紅曲霉液態發酵生產紅曲色素的工藝優化

張銳

（包頭輕工職業技術學院，包頭 014035）

紅曲霉液態發酵生產紅曲色素的工藝優化

張銳

（包頭輕工職業技術學院，包頭 014035）

為提高紅曲色素的液態發酵水平，降低生產成本，采用Plackett-Burman試驗與Box- Benhnken試驗對紅曲霉MY-03液態發酵生產紅曲色素的工藝條件進行了優化，獲得了最佳工藝條件：葡萄糖50 g/L、蛋白胨58.07 g/L、MgSO42 g/L、NaNO32 g/L、MnSO40.3 g/L、ZnSO40.1 g/L、裝瓶量50.8 mL、接種量10.0%（V/V），于150 r/min、30℃恒溫培養7 d，紅曲色素色價可達342.24±2.88 U/mL，比基礎培養基提高了86.9%。

紅曲霉；液態發酵；紅曲色素；響應面法

紅曲色素是紅曲霉生長過程中產生的次級代謝產物，主要有3類6種，即：紅色素Monascorubramine與Rubropunctamine、橙色素Monascorubin與Rubropunctatin、黃色素Ankaflavin與Monascin［1］。紅曲色素具有較強的耐光性與耐熱性，對酸、堿、氧化劑與還原劑均較穩定，有著色、防腐、保健和藥用等價值，是安全性最高的食用色素之一，廣泛地應用于食品、飼料和醫藥等領域［2-4］。此外，紅曲霉在產生色素的同時，還能產生莫納可林K與γ-氨基丁酸等具有降血壓、降膽固醇和降血脂作用的多種次級代謝產物［5，6］，紅曲色素類產品也因含有這些功能性成分而具有一定的保健價值，深受消費者歡迎，市場需求日益增加，應用領域不斷擴展。

紅曲色素的生產方式主要有固態發酵和液態發酵兩種。固態發酵是傳統生產方式，也是目前最主要的生產方式，但生產效率低、發酵條件不容易控制、易污染，不適合大規模的工業化生產［7-10］。相比較而言，液態發酵不易污染、培養條件易控制、生產效率高，更適合大規模工業化生產，但紅曲霉在液態發酵時產紅曲色素的能力較低，僅僅為固態發酵時的10%-20%，這嚴重制約著液態發酵的推廣與應用［4，11-13］。因此，選育適于液態發酵產紅曲色素的高產菌株、優化液態發酵工藝、提高發酵水平，已成為國內外研究的熱點［14，15］。

響應面方法（Response surface methodology，RSM）是一系列統計技術的合稱，包括試驗設計、建模、因子效應評估以及尋求因子最佳操作條件，已成功地應用于多種產品的發酵工藝優化，其中包括紅曲色素的固態發酵工藝［4］，但用于紅曲色素液態發酵工藝優化的報道較少［16］。本研究采用響應面法對實驗室選育的紅曲色素高產菌株紫色紅曲霉MY-03的液態發酵工藝進行優化，研究影響液態發酵時紅曲色素產量的主要因素并確定其最佳水平，旨在提高紅曲色素產量，為工業化生產做好技術儲備。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 紫色紅曲霉MY-03（Monascus purpureus MY-03），由包頭輕工職業技術學院生物工程與技術實驗中心選育保存。

1.1.2 培養基 菌種保藏培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）；種子培養基（g/L）：葡萄糖30、蛋白胨20、KH2PO41、MgSO41、pH值自然；基礎發酵培養基：葡萄糖60、蛋白胨20、MgSO41、NaNO32、MnSO40.1、ZnSO40.1、pH自然。

1.1.3 主要儀器和試劑 752型紫外分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；臺式低速離心機：上海安亭科學儀器廠；HH-4型數顯恒溫水浴鍋：龍口市先科儀器公司；DHZ-D大容量全溫振蕩器：太倉市實驗設備廠；HJ-CF-2D型雙人凈化工作臺：上海蘇凈實業有限公司；葡萄糖，麥芽糖，甘油，蔗糖，蛋白胨，無水乙醇，無機鹽等試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 培養方法 試管菌種培養：挑取1環紫色紅曲霉MY-03菌種接種于PDA斜面培養基中，于30℃恒溫培養7 d，置于4℃冰箱中保存備用。三角瓶種子培養：向已培養好的試管斜面菌種中注入5 mL無菌水，刮取孢子，制成孢子懸液，吸取1 mL接種于裝有100 mL種子培養基的250 mL三角瓶中，于150 r/min、30℃恒溫培養48 h。液態發酵：將種子液按照一定的接種量接入裝有100 mL發酵培養基的250 mL三角瓶中，于150 r/min、30℃恒溫培養7 d。

1.2.2 紅曲色素的提取與色價測定 取10 mL發酵液，于4 000 r/min離心15 min，取上清液1 mL，加入70%的乙醇9 mL，于60℃保溫1 h，用70%的乙醇進行適當稀釋后按照GB4926-2008《中華人民共和國國家標準—食品添加劑 紅曲米（粉）》規定的方法測定色價［17，18］。

1.2.3 紅曲霉液態發酵產紅曲色素的工藝優化單因素試驗設計 以1.2.1中的液態基礎發酵培養基為基礎，考察不同碳源、氮源、無機鹽、微量元素、裝瓶量、接種量等因素對發酵產紅曲色素的影響。

1.2.4 Plackett-Burman試驗 在單因素試驗的基礎上，采用8因素的Plackett-Burman試驗設計考察碳源、氮源、無機鹽、裝瓶量和接種量等因素對紅曲色素產量的影響，以評價各因素的影響顯著性程度。各因素及其水平見表1，試驗設計與數據分析均采用 Design Expert 7.1（Stat-Ease Corp.，Minneapolis，MN，USA）。

表1 Plackett-Burman試驗設計的因素和水平

1.2.5 Box-Behnken試驗設計 對Plackett-Burman試驗中影響顯著的3個因素（蛋白胨、裝瓶量與接種量）設計Box-Behnken中心組合試驗，其因素與水平見表2。為使擬合方程具有旋轉型和通用性，中心點重復5次。試驗數據采用Design Expert 7.1（Stat-Ease Corp.，Minneapolis，MN，USA）進行多元回歸分析并構建二次多項式數學模型：

式中，Y為紅曲色素色價（U/mL），xi、xj為自變量編碼值，βo為常系數，βi為線性系數，βii為二次項系數，βij為交互項系數。

表2 Box-Behnken中心組合試驗的因素和水平

2 結果

2.1 碳源種類及其添加量對紅曲色素產量的影響

碳源是微生物生長代謝最重要的營養物質之一。碳源物質用來供給菌體生命活動所必需的能量和構成菌體細胞及各種代謝產物。常用的碳源包括各種能迅速利用的單糖（如葡萄糖、果糖等）、雙糖（如蔗糖、麥芽糖等）和緩慢利用的淀粉等多糖。

分別以60 g/L的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘油、可溶性淀粉、大米粉、玉米粉為碳源，其它成分同液態基礎發酵培養基（1.2.1）。進行液態發酵后，根據發酵液的色價確定最適碳源。試驗結果見表3和圖1。

表3 不同碳源發酵液的形態和菌絲體干重量

圖1 碳源對紅曲色素產量的影響

根據上述試驗確立的最適碳源基礎上進行碳源含量優化試驗。分別取碳源含量20、40、60、80、100和120 g/L 6個水平。進行液態發酵后，根據發酵液的色價確定最佳碳源的含量。試驗結果見圖1。

不同碳源對紅曲色素產量的影響（圖2）顯示，葡萄糖作為碳源時，紅曲色素的產量最高，與淀粉、甘油、大米粉、蔗糖、麥芽糖等其它原料作碳源時的發酵水平有極顯著差異（P＜0.01）。因此，葡萄糖是紫色紅曲霉MY-03液態發酵生產紅曲色素的最適碳源。

圖2 葡萄糖含量對紅曲色素產量的影響

由圖2所示，葡萄糖含量過高或過低都不利于代謝產物紅曲色素的產生，葡萄糖過少，不能給菌株提供充足的能源，不利于產生更多的紅曲色素；葡萄糖過多，使菌種一直處于優越的環境，菌絲體繁殖旺盛，但不利于紅曲色素的產生。當葡萄糖含量為60 g/L時，紅曲色素的產量最高，為200.56 U/mL。

2.2 氮源種類及其添加量對紅曲色素產量的影響

氮是構成微生物細胞蛋白質和核酸的主要元素，因此是菌體生長以及代謝產物形成所必需的。為探索出紫色紅曲霉液態發酵產紅曲色素的最佳氮源，本試驗在加有最適含量碳源的基礎培養基中分別加入25 g/L的蛋白胨、酵母浸膏、豆粕、尿素、硝酸銨、硫酸銨、氯化銨，其它成分同基礎發酵培養基（加有60 g/L的葡萄糖）。進行液態發酵后，根據發酵液的色價確定最適氮源。試驗結果見表4和圖3。

表4 不同氮源發酵液的形態和菌絲體干重量

根據上述試驗確立的最適氮源基礎上進行碳源含量優化試驗。分別取氮源含量10、15、20、25、30、40、45和50 g/L 8個水平。進行液態發酵后，根據發酵液的色價確定最佳氮源的含量。試驗結果（圖4）顯示，不同的氮源對其紅曲色素的影響很大，尤其是對其色調的影響。通過試驗發現硝酸銨、氯化銨為氮源時，發酵液為橘黃色，其原因可能是二者中的NH4+能抑制紅曲紅色素的合成與分泌，從而使其黃色素占有較大比重。不同氮源對紅曲色素產量的影響（圖3）顯示，蛋白胨作為氮源時，紅曲色素的產量遠高于酵母膏、豆粕、尿素和無機氮等作為氮源的產量，達到了極顯著水平（P＜0.01）。因此，在所考察的這6種氮源中，宜選擇蛋白胨為紫色紅曲霉MY-03液態發酵產紅曲色素的最適氮源。

圖3 氮源對紅曲色素產量的影響

由圖4所示，蛋白胨含量過多或過少都不利于代謝產物紅曲色素的產生，蛋白胨過少，不能給菌株供充足的氮源，C/N比過高，導致菌體過速生長，不能產生更多的紅曲色素；蛋白胨過多，使菌絲體生長不好，不利于紅曲色素的產生。當蛋白胨含量為40 g/L與45 g/L時，紅曲色素的色價分別為294.88 U/mL與299.06 U/mL，色價相差不大，而為減少成本，固選用蛋白胨的含量為40 g/L，此時C/N比為1.5。

圖4 蛋白胨含量對紅曲色素產量的影響

2.3 裝瓶量對紅曲色素產量的影響

裝瓶量是影響液態發酵的一個重要因素，因為本試驗液態發酵是好氧發酵，溶氧的多少直接影響到發酵狀態，然而裝瓶量又與溶氧呈正相關，所以裝瓶量對紅曲霉液態發酵產紅曲色素有很大的影響。本試驗分別加入25、50、75、100、125、150和175 mL帶有最適碳源和氮源的液態基礎發酵培養基于250 mL的三角瓶中。進行液態發酵后，根據發酵液的色價確定最適裝瓶量。結果（圖5）顯示，裝瓶量較少（≤25 mL）或較多（≥75 mL）時，紅曲色素的產量均較低，當裝瓶量為50 mL時，紅曲色素的產量最高，為320.67 U/mL。固裝瓶量為50 mL最為適宜，說明此時的溶氧效果較好。

2.4 接種量對紅曲色素產量的影響

配制含有最適碳源和氮源的液態基礎發酵培養基數瓶，分別以2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%和16%（V/V）的接種量接種。進行液態發酵后，根據發酵液的色價確定最適接種量。結果（圖6）顯示，接種量的大小明顯影響紅曲色素的產量。接種量過少，菌體生長緩慢，發酵時間長，色素產量低；接種量過多，菌絲體大量繁殖，使單位體積內的養料和溶氧不足，影響紅曲色素的產量。當接種量為8%時，紅曲色素的色價最高，為300.73 U/mL。因此，接種量為8%時最為適宜。

圖5 裝瓶量對紅曲色素產量的影響

圖6 接種量對紅曲色素產量的影響

2.5 無機鹽對紅曲色素產量的影響

分別加入0、1、2、3、4、5和6 g/L的NaNO3及0、0.5、1、2、3、4和5 g/L的MgSO4，其它成分同液態基礎發酵培養基（見1.2.1，另加入最適碳源和氮源）。進行液態發酵后，以考察無機鹽（NaNO3和MgSO4）對紅曲色素產量的影響。結果（圖7）顯示，無機鹽（NaNO3和MgSO4）對紅曲色素的產量有一定的影響，總體來說，影響不大。NaNO3對紅曲色素產量的影響（圖7-A）表明，當NaNO3的含量為4 g/L時，紅曲色素的色價最高，為285.60 U/mL；MgSO4對紅曲色素產量的影響（圖7-B）顯示，當MgSO4的含量為3 g/L時，紅曲色素的色價最高，為291.63 U/mL。因此，NaNO3和MgSO4的最適宜量分別為4 g/L與3 g/L。

圖7 無機鹽NaNO3（A）及MgSO4（B）對紅曲色素產量的影響

2.6 微量元素對紅曲色素產量的影響

分別加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g/L的 ZnSO4和0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g/L的MnSO4，其它成分同液態基礎發酵培養基（見1.2.1，另加入最適碳源和氮源）。進行液態發酵后，以考察無機鹽（Zn和Mn）對紅曲色素產量的影響。結果（圖8）表明，微量元素對紅曲霉液態發酵產紅曲色素有一定的影響。ZnSO4，即微量元素Zn對紅曲色素產量的影響（圖8-A）顯示，當ZnSO4的含量為0.1 g/L時，紅曲色素的色價最高，為301.95 U/mL；MnSO4，即微量元素Mn對紅曲色素產量的影響（圖8-B）顯示，當MnSO4的含量為0.4 g/L時，紅曲色素的色價最高，為312.75 U/mL。因此，ZnSO4和MnSO4的最適宜量分別為0.1 g/L與0.4 g/L。

圖8 微量元素Zn（A）和Mn（B）對紅曲色素產量的影響

2.3 Plackett-Burman試驗結果

Plackett-Burman試驗結果如表5所示，采用Design Expert 7.1軟件對試驗數據進行一次多項回歸擬合，獲得紅曲色素色價Y對X1-X8等8個因素的一次回歸方程：

式中，Y為紅曲色素色價（U/mL），X1-X8為自變量的編碼值。該回歸模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），相關系數R2=0.960 4，這表明回歸方程的擬合度和可信度均較高，試驗中96.04%的變異可由該模型進行解釋。

表5 Plackett-Burman試驗設計與結果

方程系數的方差分析結果（表6）顯示，蛋白胨（X2）與接種量（X5）對紅曲色素產量的影響達到了極顯著水平（P＜0.01），為正效應，裝瓶量（X3）為顯著水平（P＜0.05），為負效應；但其它各因素的影響均不顯著（P＞0.05）。顯著性因素（X2、X3與X5等）將采用響應面法進一步優化。X1、X4、X6、X7和X8等非顯著性因素由于均為負效應，后續試驗直接采用Plackett-Burman設計中的低水平為最佳水平，即葡萄糖50 g/L、MgSO42 g/L、NaNO32 g/L、ZnSO40.1 g/L、MnSO40.3 g/L。

2.4 Box-Behnken中心組合試驗

Box-Behnken結果如表7所示，采用Design Ex-pert 7.1軟件對試驗數據進行二次多項回歸擬合，獲得紅曲色素色價Y對蛋白胨（X2）、裝瓶量（X3）和接種量（X5）3個因素的回歸方程：

式中，Y為紅曲色素色價（U/mL），X2、X3與X5為自變量的編碼值。

表6 Plackett-Burman試驗回歸分析結果

表7 Box-Behnken試驗設計和結果

由方差分析結果（表8）可知，回歸模型極顯著（P＜0.01）、失擬項不顯著（P＞0.05）、模型相關系數R2=0.972 1，這表明回歸方程的擬合度和可信度均很高，能夠很好地對紅曲色素的發酵工藝進行描述與預測。由模型系數的顯著性檢驗結果可知，模型的一次項、交互項X3X5與二次項對紅曲色素產量的影響顯著（P＜0.05），而交互項（X2X3和X2X5）與二次項X52影響不顯著（P＞0.05）。為了更直觀地描述X2、X3和X5等3個因素對響應值的影響，利用Design Expert 7.1軟件繪制的響應面圖如圖9所示，在試驗量程內，蛋白胨（X2）和裝瓶量（X3）存在一個拐點，此點紅曲色素產量最高，但接種量（X5）不存在拐點，紅曲色素產量隨接種量的增加一直呈上升趨勢。模型最佳預測點的各因素編碼值可通過對上述二次回歸方程求解而獲得，即X2=0.91、X3=-0.98、X5=1，解碼后可得其真實值，即：蛋白胨58.07 g/L、裝瓶量50.8 mL、接種量10.0%（V/V），在此佳條件下，模型預測的紅曲色素色價的最大值為351.09 U/mL。為驗證模型預測結果的準確性，采用上述最佳條件進行了3次驗證試驗，實測值為342.24±2.88 U/mL，與預測值十分接近，這說明該模型是準確有效的。

3 討論

目前，紅曲霉主要通過固態發酵或液態發酵的方式進行生產。歐美等西方國家推崇液態發酵，主要是其自動化程度高、勞動強度低、生產效率高；但紅曲霉在液態發酵時產紅曲色素的水平較低，這嚴重制約著液態發酵的推廣與應用［4，13］。本研究通過單因素試驗、P-B試驗和響應面試驗對發酵條件進行了系統的優化，分別選擇葡萄糖和蛋白胨是紫色紅曲霉MY-03液態發酵生產紅曲色素的最適碳源和最適氮源，此結果與黃林等［13］的研究結果一致，但在王廣峰［11］和熊曉輝等［19］的研究中玉米粉是最佳碳源，在陳蘊等［20］的研究中，大豆水解液是最佳氮源，這是因為所采用的紅曲霉菌株不同，其生理特性也有差異，同時優化了其他發酵條件。在最佳液態發酵條件下，紫色紅曲霉MY-03紅曲色素的色價為342.24±2.88U/mL，此發酵水平高于目前文獻報道的紅曲色素液態發酵的生產水平［11-13］，對紅曲色素的生產具有一定的指導意。。

表8 二次回歸模型的回歸分析結果

圖9 蛋白胨、裝瓶量與接種量影響紅曲色素色價的響應面圖

4 結論

本研究通過單因素試驗、Plackett-Burman試驗與Box-Behnken試驗對紅曲霉MY-03液態發酵生產紅曲色素的工藝條件進行了系統優化，確定了其最佳生產工藝：葡萄糖50 g/L、蛋白胨58.07 g/L、MgSO42 g/L、NaNO32 g/L、MnSO40.3 g/L、ZnSO40.1 g/L、裝瓶量50.8 mL、接種量10.0%（V/V），于150 r/min、30℃恒溫培養7 d，紅曲色素色價可達342.24±2.88 U/mL，比基礎培養基提高了86.9%。

［1］ Silveira ST， Daroit DJ， Brandelli A. Pigment production by Monascuspurpureus in grape waste using factorial design ［J］. Food Science and Technology， 2008， 41（1）：170-174.

［2］ 劉德華， 劉代喜， 丁海洋， 等.紅曲霉JR液體發酵產紅曲色素的工藝研究［J］.中國釀造， 2010（5）：59-61.

［3］ 陳運中.功能性紅曲色素發酵工藝研究［ J］.食品科學， 2003，24（7）：83-87.

［4］ 季宏飛， 許楊， 李燕萍.采用響應面法優化紅曲霉固態發酵產紅曲色素培養條件的研究［J］.食品科技， 2008， 33（8）：9-13.

［5］ Zhou B， Wang JF， Pu YW， et al. Optimization of culture medium for yellow pigments production with Monascus anka mutant using response surface methodology ［J］. European Food Research and Technology， 2009， 228（6）：895-901.

［6］ 紀遠中.紅曲及紅曲霉的研究現狀及進展［J］.天津藥學，2005， 17（2）：65-67.

［7］ 董吉林， 楊公明， 杜冰， 等.固態發酵生長動力學模擬的研究進展［J］.中國釀造， 2009（6）：9-12.

［8］ Smits JP， Rinzema A， Tramper J， et al. The influence of temperature on kinetics in solid-state fermentation ［J］. Enzyme and Microbial Technology， 1998， 22（1）：50-57.

［9］ 董文賓， 鄭丹， 于琴， 等.紅曲霉固態發酵產生紅曲色素工藝研究［J］.食品研究與開發， 2005， 26（2）：57-59.

［10］ Johns MR， Stuart DM. Production of pigments by Monascus purpureus in solid culture ［J］. Journal of Industrial Microbiology，1991， 8（1）：23-28.

［11］ 王廣峰.紅曲色素液體深層發酵工藝研究［J］.食品科技，2007， 32（10）：57-59.

［12］ 丁海洋， 孟惠惠， 盛承承， 等.紅曲霉JR搖瓶分批補料發酵產紅曲色素的研究［J］.中國釀造， 2009（12）：91-93.

［13］ 黃林， 孟惠惠， 丁海洋， 等.紅曲霉JR產紅曲色素液態發酵培養基配方的篩選［J］.江西農業大學學報， 2009， 31：1134-1139.

［14］ 王金字， 董文賓， 陶璐， 等.紅曲霉固態發酵產紅曲色素的條件研究［J］.添加劑與調味品， 2010， 35（2）：199-202.

［15］ Cho YJ， Park JP， Hwang HJ， et al. Production of red pigment by submerged culture of Paecilomyces sinclairii ［J］. Letters in Applied Microbiology， 2002， 35（3）：195-202.

［16］ 周波， 楊玲， 崔思穎， 等.響應面法優化培養基提高紅曲黃色素的色調［J］.華南理工大學學報， 2008， 36（11）：91-95.

［17］ 陳運中.紅曲色素提取條件的實驗研究［J］.武漢工業學院學報， 2001（3）：19-21.

［18］ 中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局， 中國國家標準化管理委員會.GB4926-2008食品添加劑紅曲米（粉）［S］.北京：中國標準出版社， 2008.

［19］ 熊曉輝， 沈昌， 高巍， 等.紅曲色素液體深層發酵工藝研究［J］.南京農業大學學報， 1997， 20（1）：90-95.

［20］ 陳蘊， 夏永軍， 許贛榮， 等.紅曲液態發酵高產色素低產桔霉素的工藝條件［J］.食品與發酵工業， 2007， 33（10）：10-13.

（責任編輯 馬鑫）

Optimization of Production Condition of Monascus Pigment by Monascus purpureus in Liquid State Fermentation

Zhang Rui
（Bao Tou Light Industry Vocational Technical College，Baotou 014035）

In order to improve the yield of Monascus pigment and reduce the production costs， Monascus purpureus MY-03 was adopted to produce Monascus pigment in the liquid state fermentation， and the fermentation conditions were optimized by Plackett-Burman design and Box-Benhnken experimental design. The results showed that the optimum medium was composed of glucose 50 g/L， peptone 58.07 g/L， MgSO42 g/L， NaNO32 g/L， MnSO40.3 g/L， ZnSO40.1 g/L；and the optimum bottle load was 50.8 mL in a 250 mL flask， and the optimum inoculum volume was 10.0%（V/V）. The color value of Monascus pigment reached to 342.24±2.88 U/mL， increased by 86.9% than that in the basal medium，when the test fungi were incubated in 150 r/min and 30℃ for 7 d.

Monascus purpureus；submerged fermentation；Monascus pigment；Response Surface Methodology

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.028

2014-07-18

張銳，男，講師，研究方向：生物制藥；E-mail：252917839@qq.com