定

1.2.2.1 菌株菌落特征觀察及生理生化性質 將單菌株接種LB培養基中進行活化培養，革蘭氏染色觀察細菌形態，培養液經梯度稀釋后涂布平板，30℃倒置培養24 h，觀察菌落形態。采用《常用細菌系統鑒定手冊》進行初步菌株鑒定。

1.2.2.2 菌株的16S rDNA序列分析 利用菌體菌懸液直接PCR擴增16S rDNA，擴增引物采用細菌通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'），引物購買于南京金斯瑞生物科技有限公司。PCR反應體系為（25 μL）：Taq DNA聚合酶 0.25 μL，10×PCR緩沖液2.5 μL，dNTP Mixture 4 μL，菌體0.2 μL，引物各0.5 μL，去離子水17.05 μL。PCR擴增條件：95℃5 min；94℃ 1 min，50℃ 1 min，72℃ 1.5 min，共32個循環；72℃ 10 min。用瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增產物進行檢測，PCR產物送至南京金斯瑞生物科技有限公司測序后，測序結果提交GenBank中的Blast數據庫進行同源性比對，經Clustal軟件進行多重序列比較后，利用MEGA 5.0軟件進行系統發育樹的構建。

1.2.3 培養基的優化試驗

1.2.3.1 碳源和氮源的篩選 在原有的PKO液體培養基的基礎上首先對碳源（葡萄糖、乳糖、可溶性淀粉、麥芽糖）和氮源［（NH4）2SO4、草酸銨、NaNO3、牛肉浸膏］進行篩選。菌株在LB斜面上活化24 h后，按1.2.1方法制成菌懸液，按1%接種量接種于各碳、氮源培養基，每組3次重復，于28℃、150 r/min搖床培養5 d，以原PKO培養基不接菌為對照測溶磷量。

1.2.3.2 培養基組成的優化 確定最好的碳氮源后，設計了葡萄糖（5、10和15 g/L），草酸銨（0.1、0.5和1 g/L），NaCl（0.1、0.5和1 g/L）的3因素3水平的正交試驗對培養基進行優化。選用L9（33）正交組合進行試驗，其因素水平見表5。測定方法同1.2.3.1。

2 結果

2.1 菌株的篩選

在無機磷固體培養基平板上涂板，結果（圖1）顯示，平板上長滿各種單菌落，且有的菌落產生了溶磷圈，產生溶磷圈的大小大致可說明此溶磷菌分解無機磷能力的強弱，從而可初步判斷溶磷菌溶磷能力［15］。經篩選，得到一株具有明顯溶磷圈（D/d≥2.0）的溶磷菌，標記為P0417。

2.2 溶磷菌溶磷能力的測定

2.2.1 定性測定 經溶磷圈法測定D/d值，在以磷酸鈣為磷源的培養基上出現了明顯且較大的透明圈，在培養第10 天，菌落直徑d為7.0 mm，透明圈直徑D為14.3 mm，D/d值為2.04，具有較強溶解難溶性磷酸鈣的能力。菌株特征見表1。

表1 菌株P0417在LB培養基上的菌落特征

2.2.2 溶磷菌溶磷能力的定量測定 供試菌株P0417在接種24 h后開始測定菌液中可溶性磷含量及pH值，然后每隔24 h測一次。結果（圖2）顯示，隨著接種時間的延長，pH值逐漸降低，可能發酵過程中分泌了有機酸，溶磷量隨之逐漸升高，且在120 h時溶磷量達到503.53 μg/mL，說明該菌在培養120 h時的溶磷效果最佳。隨后，pH值具有升高的趨勢，溶磷量也隨之降低。通過Spss16.0對數據進行統計學分析發現，溶磷菌P0417的溶磷量與pH之間存在顯著的負相關關系（r=-0.940，P＜0.05），當培養液酸度降到pH5.58時，才有大量磷釋放出來。

圖2 溶磷菌培養液中溶磷量與pH的關系

2.3 菌株的鑒定

2.3.1 菌株P0417的形態特征 菌株P0417在LB平板上30℃培養24 h，菌落呈黃色、圓形、光滑、不透明，革蘭氏染色呈陰性，菌體為短桿狀（圖3）。菌株淀粉水解試驗、甲基紅試驗、V-P試驗、硝酸鹽還原試驗及氧化酶試驗呈陰性；吲哚試驗和硫化氫試驗呈陽性；能利用乳糖、葡萄糖和麥芽糖；石蕊牛奶試驗產酸、胨化（表2）。

圖3 P0417菌平板形態（A）及菌株革蘭氏染色（400×）（B）

2.3.2 菌株的16S rDNA序列分析 菌株P0417經16S rDNA擴增，其PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得了約1 500 bp大小的片段。將PCR產物寄往南京金斯瑞生物科技有限公司測序，測序結果顯示，所得基因片段為1 377 bp，經Blast比對（表3），并構建系統發育樹（圖4）可知，該菌株為洋蔥伯克霍爾德氏菌（Burkholderia cepacia），將該序列提交到GenBank，登錄號為KJ020934。

表2 菌株P0417的生理生化特征

表3 溶磷菌P0417 的16S rDNA及ITS基因的鑒定結果

圖4 P0417的系統進化樹

2.4 溶磷菌的優化培養

分別選用10 g/L的葡萄糖、乳糖、可溶性淀粉和麥芽糖作為碳源，以不接菌原PKO培養基為空白對照，培養120 h后計算得出溶磷菌發酵液溶磷量，結果（表4）表明，葡萄糖是溶磷菌生長最適合的碳源。以0.5 g/L的（NH4）2SO4、草酸銨、NaNO3和牛肉浸膏作為氮源供溶磷菌發酵培養，表5可知草酸銨能使溶磷菌達到較好的溶磷效果。

表4 不同碳源對溶磷菌P0417溶磷量的影響

表5 不同氮源對溶磷菌P0417溶磷量的影響

綜合正交試驗（表6）結果（表7）的K值和極差R大小與方差分析（表8）可知，影響供試菌P0417溶磷量的主次順序為B＞C＞A，即氮源＞NaCl＞碳源，其中草酸銨含量為影響溶磷菌溶磷量的主要因素，其次是NaCl含量，最后是葡萄糖含量。故本試驗對供試菌株的理論最優培養基配方為A2B2C3，即葡萄糖10 g/L、草酸銨0.5 g/L、NaCl 1.0 g/L。針對該條件進行了補充試驗，對優化培養配方接種活化第2代供試菌株P0417，同條件下培養，溶磷量為765.74 μg/mL，比原優化前培養液溶磷效果高。證明通過培養基優化及正交試驗，調整后的培養配方更有利于該菌的溶磷效果。

表6 正交試驗因素水平

3 討論

本試驗從桂花樹根際粘附土壤中分離篩選出一株高效溶磷菌株P0417，經16S rDNA序列分析，結合生理特征，初步鑒定為洋蔥伯克霍爾德氏菌（Burkholderia cepacia），屬于伯克霍爾德氏菌（Burkholderia）類。該菌群是一種廣泛存在于水、土壤、植物和人體中的革蘭氏陰性桿菌，因其可以產生硝吡咯菌素、吩嗪、苯基吡咯等多種次生代謝產物而被廣泛應用于生物防治、促進植物生長、生物修復等農業領域［16］，展現了其在農業生產上良好的應用前景。與此同時該菌又有一些種是人類的條件致病菌［17］，在醫院常污染自來水、體溫表、醫療器械等，造成醫院內傳播，導致各種疾病傳染［18］。故區分環境菌和人體致病菌以及該菌是否具有致病性，這對應用于農業上的伯克霍爾德氏菌株進行風險評估無疑是必要的。但目前為止還沒有可行的方法區分，借助細胞培養模型和動物模型的突變體分析將是今后可行方法之一［19］。

表7 L9（33）正交試驗結果

表8 正交結果方差分析

關于伯克霍爾德氏菌的溶磷效果的研究少有報道，李紀順等［20］發現伯克霍爾德氏菌B418同時可以刺激植物生長，固定大氣中的氮，釋放土壤中被固定的磷等重要元素，證明其綜合效果非常明顯。趙珂［21］分離出一株洋蔥伯克霍爾德氏菌YM3-2S，在磷礦粉為唯一磷源時速效磷含量最高達40.96 μg/mL。黃靜［22］分離出一株植物內生洋蔥伯克霍爾德氏菌M2S2，在磷酸鈣磷源條件下顯著增加了玉米地上部、根部及總生物量。本試驗在以Ca3（PO4）2作為唯一的磷源且培養基條件優化后該菌P0417溶磷量最大為791.84 μg/mL。

溶磷菌種類繁多，溶磷機制復雜［23］，但大多數研究者認為，微生物的解磷作用主要取決于其分泌有機酸量和種類，如檸檬酸、草酸、蘋果酸、琥珀酸和乳酸等［24］。如彭帥［25］分離出一株解磷熒光假單胞菌能夠產生葡萄糖酸，解磷量達24.5 μg/mL。本試驗菌株P0417在接種24 h后開始測定菌液中可溶性磷含量及pH發現，隨著接種時間的延長，pH值逐漸降低，溶磷量隨之逐漸升高，說明發酵過程中可能分泌了有機酸，菌株分泌有機酸的種類測定是后續研究的主要內容之一。

4 結論

菌株P0417在以Ca3（PO4）2作為唯一的磷源時溶磷量為503.53 μg/mL，在培養基條件優化后溶磷量最大為791.84 μg/mL，是原有PKO培養基溶磷量的1.57倍，推測溶磷機制可能是分泌了有機酸，初步鑒定為洋蔥伯克霍爾德氏菌（Burkholderia cepacia），可能是一株優良的非致病性溶磷菌株。

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（責任編輯 馬鑫）

Selection，Identification and Medium Optimization of a Phosphatesolubilizing Bacterium

Huang Daming Li Qian Guan Guoqiang Zhang Zhicai Qian Jingya Song Qingchun
（College of Food and Biology Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013）

A phosphorus-dissolving bacterial strain P0417 was isolated from crop rhizosphere soil and identified by the genetic identification of 16S rDNA， measuring capability of phosphate-solubilization and optimization of medium components here. The result demonstrated that the bacterium was identified as Burkholderia cepacia. And the capacity of dissolving the phosphate was closely correlated with the pH of its culture medium， the strain showed high phosphate-dissolving ability of 791.84 μg/mL in Ca3（PO4）2culture medium at glucose， 10 g/L；Ammonium oxalate， 0.5 g/L；NaCl， 1.0 g/L.

phosphorus-dissolving bacterial strains；selection；identification；medium optimization；phosphate-dissolving ability

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.026

2014-06-10

黃達明，男，教授，研究方向：農產品生物轉化及綜合利用；E-mail：damingh@163.com