人FGF21原核表達載體的構建及重組蛋白表達

張禮林唐青藍許慶忠雷霆雯李紅梅

（1. 貴陽醫學院生物化學與分子生物學教研室，貴陽 550004；2. 海南省第三人民醫院檢驗科，三亞 572000）

人FGF21原核表達載體的構建及重組蛋白表達

張禮林1唐青藍2許慶忠1雷霆雯1李紅梅1

（1. 貴陽醫學院生物化學與分子生物學教研室，貴陽 550004；2. 海南省第三人民醫院檢驗科，三亞 572000）

構建人FGF21（fibroblast growth factor，FGF）cDNA的原核表達載體并誘導其重組蛋白表達。提取人肝臟總RNA后，經RT-PCR擴增獲得目的片段，構建其T載體進行保存。再構建重組原核表達載體pET-28a（+）-hFGF21，重組質粒轉化至大腸桿菌菌株BL21（DE3）中，在IPTG誘導下得到可溶性表達，采用親和層析法純化表達產物后，進行Western blot鑒定。成功構建重組質粒pET-28（+）-hFGF21，對其進行可溶性表達后成功純化出his-hFGF21，經Western blot鑒定該融合蛋白可與FGF21抗體特異性結合。成功構建pET-28（+）-hFGF21，并可溶性表達his-hFGF21蛋白。

人成纖維細胞生長因子（FGF21）；克隆；原核表達；蛋白純化

成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）是一類由FGF基因家族成員編碼的結構相關蛋白質。目前，已經發現其家族有23個成員，其中心區域都含有一段同源性為30%-70%的氨基酸序列［1］。龐大的FGF家族成員可調節生物代謝；調控細胞增殖、遷移和分化；參與腫瘤的發生和發展［2，3］。FGF21是FGF家族的一個新成員，是一種可分泌的蛋白［4］，近年來已經成為國際上研究肥胖和糖尿病的熱點基因之一。FGF21可以降低血糖濃度，其對糖代謝的調節既不依賴于胰島素，又能夠增強胰島素的敏感性，促進胰島β細胞的存活，還可以降低胰島素的使用濃度，改善胰島素抵抗［5-9］。同時，FGF21可以調節脂代謝，改善脂蛋白圖譜，降低血漿中低密度脂蛋白膽固醇，甘油三酯水平，并提高高密度脂蛋白膽固醇［10］。多項研究證明，糖尿病患者血清FGF21的表達量增高［11-13］，且FGF21水平增高是2型糖尿病獨立危險因素［14］。此外，在肥胖個體中FGF21的血清水平上升［12］。 本研究擬構建人FGF21的原核表達載體，并對其進行誘導表達和純化，以獲得人FGF21的融合蛋白，為后期進一步研究FGF21的活性、作用及其與原發性高血壓相關性研究奠定試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒與菌株 質粒pMD-19-T載體購自寶生物工程（大連）有限公司，受體菌E.coli DH5α菌株、E.coli BL21（DE3）菌株、pET-28a（+）質粒由本實驗室提供。

1.1.2 酶與主要生化試劑 總RNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司，M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒購自上海生工生物工程有限公司，Premix Taq、限制性內切酶XhoⅠ及BamHⅠ、T4 DNA Ligase、X-gal、IPTG、瓊脂糖凝膠DNA片段純化試劑盒、DNA Marker購自寶生物工程（大連）有限公司，Trizol、質粒DNA小量提取試劑盒購自OMEGA公司，蛋白marker購自Fermentas MBI，超級感受態細菌制備試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，DMF、DMSO購自AMRESCO公司，過硫酸胺（APS）、疊氮化鈉、溶菌酶、甘氨酸、Triton X-100、咪唑、PMSF、考馬斯亮蘭R-250、TRIS、丙烯酰胺購自Solarbio公司，HIS-Select Nickel Affinity Gel 購自Sigma-aldrich公司、FGF-21 Antibody rabbit polyclonal IgG、Goat anti-rabbit IgG-HRP購 自Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 方法

1.2.1 引物序列的設計 根據GenBank中人FGF21（NM_019113.2、GI：68215584）基因序列，設計引物擴增人FGF21cDNA從235至777之間的共543個堿基的片段，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。H上游：CGGGATCCCACCCCATCCCTGACTCCAGT（下劃線為BamH I酶切位點，前兩個為保護性堿基），H下游：CCCTCGAGTCAGGAAGCGTAGCTGGGGCT（下劃線為Xho I酶切位點，前兩個為保護性堿基）。

1.2.2 RT-PCR 獲取目的片段與T載體構建 試劑盒法提取人肝臟總RNA（人肝組織取自于貴陽醫學院附屬醫院肝膽外科行肝臟切除術者。），經M-MuLV酶合成人源型cDNA第一鏈，以cDNA第一鏈為模板，加入H上游、H下游引物各0.5 μL（10 μmol/L），Premix Taq 12.5 μL，加水至總體積25 μL。擴增條件：94℃預變性5 min后進入循環；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，循環30次；72℃延長10 min。擴增出人FGF21 cDNA從235至777之間的共543個堿基的片段，構建于pMD19-T載體，經藍白斑篩選出陽性克隆子，對其進行菌落PCR鑒定，并送上海生物工程公司測序，將測序正確的陽性克隆子命名為pMD19-T-hFGF21保存備用。

1.2.3 人FGF21cDNA表達載體的構建 以pMD19-T-hFGF21為模板，加入H上游（10 μmol/L）、H下游引物（10 μmol/L）各1 μL，Premix Taq 12.5 μL，加水至總體積25 μL。擴增條件：94℃預變性5 min后進入循環；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，循環30次；72℃延長10 min。大體系擴增出目的片段，將PCR產物割膠回收后用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，回收酶切片段，并與用同樣兩種酶處理的pET-28a（+）質粒進行連接，連接產物轉化E. coli BL21（DE3）感受態細胞，LK平板篩選陽性轉化子，PCR鑒定后，挑單菌落接種培養，抽提質粒，經雙酶切鑒定正確后送上海生物工程公司測序。

1.2.4 融合蛋白的誘導表達 將測序正確的質粒轉化Ecoli.BL21DE3感受態細胞，LK平板篩選陽性菌落，挑取單菌落，在LK液體培養基中37℃ 200 r/min過夜培養。按1∶500的比例取上述菌液轉接于LK液體培養基中，37℃ 200 r/min振搖，至 OD600達到0.4時，加入IPTG（終濃度為0.2 mmol/L），23℃120 r/min誘導4 h，收集菌體。將菌體蛋白進行12% SDS-PAGE電泳鑒定。

1.2.5 融合蛋白的純化 按上述條件誘導表達大量表達載體，收集菌體后，100 mL菌體沉淀中加入8 mL裂解液、60 μL PMSF（0.1 mol/L）吹打混勻，振蕩混勻20 min。冰浴超聲破碎1 h，4℃，12 000 r/min離心20 min，收集上清與沉淀，將上清與沉淀分別進行12% SDS-PAGE電泳鑒定。取超聲破碎上清，4℃ 12 000×g離心10 min后取100 μL裂解上清液與200 μL不含咪唑的平衡緩沖液，輕柔顛倒混勻數次。4℃ 5 000×g離心30 s，小心棄上清，并留樣少許保存。向凝膠中加入1 mL預冷的不含咪唑的清洗緩沖液清洗3次。輕柔混合親和凝膠30 s，4℃ 5 000×g離心30 s，小心棄上清，留樣少許，重復3次。最后，向凝膠中加入100 μL his洗脫緩沖液，輕柔旋轉混勻1 min，4℃ 5 000×g離心30 s，小心吸取上清，留樣保存，重復操作2次。將純化的蛋白液、留樣的漂洗液、洗脫液分別進行12% SDS-PAGE電泳鑒定。

1.2.6 Western blot鑒定 分別取BL21（DE3）菌株誘導表達蛋白裂解液、未純化的蛋白裂解液和純化his-hFGF21蛋白液經SDS-PAGE凝膠泳后，將蛋白條帶轉至PVDF膜上，經Western blot封閉液封閉后，依次加入兔源性FGF21多克隆一抗，羊抗兔二抗，最后用ECL-Plus發光試劑顯色，干燥后掃描圖像保存。

2 結果

2.1 RT-PCR 獲取目的片段與T載體構建

2.1.1 RT-PCR 獲取目的片段 以人肝組織cDNA第一鏈為模板，經PCR擴增人FGF21 基因的完整開放閱讀框區，結果表明成功地從人FGF21 cDNA擴增出目的片段。

2.1.2 T載體的構建 通過T-A克隆將PCR產物與pMD-19T載體連接，將重組pMD-19T-hFGF21載體經藍白斑篩選挑選出陽性菌落進行PCR鑒定，結果見圖1，初步驗證了所構建T載體上帶有目的基因。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳檢測人FGF21重組載體pMD19T-hFGF21菌落PCR

2.1.3 測序鑒定 將菌落PCR鑒定正確的陽性菌落擴大培養12 h后，取1 mL送基因公司進行序列分析，經測定表明pMD19T-hFGF21基因堿基序列與GenBank公布的人FGF21cDNA序列一致，即可確認人FGF21基因成功克隆到pMD-19T載體，將正確的克隆命名為pMD19T-hFGF21。

2.2 人FGF21基因表達載體的構建

2.2.1 人FGF21重組表達載體連接 大體系擴增人FGF21目的片段后，對其與表達載體pET-28a（+）分別進行雙酶切，分別回收雙酶切片段，進行連接反應，連接產物轉化大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞，涂布于LK平板篩選陽性菌落，結果見圖2，初步表明人FGF21重組表達載體構建成功。

圖2 人FGF21重組表達載體Kan抗性篩選平板

2.2.2 人FGF21重組表達載體酶切鑒定 將LK平板篩選的陽性菌落接種于LK液體培養基中，37℃200 r/min培養14 h后提取質粒，雙酶切處理，酶切結果見圖3，由此鑒定人FGF21重組表達載體構建成功，將其命名為pET-28a（+）-hFGF21。

圖3 瓊脂糖凝膠電泳檢測人FGF21重組表達載體酶切圖

2.2.3 測序鑒定 雙酶切鑒定正確的質粒DNA定量后取30 μg送基因公司進行序列分析，經測定表明pET-28a（+）-hFGF21基因堿基序列與GenBank公布的人FGF21基因序列一致，即可確認人FGF21基因成功克隆到pET-28a（+）表達載體上，將正確的克隆命名為pET-28a（+）-hFGF21。

2.3 融合蛋白的誘導表達

取pET-28a（+）-hFGF21的BL21DE3陽性菌經抗生素篩選后取單菌落接種于LK液體培養基中，37℃ 200 r/min振搖過夜，擴大培養至OD600為0.4時，在IPTG終濃度為0.2 mmol/L、1 mmol/L的條件下，以23℃ 120 r/min振搖后4 h，收集菌體沉淀，用2×sample buffer變性處理，SDS-PAGE鑒定（圖4）發現在22 kD左右均出現明顯目的蛋白條帶。

圖4 SDS-PAGE電泳檢測hFGF21蛋白誘導表達產物

2.4 融合蛋白的純化

2.4.1 菌體破碎 取pET-28a（+）-hFGF21的BL-21DE3菌種抗生素平板接種過夜后，挑取單菌落于LK液體培養基中振搖過夜，按1∶500的比例取20 μL菌液加入100 mL新鮮抗生素液體培養基中，37℃ 200 r/min振搖至OD600達到0.4時，加入IPTG使其終濃度為0.2 mmol/L，23℃ 120 r/min振搖4 h，收集菌體沉淀加入8 mL裂解液、PMSF后振蕩混勻20 min，冰浴超聲破碎1 h，離心后分離上清與沉淀，變性后SDS-PAGE鑒定（圖5），由染色結果可知，his-hFGF21蛋白在上清液中大量表達。

圖5 SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白可溶性分析

2.4.2 FGF21蛋白純化 將裂解后的his-hFGF21蛋白裂解上清液與 his鎳親和凝膠結合后，將未結合的蛋白漂洗除去，再用 his洗脫緩沖液，將his融合蛋白從凝膠上洗脫下來，即得到純化的his-hFGF21融合蛋白。將洗脫液、漂洗液變性后進行SDS-PAGE鑒定（圖6），均可見到明顯的目的蛋白，純化成功。

圖6 SDS-PAGE電泳檢測純化蛋白his-hFGF21

2.5 Western blot鑒定FGF21蛋白

一抗為兔抗FGF21多克隆抗體，二抗為辣根過氧化物酶標記鼠抗兔IgG，進行Western blot免疫印跡分析，化學發光顯色后結果如圖7所示，hishFGF21蛋白與兔抗FGF21多克隆抗體呈陽性反應，在約22 kD處有特異性蛋白反應條帶。

圖7 Western blot鑒定his-hFGF21蛋白

3 討論

FGF21是由肝、胰、脂肪和骨骼肌、心臟、胸腺產生，可能從外周組織中以活化形式分泌［15-19］。FGF21 mRNA主要在肝臟中高水平表達［19］。本研究獲得了his-hFGF21融合蛋白，his-hFGF21的分子量約為22 kD，純化后的融合蛋白經Western blot免疫印跡鑒定正確，說明關于his-hFGF21融合蛋白制備成功。

目前，關于FGF21的研究多集中在其糖尿病的相關性研究中，且將FGF21用于治療糖尿病已經進入2期臨床研究階段［20］，但尚未發現關于人FGF21與原發性高血壓的相關性報道。本研究獲得了人FGF21的表達，其表達產物his-hFGF21融合蛋白具有免疫原性，其活性還有待進一步研究。

4 結論

本試驗成功構建了pET-28（+）-hFGF21，并可溶性表達出his-hFGF21蛋白。

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（責任編輯 李楠）

Preparation of Prokaryotic Expression Construct of Human FGF21 cDNA and Its Recombinant Protein Expression

Zhang Lilin1Tang Qinglan2Xu Qingzhong1Lei Tingwen1Li Hongmei1
（1. Department of Biochemistry and Molecular Biology，Guiyang Medical College，Guiyang 550004；2. Department of Clinical Laboratory，the Third People's Hospital of Hainan Province，Sanya 572000）

Preparation of prokaryotic expression constructs of human FGF21（fibroblast growth factor，FGF）cDNA and induction of recombinant hFGF21 protein expression. Total RNA was extracted from human liver， and the target cDNA fragment was obtained using RTPCR. The amplified cDNA fragment was cloned into pMD19-T for preservation. Then the expression construct pET-28a（+）-hFGF21 was successfully constructed and expressed with IPTG induction， and the his-hFGF21 protein was purified with histide-selective nickel affinity gel and identified by Western blot. Western blot analysis showed that the fusion protein had specific binding with a FGF21 antibody.

human FGF21；molecular cloning；prokaryotic expression；protein purification

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.032

2014-09-25

貴州省科技計劃項目資助課題（黔科合LG字［2011］012號）

張禮林，女，碩士研究生，研究方向：基因工程藥物；E-mail ： 2751628863@qq.com

雷霆雯，女，教授，碩士生導師，研究方向：基因工程藥物；E-mail：leitw@sina.com李紅梅，女，副教授，博士，研究方向：基因工程藥物；E-mail：gylhm@gmc.edu.cn