一株Bacillus sublitis JH-1發酵產木聚糖酶培養基的響應面優化

王春明鐘超王鳳學黃凡賈紅華韋萍趙印

（1.南京工業大學生物與制藥工程學院，南京 211816；2.河南天冠企業集團有限公司車用生物燃料技術國家重點實驗室，南陽 473000）

一株Bacillus sublitis JH-1發酵產木聚糖酶培養基的響應面優化

王春明1鐘超1王鳳學1黃凡1賈紅華1韋萍1趙印2

（1.南京工業大學生物與制藥工程學院，南京 211816；2.河南天冠企業集團有限公司車用生物燃料技術國家重點實驗室，南陽 473000）

利用剛果紅透明圈法從秸稈堆肥中篩選出一株產木聚糖酶菌株Bacillus sublitis JH-1，以單因素試驗為基礎，采用響應面試驗設計對Bacillus sublitis JH-1液態發酵產木聚糖酶的培養基進行了優化，得到產木聚糖酶發酵最適條件為：培養溫度33℃，pH值6.0，麥芽糖濃度為2.6%，酵母粉濃度為1.2%，KH2PO4濃度為1.2%，發酵產酶量比優化前提高了1.8 倍。

Bacillus sublitis JH-1；木聚糖酶；響應面法

木聚糖酶（1，4-β-D-xylanase）是一種糖基水解酶，以內切方式作用于木聚糖主鏈內部的β-1，4-木糖苷鍵，其主要水解產物為低聚木糖和少量木糖。木聚糖酶主要存在于海洋陸地動物、植物和微生物之中，但其主要來源出自微生物。產木聚糖酶的微生物種類很多［1］，近年來報道的有曲霉［2］、木霉［3］、青霉［4］、鏈霉菌、酵母菌［5］等真菌屬和芽孢桿菌［6］等細菌屬［7］。

目前，木聚糖酶已被廣泛應用于人們的生產生活中［8-11］。木聚糖酶可以輔助漂白，改善造紙傳統工藝中劇毒致癌的含氯漂白劑［12］。木聚糖還可用于飼料、釀酒、面粉、果汁澄清等行業。國外早在20世紀中葉就開始對木聚糖酶進行研究，我國到20世紀80年代才開始涉足該領域［13］，最初僅應用于工業化飼料生產中，但隨著科學技術的發展，在紡織、造紙、廢紙脫墨等行業中都有廣泛的應用，工業化生產木聚糖酶的報道也越來越多［14］。近些年，因木聚糖酶可將廢棄的生物質材料轉化為乙醇、燃料等能源，由于其巨大的潛力和經濟價值，使得越來越多的學者投入到對它的研究中［16］。

由于木聚糖酶廣泛的應用領域及巨大經濟潛力，篩選優化木聚糖酶高產菌株具有重要的研究意義和應用價值。自然界中很多微生物都能產生木聚糖酶，針對廢棄農作物中半纖維素組分的高效利用，本研究前期以此篩選到了一株產木聚糖酶的菌株，通過PCR提取16S rDNA進行測序分析，測序結果通過GenBank Blast分析，認定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），命名為B. sublitis JH-1。因其產生芽孢能耐受高溫高壓，與真菌、放線菌和霉菌的傳統固態培養相比，液態培養具有生產效率高、容易自動化控制、可對過程進行多種手段精確調控的優勢，且具有較好的穩定性和生物活性，并容易分離。

本研究應用的菌株屬于嗜酸性微生物，因此可以考慮將其應用于飼料加工方面。向家畜養殖的飼料中添加木聚糖酶，能有效提高動物消化中的酶活性，促進營養物質有效的消化吸收。此外，被降解后的木聚糖，轉化為低聚木糖能使雙歧桿菌增殖，有效地調節動物腸胃中的微生態環境，達到提高動物的抗病及生產性能的效果。王修啟等［15］驗證了在家畜飼料中添加木聚糖酶，可有效提高家畜的生產性能。

由于B. sublitis JH-1具有良好的發展前景，但微生物生長受培養條件和培養基成分影響很大，為了優化其生長環境，本研究在對該菌株木聚糖酶發酵條件進行單因素優化的基礎上，通過Plackett-Burman（PB）試驗設計、最陡爬坡試驗設計和Box-Behnken試驗設計3個過程，得出影響顯著的因子和水平，通過建立回歸擬合方程得出理論最高值，對培養基組分進行進一步優化，旨在更好地提高該菌株的產酶量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 木聚糖酶高產菌株篩選樣品來源于南京工業大學沼氣站秸稈堆肥區。

1.1.2 培養基 發酵培養基（%）：蛋白胨1.0，酵母粉0.5，NaCl 1.0，121℃高壓滅菌20 min。

1 mg/mL剛果紅溶液：稱取1 g剛果紅溶于1 000 mL去離子水中，121℃高壓滅菌20 min。

1%木糖標準溶液：準確稱取1 g木聚糖溶解后定容至 100 mL，貯存4℃備用。

3，5-二硝基水楊酸顯色液：準確稱取 6.3 g 3，5-二硝基水楊酸置于262 mL 2 mol/L 氫氧化鈉溶液中，然后加酒石酸鉀鈉的熱溶液 500 mL（182.0 g酒石酸鉀鈉溶于500 mL蒸餾水中），再加 5.0 g重蒸酚和5.0 g亞硫酸鈉，攪拌至溶解，冷卻后定容至1 000 mL，貯于棕色瓶中置冰箱一周后使用，用前過濾。

1.2 方法

1.2.1 酶活力測定方法 采用DNS法［17］測定酶反應體系中產生的還原糖，以木糖作標準曲線測定木聚糖酶的活性。

酶活力單位的定義：以木聚糖作為底物，每毫升稀釋酶液每分鐘釋放1 μg還原糖所需的酶量為一個酶活單位。

1.2.2 單因素試驗

1.2.2.1 溫度對產木聚糖酶的影響 將B. sublitis JH-1接入液態發酵培養基中，置于31℃-39℃ 180 r/min搖床培養箱中培養3 d后，測定酶活，并根據酶活力的大小，確定最佳的培養溫度。

1.2.2.2 初始pH對產木聚糖酶的影響 分別配制0.2 mol/L的pH4.0和pH5.0的醋酸緩沖液、pH6.0-9.0磷酸鹽緩沖液、pH9.0 Tris鹽酸緩沖液，分別添加液態發酵培養基中。將B. sublitis JH-1接入液態發酵培養基中，置于180 r/min搖床培養箱中33℃培養3 d后，測定酶活，并根據酶活力的大小，確定最佳的初始pH。

1.2.2.3 碳源對產木聚糖酶的影響 在液態發酵培養基中，分別添加濃度為1%（m /w）的木糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、木聚糖、玉米芯，可溶性淀粉，將B. sublitis JH-1接入pH6的液態發酵培養基中，置于180 r/min搖床培養箱中33℃培養3 d后，測定酶活，并根據酶活力的大小，確定最佳的碳源種類。

根據碳源的篩選結果，選擇酶活力最高的作為最適碳源，在pH6.0的液態發酵培養基中，分別添加0.5%-4%的麥芽糖，置于180 r/min搖床培養箱中33℃培養3 d后，測定酶活，并根據酶活力的大小，確定最佳碳源添加量。

1.2.2.4 氮源對產酶的影響 在已優化的pH、碳源的液態發酵培養基中，分別添加濃度為0.4%（m/w）的無機氮源NaNO3、KNO3、NH4Cl、（NH4）2SO4，有機氮源尿素、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉作為單一氮源，將B. sublitis JH-1接入，置于180 r/min搖床培養箱中33℃培養3 d后，測定酶活，并根據酶活力的大小，確定最佳的氮源種類。

根據氮源的篩選結果，選擇酶活力最高的作為最適碳源，分別添加0.5%-4%的酵母粉，置于180 r/min搖床培養箱中33℃培養3 d后，測定酶活，并根據酶活力的大小，確定最佳氮源添加量。

1.2.3 響應面優化設計

1.2.3.1 PB試驗-顯著影響因素的篩選 在單因素搖瓶發酵試驗的基礎上，以下試驗都采用100 mL搖瓶，10%的接種量，90 r/min轉速33℃搖床培養2 d的方式（試驗得出的結論，篇幅有限，未在文中列出），將篩選出的影響B. sublitis JH-1產木聚糖酶發酵培養基的9種成分，乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉、酵母粉、蛋白胨、氯化鈉、硫酸鎂、硫酸銨和磷酸二氫鉀分別作為PB試驗的考察對象，利用Minitab 16軟件，選用N=12的 Plackett-Burman設計，并余2個空項作為誤差分析。

表1 Plackett-Burman試驗因素水平及編碼

1.2.3.2 最陡爬坡試驗 根據PB試驗結果，確定影響B. sublitis JH-1木聚糖酶的3個主要因素，根據PB試驗得到的一次擬合方程系數的正負決定該因素的爬坡方向和步長的遞增和遞減。

1.2.3.3 中心組合試驗及響應面分析 根據最陡爬坡試驗的結果，選用麥芽糖、酵母粉、磷酸二氫鉀為考察因素，采用Box-Behnken中心組合試驗設計，設計3因素3水平的響應面分析（RSA）試驗，試驗因子和編碼水平，見表2。

表2 試驗因素水平及編碼水平

2 結果

2.1 培養溫度、初始pH對產木聚糖酶的影響

如圖1所示，隨著溫度的上升產酶量增加，但當溫度高于33℃時，產酶量明顯下降。結果顯示，在33℃下，B. sublitis JH-1產木聚糖酶量最大。

圖1 溫度對產木聚糖酶的影響

如圖2所示，pH＞7時，B. sublitis JH-1產酶活性較低，說明枯B. sublitis JH-1適合偏酸性環境，中性或者偏堿都不適合B. sublitis JH-1的生長和代謝，pH值為6時，B. sublitis JH-1產酶活性最強。

2.2 碳源對產木聚糖酶的影響

如圖3所示，以麥芽糖作為碳源，對B. sublitis JH-1產酶更有利。

通過研究不同麥芽糖添加量對B. sublitis JH-1產木聚糖酶的影響，結果（圖4）顯示，其產酶效果依次為1.5%＞2%＞2.5%＞1%，可見添加1%-2.5%的麥芽糖作為碳源，產酶效果較好，最佳添加量為1.5%。

圖2 pH對產木聚糖酶的影響

圖3 碳源對產木聚糖酶的影響

圖4 麥芽糖濃度對產木聚糖酶的影響

2.3 氮源對產木聚糖酶的影響

如圖5所示，分別添加濃度為0.4%的不同氮源，考察他們對B. sublitis JH-1產木聚糖酶的影響，結果發現以酵母粉為氮源，優于其他無機氮源和有機氮源。分別添加0.5%-4%酵母粉考察不同濃度酵母粉對B. sublitis JH-1酶活的影響。如圖6所示，1%-2%的酵母粉作為氮源產酶效果較好，最佳含量為1.5%。

圖5 氮源對產木聚糖酶的影響

圖6 酵母粉濃度對產木聚糖酶的影響

2.4 Plackett-Burman設計篩選及影響產木聚糖酶的重要因素

PB試驗設計及結果見表3，由表4 的結果得到圖 7的效應 Pareto 圖。結果顯示，只有麥芽糖、酵母粉和磷酸二氫鉀超過了誤差邊界。因此，麥芽糖、酵母粉和磷酸二氫鉀是影響B. sublitis JH-1影響木聚糖酶的培養基重要因素。同時由表4結果發現，麥芽糖、酵母粉和磷酸二氫鉀的效應分別為（+）148.41、（-）106.13和（+）74.83。

表3 Plackett-Burman試驗設計及結果

表4 PB設計結果的各因素效應及評價

圖7 影響木聚糖酶發酵的 9 成分的 Pareto 圖

2.5 最陡爬坡試驗

最陡爬坡試驗的設計及結果（表5）顯示，實驗 5對應的木聚糖酶酶活為2 821.19 U/mL，隨后木聚糖酶開始降低，因此選取實驗5 的麥芽糖（2.4%）、酵母粉（1.2%）和磷酸二氫鉀（1.2%）做優化試驗的中心點。

表5 最陡爬坡試驗設計及其結果

2.6 中心組合試驗及響應面分析

利用統計軟件Design-Expert7.1.1 對試驗進行設計和數據分析，根據表6的試驗結果，對表中數據進行多元回歸擬合，所得到的木聚糖酶酶活（Y）對麥芽糖（X1）、酵母粉（X2）和KH2PO4（X3）通過擬合可得到的二次多項式方程為：Y=3670.84+92.63X1-10.31X2+44.52X3-6.01X1X2-4.01X1X3-76.45X2X3-104.28X1X1-133.20 X2X2-106.57 X3X3，由此方程可進行方差分析，結果見表7。

表7顯示，建立的回歸模型顯著（P＜0.05），說明方程擬合度較好；Pr失擬項= 0.，1126＞0.05，說明失擬項并不顯著，殘差由于隨機誤差而引起，模型選擇正確；復相關系數R2=0.976 7，表明預測值與實測值之間具有比較高的相關性；調整性決定系數表明方程模型可信度比較高，能夠較好地描述本次試驗的結果。

表6 中心組合試驗設計及結果

圖8 麥芽糖和酵母粉對木聚糖酶酶活影響的響應面立體分析圖

圖9 麥芽糖和磷酸二氫鉀對木聚糖酶酶活影響的響應面立體分析圖

圖10 酵母粉和磷酸二氫鉀對木聚糖酶酶活影響的響應面立體分析圖

由回歸方程所作出的響應面立體分析圖（圖8-圖10）顯示，它們分別反映了麥芽糖（X1）、酵母粉（X2）和KH2PO4（X3）這3個因素之間兩兩交互作用對響應值的影響。麥芽糖和酵母粉對木聚糖酶的影響如圖8所示，X1因素（麥芽糖）與X2因素（酵母粉）交互作用顯著，X1因素（麥芽糖）對木聚糖酶酶活的影響較大，為主效應因子。如圖9所示，X1因素（麥芽糖）與X3因素（KH2PO4），當KH2PO4的濃度一定時，木聚糖酶的酶活隨著麥芽糖添加濃度的增加而增大，但當麥芽糖的添加濃度大于2.577%時，木聚糖酶酶活逐漸呈下降趨勢；當麥芽糖的添加濃度一定時，隨KH2PO4添加濃度的增加，木聚糖酶的酶活先增加后降低。如圖10所示，酵母粉和KH2PO4的濃度一定時，另一因素的濃度增加到達最適濃度時，木聚糖酶酶活隨之增大，濃度超過最適濃度后繼續增加，木聚糖酶酶活隨之降低。

從響應面圖可分析得出，對于各因素之間的交互影響中，3個因素中麥芽糖對木聚糖酶酶活影響最大，KH2PO4次之，酵母粉最弱。通過Design-Expert軟件分析，可得到B. sublitis JH-1液態發酵產木聚糖酶，最佳培養基配方為：麥芽糖添加濃度為2.577%，酵母粉添加濃度為1.176%，KH2PO4添加濃度為1.248%，在此條件下木聚糖酶酶活預測值可達3 697.37 U/mL。結合實際試驗操作的方便性和方差分析的結果，將最終確定培養基配方為：麥芽糖添加濃度為2.6%，酵母粉添加濃度為1.2%，KH2PO4添加濃度為1.2%。為了驗證B. sublitis JH-1液態發酵產木聚糖酶響應面模型的精確性，對該模型進行試驗驗證，按照最終確定的培養基參數進行3次重復試驗驗證，可得木聚糖酶酶活平均值為3 693.91 U/mL，表明此模型實際值與預測值有較好的擬合性，是可行有效的，具有較高的實踐參考價值。

3 討論

本研究中，培養條件對微生物生長影響很大，溫度越高，微生物生長代謝越快，次級代謝產物的合成速度也加快。但由于有些中間代謝酶類對溫度變化比較敏感，過高的溫度反而會降低其活性，從而影響相關代謝產物的積累。初始pH的變化會直接影響微生物細胞膜的電荷狀態，從而影響微生物的生理代謝功能。

培養基成分是影響微生物生理代謝的最重要因素，直接關系到酶等次級代謝產物的產生和積累，對碳源、氮源等培養基成分進行優化，不僅可以降低成本，更充分發揮菌株產酶潛能，提高產酶率。推測菌體不僅可利用麥芽糖作為生長代謝的來源，乳糖也可能是木聚糖酶合成的較強的誘導物，麥芽糖含量過低不能達到好的誘導效果，過量則可能反過來抑制B. sublitis JH-1的生長及產酶。陳熊等［18］報道通過添加不同的碳源，特別是麥芽糖，可顯著提高微生物木聚糖酶產量，張云雁等［19］也報道麥芽糖對木聚糖酶表達具有誘導作用，與本研究結果一致。氮是微生物生長代謝的關鍵元素，也是各種生物活性物質的重要組成部分。其原因可能是酵母粉不僅為B. sublitis JH-1生長提供了氮源，滿足生長代謝的需求，還能提供輔助的生長因子及豐富的氨基酸促進其代謝產物的合成。江國忠等［20］也報道添加酵母粉為氮源培養B. sublitis JH-1，酶活力顯著高于其他氮源。

本研究篩選的B. sublitis JH-1還可通過離子束誘變育種技術、蛋白質工程、基因工程，固定化細胞技術［21］等技術手段，進一步提高B. sublitis JH-1的木聚糖酶產量，研究其酶學性質，充分挖掘其應用潛力。

4 結論

對B. sublitis JH-1木聚糖酶產量有顯著影響的3個因素為麥芽糖、酵母粉和KH2PO4；在此最優培養基條件下，該菌株木聚糖酶產量可達到3 693.91 U/mL，發酵產酶量比優化前提高了1.8倍。用響應面法優化B. sublitis JH-1產木聚糖酶的發酵培養基是有效可行的。

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（責任編輯 馬鑫）

Optimization of Bacillus sublitis JH-1 for Xylanase Production by Response Surface Analysis

Wang Chunming1Zhong Chao1Wang Fengxue1Huang Fan1Jia Honghua1Wei Ping1Zhao Yin2
（1. Colloge of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing Tech University，Nanjing 211816；2. State Key Laboratory of Motor Vehicle Biofuel Biotechnology，Henan Tianguan Group Co. Ltd.，Nanyang 473000）

Xylanase producing strain Bacillus sublitis JH-1 was screened from straw compost by Congo red transparent circle method. According to the single-factor experiments， response surface methodology was applied to optimize the liquid state fermentation conditions of Bacillus sublitis JH-1 for xylanase production， with the optimal conditions being listed as follows：temperature as 33℃， pH value as 6.0， maltose as 2.6%（m/V）， YE as 1.2%（m/V）， KH2PO4as 1.2%（m/V）. Increased 1.8 times in average as compared with preliminary culture and consistent with the maxmum predicted value.

Bacillus sublitis JH-1；xylanase；Response Surface Methodology

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.027

2014-07-01

國家“863”計劃（2012AA021405），車用生物燃料技術國家重點實驗室開放課題（2013024），廣西科學研究與技術開發計劃（桂科重1348004-4）

王春明，女，碩士研究生，研究方向：生物能源；E-mail：aishuiyuasy@sina.com

賈紅華，男，副研究員，研究方向：生物能源；E-mail：hhjia@njtech.edu.cn