恒古骨傷愈合劑促進腰椎板開窗術后微小骨粒回植骨重建的實驗研究

陳振南　周忠　王萬明　黃少斌　郭劍　徐志成

1.福建中醫藥大學附屬漳州中醫院骨傷科，福建漳州363000；2.南京軍區福州總醫院骨二科，福建福州350025；3.福建中醫藥大學骨傷學院，福建福州350108

恒古骨傷愈合劑促進腰椎板開窗術后微小骨粒回植骨重建的實驗研究

陳振南1周忠2王萬明2黃少斌2郭劍3徐志成3

1.福建中醫藥大學附屬漳州中醫院骨傷科，福建漳州363000；2.南京軍區福州總醫院骨二科，福建福州350025；3.福建中醫藥大學骨傷學院，福建福州350108

目的探討恒古骨傷愈合劑促進兔腰椎板開窗處自體微小骨粒骨重建的療效及作用機制。方法選取清潔級健康雄性新西蘭大白兔22只，隨機分為3組，治療組（n=9）、對照組（n=9）、正常組（n=4）。治療組建立兔腰椎板開窗術后微小骨粒回植的模型，給予恒古骨傷愈合劑治療（按經由人與兔體表面積用藥量換算計算出的劑量，兔用藥量為1.30 mL/kg），灌胃，1次/2 d，服用3個月；對照組建立模型后，服用相同劑量的生理鹽水，正常組未進行手術處理，相同劑量的生理鹽水灌服，治療后4、8、12周分別行大體標本粘連組織觀察、羥脯氨酸（Hyp）測定、CT檢查及組織形態學觀察。結果大體觀察及組織學發現，治療組的粘連程度Rydell分級及組織學分級要遠低于對照組（P＜0.05）。羥脯氨酸濃度分析結果顯示治療組瘢痕組織中羥脯氨酸濃度要明顯低于對照組（P＜0.05）。CT檢查示術后12周治療組微小骨粒形成骨板與開窗椎板骨質相連、骨梁連續，無明顯界限，椎管形態及容積無明顯變化，未見脊髓受壓；對照組對照節段椎板缺損，少量瘢痕突入椎管內，椎管重建未完成。結論恒古骨傷愈合劑可有效促進兔椎板開窗處再植自體微小骨粒的骨重建，形成的骨板可遮擋瘢痕侵入椎管，減少椎管內粘連。

恒古骨傷愈合劑；椎板開窗術；回植；骨重建

經椎板開窗髓核摘除術曾被認為是腰椎間盤突出癥（lumbar disc herniation，LDH）手術的標準術式，盡管其在充分減壓情況下，最大程度保護椎板的完整性，但仍引起椎管內粘連等并發癥。將腰椎椎板開窗術中要廢棄的椎板微小骨粒，通過適當干預促進其在骨窗處的骨重建形成骨性骨板遮擋硬膜外粘連是本課題的研究重點。恒古骨傷愈合劑作為促進骨折愈合的口服制劑，在四肢骨折愈合及減輕股骨頭壞死上療效顯著。然而在脊柱骨重建方面未見報道，本研究通過建立兔椎板開窗術后微小骨粒回植模型的實驗研究，探討恒古骨傷愈合劑對微小骨粒回植于椎板開窗處骨重建的療效及作用機制，為臨床提供實驗依據。

1　材料與方法

1.1材料與動物

1.1.1藥物與試劑恒古骨傷愈合劑（規格：25 mL/瓶，云南克雷斯天然藥物制藥廠；生產批號：Z20025103），醫用膠原蛋白海綿［無錫貝迪生物工程有限公司；國食藥監（準）字：2006第3640727號］，羥脯氨酸含量測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.1.2實驗動物3月齡清潔級健康雄性新西蘭大白兔22只，體重2.2～2.5 kg［購自上海市松花江區松聯實驗動物飼養場；合格證號：SYXK（滬）2012—0011］。所有動物按照標準進行管理，采用標準飼料喂養，造模于南京軍區福州總醫院比較醫學科動物實驗室，實驗后處置兔子符合倫理學標準。

1.2方法

1.2.1實驗分組清潔級健康雄性新西蘭大白兔22只，隨機分為3組，治療組（n=9）、對照組（n=9）、正常組（n=4）。治療組：建立兔椎板開窗術后微小骨粒回植的模型，給予恒古骨傷愈合劑治療，1次/2 d，服用3個月；對照組：建立模型后，服用相同劑量的生理鹽水；正常組：未進行手術處理，相同劑量的生理鹽水灌服。

1.2.2動物造模新西蘭大白兔術前腰背部術野備皮，范圍在12 cm×20 cm左右，實驗動物用3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）耳緣靜脈注射全麻，并術前半小時常規給予頭孢唑林鈉（50 mg/kg）肌內注射，預防感染。將兔子俯臥并置于特制的固定架上，手術野去毛，記號筆定位L5、L6，用碘伏消毒后，進行鋪巾，以L5棘突為中心，切開皮膚及筋膜約2 cm，銳性分離骶棘肌，充分顯露左側L5椎板，暴露出L5椎板“卵圓形”的小口，用微型小槍鉗慢慢咬去椎板、黃韌帶，然后沿著椎板邊沿向上咬開椎板，進行開窗術，暴露約0.8 cm×0.3 cm大小骨窗，將開窗咬下的碎骨粒剪碎，然后將碎骨粒鑲嵌于醫用膠原蛋白海綿，塑成拱橋形，放置于硬膜外開窗處，縫合切口，術后用碘伏消毒切口，回籠飼養。

1.3觀察指標

1.3.1大體標本粘連性狀觀察觀察各組椎板開窗位置周圍組織與硬脊膜的關系及瘢痕生成情況。大體粘連情況評分系統采用Rydell標準［1］，由兩位經驗豐富的病理科醫師盲法、獨立對實驗節段大體粘連分級進行評估，綜合結果。

1.3.2羥脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）測定切取椎板開窗位置水平相應部位硬脊膜背側大小為1 cm×1 cm×1 cm硬膜外組織，將其漂洗干凈，吸干水分后稱重100 mg放入試管中，剪碎，準確加入水解液1 mL，混勻。羥脯氨酸含量測定過程嚴格按南京建成生工試劑盒說明書操作。

1.3.3影像學檢查術后各組于在術后4、8、12周進行手術區域脊柱標本CT掃描，同時進行椎管矢狀徑測量。由兩位經驗豐富的影像科技師盲法、獨立對兔腰椎實驗節段矢狀徑大小進行測量，綜合結果。

1.3.4組織學觀察進行大體觀察后，切取兔腰5椎體節段連同硬膜外組織標本，用中性福爾馬林固定2 d，用10%硝酸脫鈣48 h，然后進行標本脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、染色，每段橫切片4張，厚約3 mm，行HE染色，普通光鏡觀察瘢痕組織在硬膜外的分布及粘連的程度，評級標準參考文獻［2］，同時觀察微小骨粒骨重建情況。

1.4統計學方法

采用SPSS 18.0統計軟件對數據處理分析，Rydell分級及組織學分級比較采用非參數秩和檢驗，矢狀徑及羥脯氨酸測定數據采用均值±標準差（x±s）表示。方差齊性時，組別及時間整體分析采用兩因素重復測量方差分析，組內時間影響整體分析采用單因素方差分析，各時間點兩兩比較采用差值t檢驗，方差未齊性時，考慮非參數秩和檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1粘連組織觀察

對兔腰5椎體手術節段取材，采用大體觀察及光鏡觀察硬脊膜與硬膜外瘢痕組織的粘連情況，由福州總院病理科協助盲法肉眼觀察。治療組與對照組術后Rydell分級、組織學分級，與正常組比較，差異有統計學意義（P＜0.01），表明腰椎開窗手術硬膜外粘連加重，造模成功。治療組與對照組兩組術后Rydell分級、組織學分級比較差異有統計學意義（P＜0.05），表明治療組服用恒古骨傷愈合劑可有效減輕瘢痕形成及硬膜外粘連程度。見表1。

表1　三組兔椎板硬膜外粘連組織Rydell分級及組織學分級（只）

2.2羥脯氨酸的測定

治療組與對照組新西蘭大白兔的羥脯氨酸（Hyp）含量比較，術后4、8、12周兩組間Hyp含量比較，治療組硬膜外粘連程度明顯較對照組減輕（P＜0.05）。見表2。

表2　硬膜外瘢痕組織中Hyp的含量比較（μg/mg，x±s）

2.3影像學比較

2.3.1椎管矢狀徑比較治療組與對照組椎管矢狀徑大小比較，術后4周兩組間矢狀徑大小比較差異無統計學意義（P＞0.05），術后8、12周兩組間矢狀徑比較，治療組椎管矢狀徑較對照組增寬（P＜0.05）。見表3。

表3　兩組實驗節段不同時間段椎管矢狀徑的變化（mm，x±s）

2.3.2微小骨粒回植區CT表現術后4、8、12周CT顯示治療組實驗節段微小骨粒位置保持良好，開窗處碎骨粒愈合良好，形成骨性擋板，椎管形態及容積無變化；對照組對照節段開窗位置微小骨粒逐漸部分吸收，可見局部缺損，椎管外瘢痕少量侵入椎管內壓迫脊髓，椎管未完成重建。見圖1。

2.3.3回植區粘連組織及骨組織學觀察術后4周，可見治療組硬脊膜與瘢痕組織因微小骨粒的遮擋有明顯的界限，可見少量成纖維細胞及脂肪組織充滿間隙，同時見大量新生的編織骨；對照組硬脊膜與瘢痕組織粘連也不明顯，硬膜囊無變形，間隙有較多的成纖維細胞；術后8周，治療組硬脊膜與瘢痕組織之間仍稍有間隙，成纖維細胞與纖維細胞混雜，數量中等（圖2a）；對照組瘢痕組織與硬膜部分區域粘連緊密，硬膜囊受壓稍變形（圖2b）；正常組椎板外肌肉正常（圖2c）。治療組微小骨粒之間連接緊密，微小骨粒與椎板咬除緣之間有多量新生骨小梁生成，形成完整的骨板，結構較薄（圖2d）；對照組椎板開窗位置微小骨粒直接連接較少，且有局部吸收現象，周圍摻雜纖維組織（圖2e）；而正常組椎板結構正常，可見正常的骨陷窩及骨小梁（圖2f）。術后12周治療組瘢痕組織與硬膜部分被形成的骨板遮擋，周圍成纖維細胞與纖維細胞數量中等，硬膜囊未受壓變形，微小骨粒形成的骨板逐漸增厚。對照組瘢痕組織與硬膜部分區域粘連緊密，并沿開窗位置向椎管內延伸，程度不等。椎板再生緩慢，微小骨粒部分殘留，一側與開窗部位的骨板連接，但是另一側游離，形成不完整的椎板，周圍與纖維組織包繞，少量瘢痕組織長入椎管，椎管稍狹窄。

圖1　治療組與對照組在術后4、8、12周CT掃描結果

圖2　各組8周后椎板開窗位置肌肉組織及骨組織鏡下觀察情況（HE，100×）

3　討論

3.1椎板開窗術微小骨粒回植預防硬膜外粘連理論基礎

參照已報道的椎板切除術預防硬膜外粘連的研究中，絕大部分是以全椎板切除為模型，應用較多的是采用膜性材料（自體或人工）阻隔硬脊膜和瘢痕組織的空隙或者依據“三維立體學說”輔助半流體物質包繞神經根，主要作用在于硬膜后方設置屏障阻擋來自后方粘連組織壓迫與侵入，從而減輕硬膜外粘連程度。在置于硬膜外表面的生物性和非生物性惰性材料中主要包括人體筋膜、皮膚、脂肪顆粒、纖維蛋白凝膠、膨體聚四氟乙烯、ADCONL、聚乙交酯、幾丁糖、人工骨等，此外中醫藥制劑也在運用，如丹參透明質酸凝膠混合物、當歸注射液等，但每種材料均存在各自不足。研究發現自體骨回植不僅經濟，而且效果滿意［3-9］。

本實驗根據自體微小顆粒骨的成骨是以眾多顆粒骨為中心的多點同時成骨，即骨傳導作用成骨，骨生成作用成骨，骨誘導作用成骨，因此成骨較快。依托醫用膠原蛋白海綿的良好支架作用，并經過一段時間可生物降解，有利于微小骨粒的成骨；另外椎板切除后本身還具有一定再生作用，因此通過微小骨粒回植在椎板開窗處較小的缺損區域，能達到骨重建，重新形成硬脊膜后方骨性屏障，遮擋粘連。治療組與對照組術后4周兩組間矢狀徑大小比較差異無統計學意義（P＞0.05），術后8、12周兩組間矢狀徑比較差異有統計學意義（P＜0.05），治療組椎管矢狀徑較對照組增寬，即治療組術后8、12周的矢狀徑分別為（6.17± 0.13）、（6.16±0.05）mm，均較正常組［（6.01±0.06）mm］大，表明治療組術后未造成椎管狹窄，對馬尾神經沒有急性壓迫和損害。因此在腰椎開窗位置進行微小骨粒回植不僅有利于骨重建，而且不會造成椎管內狹窄，操作安全、簡單。

3.2恒古骨傷愈合劑在預防硬膜外粘連中的療效評估

硬膜外瘢痕形成盡管作為正常組織的修復過程，但是其粘連程度及粘連位置對于腰椎術后療效評估影響很大，甚至可以造成醫源性椎管狹窄，包繞神經根或硬脊膜導致神經的正常電生理過程發生障礙，因此硬膜外瘢痕的形成是術后癥狀無改善及手術失敗的重要原因。本實驗的組織學觀察表明，通過Rydell分級、組織學觀察表明，A、B兩組術后Rydell分級、組織學分級，與正常組比較，差異有高度統計學意義（P＜0.01），表明腰椎開窗手術硬膜外粘連加重，造模成功。A、B兩組術后Rydell分級、組織學分級比較差異有高度統計學意義（P＜0.01），表明治療組服用恒古骨傷愈合劑可有效減輕瘢痕和硬膜粘連的緊密程度。

實驗中羥脯氨酸測量作為衡量瘢痕膠原組織含量的重要指標，主要基于羥脯氨酸在膠原氨基酸總量的比重，其約占膠原氨基酸總量的13.4%，排除彈性蛋白含少量羥脯氨酸外，其余均不含羥脯氨酸。因此可把瘢痕組織中羥脯氨酸含量測定進行粘連程度的比較。治療組與對照組術后4、8、12周的Hyp含量比較，治療組硬膜外粘連Hyp含量明顯較對照組低（P＜0.05）。通過組織學觀察和生化測量發現治療組服用恒古骨傷愈合劑后其硬膜外粘連組織中膠原含量減少并且瘢痕結構相對疏松，可能通過抑制瘢痕組織中成纖維細胞的增殖，達到減輕瘢痕的過程。

盡管實驗發現恒古骨傷愈合劑在防止粘連上有一定的作用，但其作用機制目前仍不明確，是恒古骨傷愈合劑的直接作用導致硬膜外粘連組織的形成受到有效抑制，還是通過碎骨粒形成的骨板而發揮作用，抑或是兩者聯合作用，在實驗和臨床上還需要進一步探索。

3.3恒古骨傷愈合劑在微小骨粒重建的作用

中醫在骨重建方面認為是一個“瘀去、新生、骨合”的過程，因此早期活血化瘀，中期接骨續筋，后期補肝腎是傷科三期辨證體系的表現。恒古骨傷愈合劑由紅花、三七、杜仲、人參、黃芪等配制而成，在益氣活血過程中兼顧補肝腎、強筋骨等扶正治法，實驗中治療組服用恒古骨傷愈合劑后4～12周微小骨粒形成的骨板逐漸增厚，骨密度增高，與對照組比較差異有統計學意義。現代藥理研究表明紅花作為銅、鋅的含量較高的活血藥，不僅可以促進骨折部位血管組織的修復，而且加強銅、鋅元素參與骨折修復過程，提高骨折的愈合率［10］。三七因其有效的活血功能，在微循環中發揮積極作用，可以有效降低全血黏度，不僅利于藥物的吸收，同時加速血腫機化與纖維化，縮短骨痂形成時間［11］。劉豫蓉等［12］通過體外實驗評估黃芪作用中發現，成骨細胞在適宜濃度的黃芪多糖水溶液中可以再生活躍，而且在短期內取得明顯的效果。研究表明杜仲提取的總黃酮在分子水平上刺激骨髓間充質干細胞向成骨方向轉化，能明顯促進成骨細胞的增殖、分化，促進骨折的愈合。因此恒古骨傷愈合劑不管從中醫角度，還是現代藥理學研究都表明了其在骨折愈合率、骨折愈合時間上有明顯優勢［13-17］。

恒古骨傷愈合劑促進微小骨粒骨重建作用機制，可能如下：①活血化瘀方面療效顯著，可有效改善局部微循環，促進椎板開窗缺損處血腫機化，形成纖維骨痂。②調節鈣鹽在微小骨粒的沉積率，縮短骨痂形成時間并提高骨痂質量。③調節骨生長因子，促進骨形態發生蛋白合成。

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Experimental study of Osteoking on bone reconstruction after lumbar laminectomy and bone grains replantation surgery

CHEN Zhennan1ZHOU Zhong2WANG Wanming2HUANG Shaobin2GUO Jian3XU Zhicheng3
1.Department of Orthopedics，Zhangzhou Hosptial of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fujian Province，Zhangzhou363000，China；2.Second Department of Orthopedics，Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Region，Fujian Province，Fuzhou350025，China；3.School of Osteopathy，Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fujian Province，Fuzhou350108，China

Objective To explore the therapeutic effect and mechanism of Osteoking on bone reconstruction by observing the experimental research of Osteoking on bone reconstruction after lumbar laminectomy and bone grains replantation surgery in rabbits.Methods 22 healthy male New Zealand rabbits were selected and randomly divided into 3 groups，treatment group（n=9），model group（n=9）and normal group（n=4）.Treatment group and model group were performed with lumbar laminectomy and bone grains replantation surgery.Osteoking was offered to treatment group and normal saline（NS）at the same dose was offered to model group after modeling（according to the surface area of human to rabbits，the rabbits were treated with 1.30 mL/kg，1 time/2 d，3 months）.No surgery procedure was offered to normal group but same dose of NS.Observation of adhered tissue and morphological changes，determination of hydroxyproline（Hyp）as well as CT scan were performed after 4，8 and 12 weeks'treatment.Results Though the gross observation and histological observation，the results of treatment group which Rydell and organization classification were far lower than those of model group（P＜0.05）.Expression of Hyp showed that the treatment group had the lower epidural adhesion compared with the normal group（P＜0.05）.After 12 weeks of surgery，CT examination showed the bone plate which formed by bone grain in treatment group was connected with the vertebral bone，which canal morphology and volume had no obvious change，and no spinal cord compression；model group showed segment lamina defect which a small scar protruded into the spinal canal，and the vertebral canal reconstruction was not complete.Conclusion Osteoking can effectively promote bone reconstruction in the lamina of rabbits，and the bone plate can prevent scar from expanding into the spinal canal，and can reduce the intraspinal conglutination.

Osteoking；Laminectomy；Replantation；Bone reconstruction

R274.9

A

1673-7210（2015）12（b）-0012-05

2015-08-26本文編輯：趙魯楓）

福建省科技廳重點項目（2012Y5005）。

周忠（1968.6-），副教授，碩士生導師；研究方向：脊柱與四肢。