人離體紅細胞ATP含量與死亡時間和環(huán)境溫度的關系

韓瑋　于明鑫　唐暉　李常蘭　賀敏　任素萍　焦章平　于群

1.北京市公安局豐臺分局物證鑒定所，北京100072；2.北京十一學校，北京100850；3.北京市公安局法醫(yī)檢驗鑒定中心，北京100192；4.軍事醫(yī)學科學院野戰(zhàn)輸血研究所，北京100850

人離體紅細胞ATP含量與死亡時間和環(huán)境溫度的關系

韓瑋1，4▲于明鑫2▲唐暉3李常蘭4賀敏4任素萍4焦章平3于群4

1.北京市公安局豐臺分局物證鑒定所，北京100072；2.北京十一學校，北京100850；3.北京市公安局法醫(yī)檢驗鑒定中心，北京100192；4.軍事醫(yī)學科學院野戰(zhàn)輸血研究所，北京100850

目的研究通過紅細胞ATP含量推斷早期死亡時間的適用溫度范圍和時間范圍。方法采集12名健康捐血者全血各40 mL，分裝后分別保存于15、20、25、30℃的恒溫箱中，以4 h間隔取血樣，采用生物發(fā)光法檢測ATP含量，各組進行統(tǒng)計學分析，推導線性回歸方程，計算各時間點的偏離時間。結果4組平均偏離時間差距較大，15、20、25、30℃組平均偏離時間分別為4.80、2.04、1.77、5.71 h，而30℃組隨著統(tǒng)計時間段的縮短平均偏離時間從5.71 h縮短至1.67 h。結論紅細胞ATP含量這一參數(shù)最佳適用溫度范圍為20～30℃，有效評估時間20℃為64 h，25℃為40 h，30℃為28 h。

死亡時間；紅細胞ATP含量；環(huán)境溫度

死亡時間推斷（estimation of the time since death）在刑事案件的偵破工作中具有非常重要的意義，在一定的溫度范圍內，紅細胞ATP含量與保存時間具有直線相關性，可以作為死亡時間推斷的一種客觀參數(shù)［1］，常用死后間隔時間（postmortem intervals，PMI）來表達死亡時間［2］。本研究通過在不同溫度下縮短紅細胞ATP檢測時間間隔（4 h），分析離體紅細胞中ATP含量變化與PMI和環(huán)境溫度之間的關系，以評估測定紅細胞ATP含量用于推斷早期死亡時間的有效時間范圍和溫度范圍。

1　材料與方法

1.1材料

選取健康捐血者12名，均來自北京市公安局豐臺分局，男、女各6名，無血液疾病或代謝性疾病，年齡25～40歲，采血前均告知采血量、可能風險并簽訂捐血志愿書。嚴格依照無菌操作規(guī)程，2010年3月由執(zhí)業(yè)護士用EDTA真空采血管各采集全血40 mL。

1.2方法

1.2.1血樣分組及保存將全血搖勻后，即刻將各個血樣以每份500 μL分裝到EP管中，而后分成4組，分別置于15、20、25、30℃的恒溫箱中保存。各組樣本分別在0、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48 h時間點取1份待檢，其中15、20℃組樣本增加52、56、60、64、68、72 h時間點。

1.2.2血紅蛋白含量測定將血樣搖勻，然后將EP管放入Sysmex-Poch-100i血液分析儀（Sysmex公司，日本）樣品槽中，測定血紅蛋白濃度（g/L）并記錄。

1.2.3紅細胞ATP待檢標本處理取40 μL血樣加入裝有1000 μL等滲PBS緩沖液的EP管中，搖勻，置于干熱器中100℃加熱10 min，自然冷卻后13 000 r/min離心3 min，取上清液即為ATP待檢標本。

1.2.4 ATP含量測定采用改良后生物發(fā)光法［3］。熒光素酶系緩沖液用50 mL蒸餾水溶解，標準ATP加1 mL熒光素酶系緩沖液溶解成50 μmol/L，用熒光素酶系緩沖液將熒光素-熒光素酶粉劑配成濃度3 g/L；取0.2 mL待測ATP樣品于反應杯中，放入WDD-1型發(fā)光光度計（北京第二光學儀器廠）的反應暗室中，注入0.8 mL熒光素酶液，記錄1 s積分最大發(fā)光強度；取ATP標準液從1∶2～1∶128倍比稀釋，同樣方法測定最大發(fā)光強度后繪制標準曲線，從標準曲線上查出樣品ATP濃度值（μmol/L）。全部試劑為中國科學院上海植物生理研究所生產。

1.2.5紅細胞ATP含量計算紅細胞ATP含量（μmol/ gHb）=26×樣本ATP濃度值/血紅蛋白濃度值。

1.3統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)采用SAS 9.2軟件進行統(tǒng)計學分析。對不同溫度組紅細胞ATP含量（［ATP］）隨保存時間（PMI）的變化進行線性回歸分析，推導回歸方程，并對相關系數(shù)進行相關性檢驗。根據(jù)不同溫度組的回歸方程進行各時間點殘差計算。30℃組另選取0～24、28、32、36、40、44 h計6個時間段進行線性回歸分析，并分別計算殘差。以環(huán)境溫度和保存時間為自變量，將不同溫度組、不同保存時間下全部數(shù)據(jù)匯總采用最小二乘法進行曲線擬合，擬合形式分別為二元一次方程、二元二次方程和二元三次方程，并對擬合結果進行AIC檢驗，AIC值越小適合度越高。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1紅細胞ATP含量隨保存時間的變化

紅細胞ATP含量隨保存時間的變化見表1，其變化趨勢見圖1。紅細胞ATP含量隨保存時間的延長呈下降趨勢。

2.2不同溫度組線性回歸分析及決定系數(shù)情況

不同溫度組線性回歸分析及決定系數(shù)（r2）情況見表2、3。各組r2差距較大，15、20、25、30℃組分別為0.961、0.988、0.994、0.936，30℃組不同時間段進行統(tǒng)計，r2值隨時間段的縮短而增大，0～24 h段為0.991。相關分析顯示，紅細胞ATP含量與保存時間呈負相關（r均為負值），各組相關分析結果顯示，ATP含量與保存時間的相關性差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

表1　不同溫度下紅細胞ATP含量隨保存時間的變化（μmol/gHb，n=12，

表1　不同溫度下紅細胞ATP含量隨保存時間的變化（μmol/gHb，n=12，

注：“-”表示無數(shù)據(jù)

保存時間（h）15℃20℃25℃30℃0481 2 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 2.89±0.24 2.80±0.25 2.70±0.29 2.58±0.25 2.51±0.24 2.47±0.20 2.38±0.20 2.32±0.19 2.22±0.17 2.09±0.20 1.97±0.18 1.86±0.19 1.74±0.15 1.61±0.16 1.36±0.14 1.21±0.11 1.00±0.09 0.70±0.06 0.65±0.06 2.89±0.24 2.59±0.23 2.41±0.21 2.27±0.19 2.13±0.18 2.01±0.18 1.90±0.15 1.84±0.14 1.71±0.17 1.58±0.14 1.45±0.12 1.31±0.13 1.17±0.12 1.00±0.10 0.86±0.07 0.75±0.08 0.52±0.05 0.40±0.05 0.35±0.04 2.89±0.24 2.52±0.23 2.23±0.20 2.12±0.21 1.84±0.16 1.63±0.17 1.37±0.11 1.05±0.10 0.90±0.08 0.72±0.06 0.57±0.05 0.37±0.04 0.30±0.03 2.89±0.24 2.50±0.23 2.15±0.20 1.89±0.14 1.38±0.10 1.03±0.07 0.87±0.06 0.61±0.05 0.51±0.02 0.35±0.02 0.22±0.03 0.13±0.01 0.11±0.02 ------------

圖1　不同溫度下紅細胞ATP含量隨保存時間的變化

表2　不同溫度條件下紅細胞ATP含量與保存時間的線性回歸分析

表3　30℃組不同時間段紅細胞ATP含量與保存時間的線性回歸分析

2.3不同溫度組偏離時間分析

不同溫度組偏離時間情況見表4、5。以各指標原始數(shù)據(jù)分別代入線性回歸方程，計算殘差（估計保存時間與實際保存時間之差），同一時間點上12個殘差絕對值的均值為各時間點推測的平均偏離時間。表4、5結果顯示，各組平均偏離時間亦差距較大，15、20、25、30℃組總體平均值分別為4.80、2.04、1.77、5.71 h，而30℃組隨著統(tǒng)計時間段的縮短總體平均值從5.71 h縮短至1.67 h。

表4　不同溫度下平均偏離時間的比較（h）

表5　30℃組不同時間段平均偏離時間的比較（h）

2.4紅細胞ATP含量與保存時間和保存溫度關系的擬合方程

紅細胞ATP含量與保存時間和保存溫度關系的擬合方程顯示，二元三次方程的AIC值最小。見表6。

3　討論

死亡時間常通過死后尸體現(xiàn)象、體液化學變化、直腸溫度、昆蟲學原理等方法進行分析推斷［4-6］。隨著DNA技術的發(fā)展，一些研究嘗試利用DNA降解和蛋白質降解規(guī)律推斷死亡時間［7-15］，但迄今為止，仍沒有一種方法已在法醫(yī)學實踐中得到廣泛應用。

表6　紅細胞ATP含量與保存時間和保存溫度關系的擬合方程

學者們很早就發(fā)現(xiàn)環(huán)境溫度對死亡時間推斷的明顯影響［16-20］，玻璃體液鉀離子濃度與死亡時間關系的研究，是近半個世紀以來法醫(yī)病理學者們一直研究的熱點。學者們選用不同的檢測方法和實驗對象，用所得實驗數(shù)據(jù)建立了各自的死亡時間與玻璃體液鉀離子濃度變化的回歸方程。但由于各自研究中的影響因素有差異，造成了直線回歸方程斜率和截距的不同。學者們提出用玻璃體液鉀離子濃度推斷死亡時間，應考慮尸溫因素。研究發(fā)現(xiàn)，在環(huán)境溫度為26～29℃時的回歸方程的直線斜率，要比環(huán)境溫度為13～17℃時的回歸方程的直線斜率大［16-20］。這就說明了環(huán)境溫度對玻璃體液中鉀離子濃度變化的影響。環(huán)境溫度越高，死后玻璃體液中鉀離子濃度上升的速度越快。

利用血液體外保存測定紅細胞ATP含量變化，證實紅細胞ATP含量的下降在一定溫度范圍內與保存時間線性相關，說明利用紅細胞ATP這一參數(shù)推斷PMI具有較好的應用情景；但同時也發(fā)現(xiàn)環(huán)境溫度對紅細胞ATP含量變化有較大影響，因此應進一步探討和建立環(huán)境溫度等對紅細胞ATP含量變化的影響模型［1］。張艷苓等［21］曾探討人離體肝組織胺類產生與死亡時間和環(huán)境溫度的關系。

至于如何判斷某回歸方程的應用價值，龔志強等［22］認為r2＞0.9的離子，其方程可用于PMI的推斷。但是劉茜等［23］認為評價方程不應僅考慮r2的值，還應該注意評價方程在推斷PMI時產生的預測偏離時間。筆者較為認同劉茜等［23］的觀點，根據(jù)法醫(yī)辦案經(jīng)驗，對死亡時間推斷其誤差應控制在2 h左右為佳，否則其實際應用意義將大打折扣。

實驗結果顯示，紅細胞ATP含量變化具有與死亡時間直線相關性，且相關性差異有統(tǒng)計學意義，因而這一參數(shù)可以用于死亡時間的推斷。r2從高到低依次為25℃、20℃、15℃和30℃組，但30℃組縮短時間決定系數(shù)明顯升高，筆者分析，30℃下紅細胞ATP下降過快，較快進入極低水平（平臺期），因此其適用范圍應在進入平臺期之前。而在較低溫度（15℃組）下ATP下降速度過于緩慢，在此情況下檢測相對誤差較大，很難保證結果的準確性。

以AIC值最小為標準，Z=2.689-0.009X-0.00006Y2X為最佳擬合方程（其中Z為紅細胞ATP含量，X為保存時間，Y為保存溫度）。該方程提示，紅細胞ATP含量與保存時間呈線性關系，而與保存溫度呈指數(shù)關系。當然，上述擬合方程還較為粗糙，不夠精細，通過進一步縮短檢驗間隔時間及擬合層次，將可以推倒出更為精確的擬合方程。

綜上所述，以偏離時間2 h左右為標準，根據(jù)表4、5的實驗結果，筆者認為，紅細胞ATP含量這一參數(shù)最佳適用溫度范圍為20～30℃，有效評估時間20℃為64 h，25℃為40 h，30℃為28 h，30℃以上進一步縮短，而15℃以下預測平均偏離時間較大，不宜采用此參數(shù)。

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Correlation of ATP content in RBCs with both postmortem intervals and temperature of surroundings

HAN Wei1，4▲YU Mingxin2▲TANG Hui3LI Changlan4HE Min4REN Suping4JIAO Zhangping3YU Qun4
1.Forensic Science Identification Institute，F(xiàn)engtai Sub-Bureau of Beijing Municipal Public Security Bureau，Beijing 100072，China；2.Beijing National Day School，Beijing100850，China；3.Forensic Inspection Appraisal Center，Beijing Municipal Public Security Bureau，Beijing100192，China；4.Institute of Field Operations Blood Transfusion，A-cademy of Military Medical Sciences，Beijing100850，China

Objective To estimate suitable temperature and time scales about postmortem interval（PMI）in early stage by calculating ATP of RBCs.Methods 40 mL blood collected from 12 healthy donors were stored at 15，20，25，30℃respectively.Technical parameter as ATP content in RBCs was tested every 4 hours using bioluminescence assay.By statistical analysis，the regression equations and deviations of time point were obtained.Results There was a large gap on mean time deviation among 4 groups.The mean time deviation was 4.80 h in the 15℃group，2.04 h in the 20℃，1.77 h in the 25℃and 5.71 h in the 30℃.Meanwhile，the mean time deviation was reduced from 5.71 h to 1.67 h over time in the 30℃group.Conclusion The best suitable temperature scale of ATP content in RBCs is during 20-30℃. Effective time scale is 64 h at 20℃，40 h at 25℃，28 h at 30℃.

Postmortem intervals；ATP content in RBCs；Temperature of surroundings

ea B，Henssg C，Honig W.

for determing the time of death by potassium in vitreous humor［J］. Forensic Sci Int，1989，40（3）：231-243.

R446.11

A

1673-7210（2015）12（b）-0008-04

2015-09-10本文編輯：程銘）

公安部應用創(chuàng)新計劃項目（2009YYCXBJSJ002）。▲并列第一作者

焦章平（1971-），男，主任法醫(yī)師；研究方向：法醫(yī)物證檢驗及研究。于群（1970-），男，研究員；研究方向：蛋白質修飾在疾病防治中的應用。