半滑舌鰨性逆轉的遺傳特性研究

宋超蔣麗王景偉，3李曉芳李耕張曉慧王書劉哲李恒德

（1.甘肅農業大學動物科學技術學院，蘭州 730070；2.中國水產科學研究院生物技術研究中心，北京 100141；3.福建農林大學動物科學學院，福州 350002；4.中捷羅非魚養殖有限公司，黃驊 061108；5.中國水產科學研究院營口增殖試驗站，營口 115000；6. 中國水產科學研究院，資源與環境研究中心，北京 100141）

半滑舌鰨性逆轉的遺傳特性研究

宋超1，2蔣麗2王景偉2，3李曉芳4李耕5張曉慧6王書2劉哲1李恒德2

（1.甘肅農業大學動物科學技術學院，蘭州 730070；2.中國水產科學研究院生物技術研究中心，北京 100141；3.福建農林大學動物科學學院，福州 350002；4.中捷羅非魚養殖有限公司，黃驊 061108；5.中國水產科學研究院營口增殖試驗站，營口 115000；6. 中國水產科學研究院，資源與環境研究中心，北京 100141）

半滑舌鰨雌雄個體生長差異懸殊，由于性逆轉而造成的其群體中雌性比例過低大大制約了養殖效率。性逆轉是魚類及兩棲類生物性別決定事件中有趣的生物學問題，其發生的遺傳機制鮮有研究。在該研究中，分別利用雄魚和偽雄魚組建10個半同胞家系，對這10個半同胞家系中的子代雌雄比進行研究，結果發現，2個偽雄魚的家系，其后代個體中遺傳雌性魚全部逆轉為生理雄魚；在另外8個雄魚家系中其性逆轉比呈連續分布，表現為典型的數量性狀特征；半滑舌鰨性逆轉的遺傳力較低，僅為0.058。以上結果表明，偽雄魚作為父本的遺傳可能為完全的父本效應遺傳，性逆轉由于其較低的遺傳力不適合于做家系選育而適合于做家系內的選育或結合分子標記的遺傳評估，以提高雌性比的遺傳進展，半滑舌鰨逆轉比的數量遺傳特征說明其性別決定是多基因作用的結果。

半滑舌鰨；性別決定；性逆轉

半滑舌鰨隸屬于鰈形目（Pleuronectiformes）、舌鰨科（Cynoglossidae）、舌鰨屬（Cynoglossus），主要分布于我國黃、渤海近海區域。半滑舌鰨由于具有強適應性、高營養價值、味道鮮美等特點，成為當前海水養殖的重要品種之一［1］。半滑舌鰨雌、雄魚生長速度差異比較大，雌魚的生長速度是雄魚的2-4倍，雄魚經過兩年培育尚不能達到商品規格，并且在苗種期存在著遺傳雌魚向表型雄魚單向性逆轉的現象［2，3］。在實際大生產的群體中，由于沒有對雌雄親本進行遺傳鑒定，最終的雌雄比例往往不能確定，一般養殖場購買的苗種其雌性比例都在25%以下，最低的時候甚至連20%都難以保證，嚴重制約了生產效益的提高。盡管近些年半滑舌鰨的苗種繁育、健康養殖都得到了良好的發展，但其穩定、高比例的雌性苗種率及其穩步提高的問題一直是半滑舌鰨養殖中急需要解決的問題。

性別決定的機制可以被劃分為兩種類別：一種是遺傳性別決定（genetic sex determination，GSD）；另外一種是環境性別決定（environmental sex determination，ESD）。一種生物的最初性別是由其可遺傳的遺傳元件決定，從受精開始雌雄個體間的遺傳物質就不同；然而環境性別決定在受精時卻沒有初始的性別，它是在生物系統發育過程中決定其性別的［4-6］。半滑舌鰨性染色體為ZW型，即雌性異配型（ZW）［7］。Chen等［8］利用自主開發的若干雌性特異性標記，通過染色體核型分析發現了成對的大型染色體，即為性別染色體Z和W。在舌鰨的人工養殖群體中至今還沒有發現有WW成年個體的存在［2］，事實上利用人工雌核發育創制超雌WW的個體研究表明其超雌個體可能只能存活到肌節期和出膜前期［9，19］，這說明半滑舌鰨WW個體可能是由于缺乏Z染色體的功能而在出膜前期致死，而試圖利用超雌魚實現生產上的全雌化還有一定的距離，加之即使能制備超雌，超雌魚的生產性能如何還是未知數。

半滑舌鰨的性別決定受溫度等外界環境的影響比較大，使得其性別具有較大的可塑性［10］。在養殖過程中，人為地控制溫度、使用激素等可以使魚類的性別發生逆轉。如鄧思平等［11］通過控制養殖溫度，出現了由遺傳雌性向表型雄性逆轉的偽雄個體。張曉彥等［12］利用天然激素17 β-雌二醇處理半滑舌鰨幼魚得到了高達97%的雌性率。除了人工誘導的性逆轉之外，在自然界中也存在著性逆轉的現象，如黃鱔（Monopterus albus）［13］、石斑魚（Epinephelus akaara）［14］、黑鯛（Acanthopagrus schlegelii）［15］等雌雄同體魚類，以及青鳉（Oryzias latipes）［16］、半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）［3，17］等雌雄異體魚類。由于在半滑舌鰨養殖過程中使用激素來提高雌性率，此做法有食品安全和影響環境的弊端，不適宜生產性應用；而控制溫度只能誘導半滑舌鰨雌魚性逆轉成雄魚，不能達到提高養殖群體中的雌性比例的目的。利用偽雄魚（ZW）建立的家系，其后代遺傳雌魚性逆轉成生理雄魚的比例高達91.4%［10，23］。研究發現，養殖過程中不同家系之間的生理雌雄比例存在著差異［18］，但是目前還未見對性逆轉進行遺傳特性分析的報道。因此從群體的角度來研究不同家系間半滑舌鰨性逆轉的遺傳特性，對利用性別遺傳特性進行遺傳選育研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

2013年4月在河北中捷養殖廠進行半滑舌鰨親魚選育，輕壓半滑舌鰨親魚的腹部采集精、卵建立10個家系，各家系在工廠化養殖模式下同池養殖，在這10個家系中以不同的雌性親魚（雌性親魚都為2齡）分為5組；第1組為1、2家系；第2組為12、14家系；第3組為16、17家系；第4組為19家系；第5組為38、39、40家系。第1、2組中的雄性親魚為3齡；第3、4組中的雄性親魚為4齡；第5組中的雄性親魚為2齡。在建立家系的同時，采集少量親魚鰭條以備后用。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 2013年9月采集樣品。隨機撈取300尾F1代樣本（理論上每家系撈取30尾），從魚的腹部用強光照射，根據陳松林等［18］的方法用強光從魚背面的性腺位置照射，在腹面用肉眼觀察性腺的顏色和形狀，并做雌雄記錄。再解剖鏡下取魚的性腺放入Bouin氏液中（苦味酸飽和液∶甲醛∶冰醋酸=15∶5∶1），24 h之后將樣品轉移至70%酒精常溫下可長期保存，并做好對應的標記。剪取適量的組織樣品放入離心管中4℃保存以備用，并做好相應標記。

1.2.2 性別鑒定

1.2.2.1 遺傳性別鑒定 基因組DNA提取：采用海洋動物組織基因組DNA快速提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）提取DNA，溶解于50 μL TE中，用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，4℃保存備用。根據Chen等［19］設計引物序列為：上游序列：GAGGCCGACAGGATCGTAC；下游序列：TACGACGTACTCCGGTGGTTTT 。引物由上海生工生物技術有限公司合成。PCR反應體系為20 μL，其中包括mix 10 μL，上下游引物各1 μL，模板1 μL，加ddH2O補足20 μL。PCR反應程序為：95℃預變性5 min，95℃（30 s），57℃（30 s），72℃（30 s），35個循環，72℃延伸7 min。PCR產物用3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，電壓100 V，電泳時間1 h，檢測出現兩條帶（218 bp，206 bp）的為雌魚（ZW），出現一條帶（206 bp）的為雄魚（ZZ）。

1.2.2.2 生理性別鑒定 生理性別鑒定用石蠟組織切片的方法，將固定好的性腺進行各級脫水（70%、80%、90%、95%酒精、無水乙醇），透明，浸蠟，包埋。然后進行切片，切片儀為SYD-S2020型，切片厚度為6 μm，然后用蒸餾水展片，展片儀為Leica，HI1220型。37℃烘干12 h后HE染色，封片后于光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3 親子鑒定 本試驗中的10個家系由于是同池養殖，所以為了統計每個家系中的各項試驗指標，需要做親子鑒定。針對親子鑒定，本試驗篩選了15對引物（表1）［20］送北京閱微基因技術有限公司利用毛細管電泳技術進行SSR分型檢測，測序儀為3730XL DNA analyzer（ABI公司），檢測結果用Cervus 3.0軟件根據LOD值（似然率E的自然對數值）的高低判定親子關系［21］。

表1 半滑舌鰨親子鑒定引物設計

第14、17這兩個家系中的雄性親魚為自然性逆轉的偽雄魚。

1.2.4 統計分析

1.2.4.1 家系間的遺傳性別比例的差異分析 該分析只對將遺傳性別作為一個性狀，0表示雄性，1表示雌性，采用logistic分析家系間是否有顯著差異。

其中，logit（xij）=log（px/（1-px）），p為遺傳雌性比例，μ為群體均值，di為第i條雌魚，sj（di）為第i條雌魚配對的第j條雄魚。

1.2.4.2 家系間的性逆轉的差異分析 該分析只對所有遺傳雌性將是否發生性逆轉作為一個性狀，0表示未發生性逆轉，1表示發生性逆轉。采用logistic分析家系間是否有顯著差異，并剖分家系間和家系內的方差組分。

其中，logit（yij）=log（py/（1-py）），p為性逆轉比例，μ為群體均值，di為第i 雌魚，sj（di）為第i條雌魚配對的第j條雄魚。

1.2.4.3 性逆轉的遺傳力 由于試驗設計為嵌套模型，采用logistic回歸模型估計方差組分，其遺傳力計算公式為：

2 結果

2.1 各家系偽雄魚、雄魚和雌魚所占比例

試驗發現（圖1），不同家系間偽雄魚、雄魚和雌魚所占比例有明顯的差異，1-8號家系為正常遺傳雄魚做父本，偽雄魚所占比例分別為1.5%，30.8%，10.0%，14.3%，17.1%，0.0%，12.5%，17.6%，其中6號家系中的遺傳雌魚不發生性逆轉，1號家系性逆轉比例很低，其余6個家系存在不同程度的性逆轉；9和10號家系為偽雄魚做父本，其后代中遺傳雌魚全部逆轉為生理雄魚，考慮到在取樣時1-10號家系，可能存在偏取樣導致所取的樣本中雄性偏多，進而導致各個家系中遺傳雄魚的比例偏高，但是這并不影響為性逆轉率高低的判定。

圖1 各個家系雄魚和偽雄魚所占百分比

2.2 肉眼觀察半滑舌鰨性成熟之前的生理性別的準確性

在腹面用肉眼觀察性腺的顏色和形狀，雌魚的性腺比較狹長，顏色呈淡黃色或透明狀；雄魚的性腺短而小，顏色呈黑色或深藍色，通過對肉眼觀察與石蠟切片（圖2）觀察半滑舌鰨性成熟之前的生理性別比較（表2）。

圖2 組織切片法與H.E染色法區分半環舌鰨表型性別

表2 肉眼觀察和組織切片判斷半滑舌鰨性成熟之前的生理性別的準確性比較

將用肉眼判斷的樣本全部進行組織切片和分子標記雌雄鑒定，結果發現，通過石蠟切片能夠準確判斷半滑舌鰨的生理性別，準確性為100%；而通過肉眼觀察判斷半滑舌鰨生理性別的準確性較低，準確性僅為54.70%。結果表明通過肉眼觀察判斷半滑舌鰨性成熟之前的生理性別的可靠性較低，所以在以后的試驗過程中應采用組織切片觀察判斷生理性別。

2.3 性逆轉的遺傳力

方差組分分析的結果（表3）顯示，看出雌魚和雌魚內雄魚之間的變異都比較大，根據公式算得的性逆轉的遺傳力為0.058，屬低遺傳力。因此在實際選育低性逆轉比例的家系時，必須同時考慮雌魚和雄魚的影響。

表3 方差組分剖分結果分析

3 討論

3.1 父本偽雄魚的遺傳規律與生產利用

通過試驗發現，偽雄魚的后代全部為生理雄性，即遺傳雌性的魚100%都發生了性逆轉，說明偽雄魚的遺傳是完全的父本效應，與母本無關，該結果與陳松林等［22，23］通過大量家系性別比例檢測以及DNA甲基化分析所獲得的結果相一致，即偽雄魚的染色體的DNA甲基化修飾模式與其后代一致。由正常父本（ZZ）組建的群體后代中，其ZW型的遺傳雌魚能在一定的外界環境條件下逆轉為生理雄魚，而該生理雄魚再做父本組建的后代群體中，其偽雄性狀就會通過父本決定下來，這可能是一個比較典型的獲得性遺傳性狀，在理論研究中具有重要的意義。偽雄魚在配子體發生過程中如何避免發生染色質重編程的分子機制應該是有重要意義的研究領域，同時該分子機制的探索將為性狀的固定提供新的視角。該遺傳規律從親本層面解釋了在半滑舌鰨種苗大生產中雄性過多，雌雄比例不穩定的現象，因此在生產實踐中，避免使用偽雄魚將是調控舌鰨雌性比例的重要手段。

3.2 選育提高雌性比例

研究發現性逆轉的遺傳力非常低，傳統魚類的選育靠建立家系，以家系選育為主，一般高遺傳力的性狀適用于家系間選育，低遺傳力的性狀適用于家系內選擇，要從選育上控制舌鰨性逆轉，必須關注家系內的變異。傳統選育的經濟性狀，如生長性狀，其遺傳力較高，往往采用家系間選育，因此以多性狀為育種目標時，應將家系間選擇和家系內選擇結合起來，根據經濟權重建立綜合選擇指數，以達到選育目標。

由于采用傳統的以系譜為基礎的BLUP遺傳評估，其準確性對低遺傳力性狀來說很低，因此結合分子標記進行遺傳評估是進行調控雌雄比例的一個有效手段，特別是以高通量標記為基礎的遺傳評估方法，更適合于低遺傳力的性狀，也是下一步的重點研究方向。

在性逆轉這個性狀上，雌性和雄性間的差異都比較大而其遺傳力比較低，因此雜交手段也是控制性逆轉的重要方法。對親本進行配合力測定，充分評估各個親本對性逆轉的影響，建立相應品系，然后通過雜交來提高雌性比例。這種方法不僅可以對一個性狀進行，也可以進行多性狀的選育。

4 結論

利用偽雄魚建立的家系其后代的遺傳雌魚更容易逆轉為生理雄魚，性逆轉比例高達100%；而利用正常雄魚建立的家系其后代的性逆轉的比例呈連續性分布，表現為典型的數量性狀特征；利用數量遺傳學分析得出半滑舌鰨性逆轉的遺傳力較低，僅為0.058，從而表明，偽雄魚作為父本的遺傳可能為完全的父本效應遺傳，性逆轉由于其較低的遺傳力不適合做家系間選育，而適合于做家系內的選育或結合分子標記的遺傳評估。此外，利用手電照射半滑舌鰨的腹部肉眼判斷其生理性別的準確性僅為54.70%，可靠性比較低。

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（責任編輯 李楠）

Studies on Genetic Features of Sex Reversal in Cynoglossus semilaevis

Song Chao1，2Jiang Li2Wang Jingwei2，3Li Xiaofang4Li Geng5Zhang Xiaohui6Wang Shu2Liu Zhe1Li Hengde2
（1. College of Animal Science and Technology，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070；2 Biotechnology Center，Chinese Academy of Fishery Sciences，Beijing 100141；3.College of Animal Science，Fujian Agricultural University，Fuzhou 350002；4. Zhongjie Tilapia Aquaculture Limited Company，Huanghua，Hebei 061108；5. Yingkou Proliferation Experimental Station，Chinese Academy of Fishery Sciences，Yingkou 115000；6. Research Center of Resources and Environment，Chinese Academy of Fishery Sciences，Beijing 100141）

The remarkable individual size differences of half-smooth tongue（Cynoglossus semilavi.）between female and male fishes exist. However， the lower ratio of female in cultured populations arise from sex reversal of the females leads to lower production efficiency. In sex-determination of some fishes and amphibians， sex reversal is interesting biology question and its molecular genetic mechanisms are rarely explored. In this study， 10 half-sib families are set up by utilizing two types of male parents：genetically males and pseudo males which are genetically females. The results showed that the females were all reversed into physiologically male fishes in two families with pseudo male parent. In the other 8 families with normal male parent， the ratio of sex reversal in individual populations presents continuous distribution， which fits for features of QTLs（Quantitative Trait Loci）typically；the heredity of sex reversal is lower， only 0.058. All of these results showed that，the pseudo males as parents， which demonstrate full paternal-effects， the female progenies were all reversed into pseudo males；interfamily selection for improving the genetic advances of sex ratio or genetic evaluation of sex reversal by using genetic markers are advantageous over intrafamily selection for lower heredity of sex-reversal；the continuous distribution of ratio of sex reversal implies the sex-determination for halfsmooth tongue is depended on the interactions among multiple QTLs.

half-smooth tongue；sex-dertermination；sex-reversal

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.030

2014-07-18

中央公益級基本科研業務費項目（2013A0401，2013A0506）

宋超，碩士，研究方向：魚類生物學及水產養殖；E-mail：songchaosc168@163.com

劉哲，博士，研究方向：魚類基礎生物學及分子遺傳，E-mail： liuz@gsau.edu.cn； 李恒德， 博士， 研究方向：統計遺傳學，E-mail：hengde.li@cafs.ac.cn