三黃片對糖尿病大鼠胸主動脈細胞間黏附分子-1及血管細胞間黏附分子-1表達的影響

田風勝　王佟　王霞　崔榮崗　李娟　李華君

1.河北醫科大學附屬滄州中西醫結合臨床醫學院內分泌科，河北滄州061001；2.河北醫科大學附屬滄州中西醫結合臨床醫學院心血管內科，河北滄州061001；3.河北省滄州高等醫學專科學校，河北滄州061001

三黃片對糖尿病大鼠胸主動脈細胞間黏附分子-1及血管細胞間黏附分子-1表達的影響

田風勝1王佟2王霞3崔榮崗1李娟1李華君1

1.河北醫科大學附屬滄州中西醫結合臨床醫學院內分泌科，河北滄州061001；2.河北醫科大學附屬滄州中西醫結合臨床醫學院心血管內科，河北滄州061001；3.河北省滄州高等醫學專科學校，河北滄州061001

目的探討三黃片對糖尿病大鼠胸主動脈細胞間黏附分子-1（ICAM-1）及血管細胞間黏附分子-1（VCAM-1）表達的影響。方法根據隨機數字表法，將所有大鼠分為正常組10只，造模組30只。從造模組中隨機選取糖尿病大鼠，分為模型對照組10只及三黃片組10只。模型對照組及正常組給予生理鹽水灌胃，三黃片組給予三黃片研末灌胃。給藥8周后，模型對照組及三黃片組各死亡大鼠1只，最終兩組各9只大鼠。測定血糖、血脂、血漿內皮素-1（ET-1）、一氧化氮（NO）水平。采用SP免疫組化染色法觀察胸主動脈病理切片ICAM-1及VCAM-1的陽性表達。結果模型對照組及三黃片組給藥前、給藥后的血糖水平高于正常組（P＜0.05），但模型對照組與三黃片組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。模型對照組及三黃片組三酰甘油高于正常組（P＜0.05），但模型對照組與三黃片組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。模型對照組及三黃片組ET-1水平較正常組升高（P＜0.05），三黃片組ET-1水平較模型對照組下降（P＜0.05）。模型對照組及三黃片組NO水平較正常組降低（P＜0.05），三黃片組NO水平較模型對照組升高（P＜0.05）。模型對照組及三黃片組ICAM-1及VCAM-1陽性表達明顯高于正常組（P＜0.01），三黃片組ICAM-1及VCAM-1陽性表達明顯低于模型對照組（P＜0.01）。結論三黃片能抑制糖尿病大鼠ET-1的升高及NO的降低，且能抑制ICAM-1及VCAM-1的表達。

三黃片；糖尿病；細胞間黏附分子-1；血管細胞間黏附分子-1

糖尿病血管病變最基本的病理改變就是動脈硬化，是糖尿病的慢性并發癥之一，包括大血管病變和微血管病變，是糖尿病患者致殘、致死的最主要原因。血管內皮功能的損傷是動脈硬化的早期表現。動脈硬化是一種炎癥疾病。糖尿病患者呈低度炎癥狀態，包括超敏C反應蛋白、腫瘤壞死因子-α及一些細胞因子的過度表達。研究表明，細胞間黏附分子-1（ICAM-1）及血管細胞間黏附分子-1（VCAM-1）的過度表達參與動脈粥樣硬化形成的發生和發展［1］。本研究主要觀察三黃片對糖尿病大鼠血管內皮的影響。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

6周齡，雄性清潔級SD大鼠40只，平均體重（220±20）g，購于河北醫科大學實驗動物中心（合格證號：1405034）。鏈脲佐菌素（STZ）、檸檬酸鈉：美國Sigma公司；內皮素-1（ET-1）及一氧化氮（NO）試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司；兔抗鼠多克隆ICAM-1（貨號：PB0054）及VCAM-1抗體（貨號：BA3840）：武漢博士德公司；血糖儀（羅康全活力型）：德國羅氏公司；日立7600-010全自動生化分析儀：日本日立公司；多功能真彩色細胞圖像分析管理：美國Media Cybernetics公司。

1.2方法

1.2.1動物模型建立適應性飼養1周，隨機抽取30只按文獻［2-3］方法略作改進，一次性腹腔注射STZ 60 mg/kg，72 h后尾靜脈取血，測血糖≥16.7 mmol/L，血糖平穩1周后，確定為糖尿病大鼠。剩余10只大鼠設為正常組，腹腔注射等量的檸檬酸鈉緩沖液。

1.2.2分組與給藥糖尿病大鼠隨機抽分為模型對照組10只及三黃片組（哈藥集團三精制藥有限公司）10只，其余棄去不用。實驗期間大鼠自由進食水，喂食標準飼料，每天更換墊料。三黃片組給予生藥10 g/kg體重灌胃，三黃片每天臨時配制，其余兩組每日給予同等劑量生理鹽水灌胃。

1.2.3采血與血管免疫組化持續給藥8周后，隔夜禁食12 h，不禁水。以3%戊巴比妥（80 mg/kg）腹腔注射麻醉，腹主動脈采血測定血脂、NO及ET-1。同時留取胸主動脈，制備病理切片，SP免疫組化染色，應用圖像分析軟件分析大鼠胸主動脈組織中ICAM-1及VCAM-1陽性表達。

1.3統計學方法

采用SPSS 13.0統計軟件對數據進行分析和處理，計量資料以均數±標準差表示，自身前后對照比較采用配對t檢驗，多組間比較采用方差分析，組間多重比較采用Dunnett′s t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

模型對照組1只死于繼發性腹部感染（可能為腹部注射STZ導致），三黃片組死亡1只，死因不詳。

2.1三組給藥前后血糖水平比較

三組給藥前后血糖水平分別比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；模型對照組及三黃片組給藥前、給藥后的血糖水平高于正常組（P＜0.05），但模型對照組與三黃片組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1　三組給藥前后血糖水平比較（mmol/L

表1　三組給藥前后血糖水平比較（mmol/L

注：與正常組比較，*P＜0.05

組別給藥前給藥后正常組（n=10）模型對照組（n=9）三黃片組（n=9）5.98±1.05 21.22±3.61*21.06±2.21*6.08±1.28 22.10±4.09*21.39±2.86*

2.2三組血脂水平比較

三組總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇及低密度脂蛋白膽固醇組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）；模型對照組及三黃片組三酰甘油高于正常組（P＜0.05），但模型對照組與三黃片組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2　三組血脂水平比較（mmol/L

表2　三組血脂水平比較（mmol/L

注：與正常組比較，*P＜0.05

組別總膽固醇三酰甘油高密度脂蛋白膽固醇低密度脂蛋白膽固醇正常組（n=10）模型對照組（n=9）三黃片組（n=9）2.23±0.24 2.34±0.29 2.22±0.22 0.36±0.09 0.99±0.27*0.91±0.29*1.24±0.20 1.19±0.13 1.28±0.21 0.41±0.07 0.46±0.10 0.39±0.09

2.3三組ET-1及NO水平比較

模型對照組及三黃片組ET-1水平較正常組升高（P＜0.05），三黃片組ET-1水平較模型對照組下降（P＜0.05）；模型對照組及三黃片組NO水平較正常組降低（P＜0.05），三黃片組NO水平較模型對照組升高（P＜0.05）。見表3。

表3　三組ET-1及NO水平比較（mmol/L，x±s）

2.4三組ICAM-1及VCAM-1比較

模型對照組及三黃片組ICAM-1及VCAM-1陽性表達明顯高于正常組（P＜0.01），三黃片組ICAM-1及VCAM-1陽性表達明顯低于模型對照組（P＜0.01）。見表4。正常組可見少量ICAM-1（棕黃色顆粒樣）表達（圖1A），模型對照組及三黃片組可見大量的ICAM-1表達（圖1B、1C）；正常組可見少量VCAM-1（棕黃色顆粒樣）表達（圖2A），模型對照組及三黃片組可見大量的VCAM-1表達（圖2B、2C）。

表4　三組ICAM-1及VCAM-1陽性表達情況比較（%，

表4　三組ICAM-1及VCAM-1陽性表達情況比較（%，

注：與正常組比較，*P＜0.01；與模型對照組比較，▲P＜0.01；ICAM-1：細胞間黏附分子-1；VCAM-1：血管細胞間黏附分子-1

組別ICAM-1VCAM-1正常組（n=10）模型對照組（n=9）三黃片組（n=9）4.61±2.54 34.91±10.00*23.44±5.38*▲8.75±3.86 35.97±8.90*23.74±7.88*▲

圖1　胸主動脈ICAM-1表達（SP法，400×）

圖2　胸主動脈VCAM-1表達（SP法，400×）

3　討論

糖尿病合并血管病變早期特征即動脈粥樣硬化，糖尿病動脈硬化是糖尿病大多數慢性并發癥的共同病理基礎，血管內皮細胞功能的受損是動脈硬化的啟動因素。高血糖導致氧化應激的增加及一些炎性因子的過度激活，使血管內皮功能紊亂，導致ET-1分泌增加及NO分泌減少，進而引起血流動力學紊亂，血流動力學失衡又會加重血管內皮損傷，其損傷是糖尿病動脈硬化的共同病理表現及重要原因［4-5］。慢性炎癥是動脈粥樣硬化形成與進展的重要的獨立危險因素［6］，多種炎性因子如C反應蛋白、白細胞介素-6、腫瘤壞死因子-α等介導的炎性反應與2型糖尿病血管并發癥的關系密切，在糖尿病血管病變的發病機制中發揮重要作用。大量證據顯示，炎癥導致細胞黏附分子異常、白細胞附壁等，最終引發內皮細胞功能異常，甚至凋亡。ICAM-1及VCAM-1屬于免疫球蛋白超家族成員，主要表達于血管內皮細胞、淋巴細胞、單核細胞等。VCAM-1可引起表面效應細胞活化，免疫反應被啟動，介導淋巴細胞等與血管內皮細胞黏附，損傷血管內皮，導致血管功能障礙［7］。研究表明，動脈硬化的發生和發展與VCAM-1等黏附因子的過度表達相關［8］。鄭永強等［9］研究表明，抑制ICAM-1及VCAM-1的表達，可以防治糖尿病性動脈粥樣硬化。

三黃片的主要成分為大黃、黃芩、鹽酸小檗堿，有較多研究表明，其組分具有抑制炎性因子表達的作用。研究表明，大黃具有降低大鼠ET-1及升高NO的作用，能夠保護糖尿病大鼠內皮依賴的血管舒張功能，且能抑制ICAM-1及VCAM-1的表達，具有抗動脈硬化作用［10］。小檗堿能降低腎臟血管內皮生長因子的表達，并能改善糖尿病腎病大鼠發病過程中的生化指標和腎臟病理損傷［11］；小檗堿可減少白細胞介素-6及腫瘤壞死因子-α的分泌，減輕內脂素誘導的人臍靜脈內皮細胞損傷［12］；陶婷婷等［13］研究表明，在高胰島素條件下，人臍靜脈內皮細胞分泌前列環素2（PGI2）減少、ET-1增多；0.50、5.00 g/mL的小檗堿可提高人臍靜脈內皮細胞對PGI2的分泌水平，減少ET-1的分泌，呈反向調節作用；朱凌波等［14］研究表明，小檗堿可顯著降低高脂飲食兔血清總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇水平，顯著降低血清氧化低密度脂蛋白、脂蛋白相關磷脂酶A2、單核細胞趨化蛋白-1、基質金屬蛋白酶-9水平，升高血清基質金屬蛋白酶抑制物-1水平，可顯著改善動脈硬化病變程度及穩定斑塊，其機制可能與小檗堿能顯著降低血清各項炎癥標志物水平等作用有關。李淼等［15］發現，三黃方及方中大黃、黃芩、黃柏在濃度范圍100～1.5625 mg/L對小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞無顯著毒性，三黃方通過抑制細胞因子NO、白細胞介素-1β、前列腺素E2、腫瘤壞死因子-1α釋放發揮其抗炎作用。

盧聰等［16］研究表明，大黃素抑制血管平滑肌細胞增殖。大黃酸能改善過氧化氫（H2O2）誘導損傷的血管內皮細胞形態，促進其增殖，抑制其凋亡，提升NO、一氧化氮合酶（NOS）的含量和超氧化物歧化酶（SOD）的活力，對血管內皮細胞有一定的保護作用［17］；大黃酸能抑制白細胞介素-6誘導的血管平滑肌的促增殖作用和表型轉換，可能與調節基質金屬蛋白酶-3/基質金屬蛋白酶抑制劑1比值及增殖細胞核抗原的表達［18］。景浩然等［19］研究表明，大黃酚可以在不影響小膠質細胞的細胞活性情況下，顯著抑制內毒素（LPS）誘導的小膠質細胞炎性因子NO、腫瘤壞死因子-α的表達。李巖等［20］研究表明，黃芩苷能減少炎性因子腫瘤壞死因子-α的過度表達，其作用機制可能與黃芩苷抑制LPS引起的巨噬細胞CD36表達有關，從抗炎角度初步探討了黃芩苷抗動脈粥樣硬化的作用機制。黃芩苷還可能部分通過上調NOS活性，增加NO含量，從而實現抑制血管平滑肌細胞增殖的作用［21］。

本研究結果顯示，復方清熱類中藥三黃片對糖尿病大鼠血糖及血脂無影響。三黃片具有明顯抑制ET-1升高、抑制NO降低的作用，但不能到達正常水平，推斷其對血管內皮具有保護作用。糖尿病大鼠胸主動脈ICAM-1及VCAM-1表達上調，表明其在糖尿病血管病變的發生、發展中起作用，而三黃片可以明顯抑制血管ICAM-1及VCAM-1的表達。本研究發現，三黃片具有改善血管內皮功能，同時抑制糖尿病大鼠早期ICAM-1及VCAM-1的過度表達，具有防治糖尿病血管病變的作用。

綜上所述，三黃片對糖尿病大鼠血糖、血脂沒有影響，其對糖尿病血管的保護作用不是通過降低血糖實現，可能是通過多環節、多靶點實現。

［1］Fang L，Wei H，Mak KH，et al.Marker of low-grade inflammation and soluble cell adhension molecules in Chinese patients with coronary artery disease［J］.Can J Cardiol，2004，20（14）：1433-1438.

［2］張均.現代藥理實驗方法學［M］.北京：北京醫科大學中國協和醫科大學聯合出版社，1998：981.

［3］于德民，吳銳，尹濰，等.實驗性鏈脲佐菌素動物模型的研究［J］.中國糖尿病雜志，1995，3（2）：105-109.

［4］Porta M，La Selva M，Molinatti P，et al.Endothelial cell function in diabetic microangiopathy［J］.Diabetalogia，1987，30（8）：601-609.

［5］金紹禮，王怡.噻唑烷二酮類藥物治療對2型糖尿病患者血管內皮功能影響［J］.中國現代醫生，2014，52（13）：45-47.

［6］Natali A，Toschi E，Baldeweg S，et al.Clustering of insulin resistance with vascular dysfunction and low-grade inflammation in type 2 diabetes［J］.Diabetes，2006，55（4）：1133-1140.

［7］張麗慧，魏爾清.ICAM-1，VCAM-1在腦缺血損傷炎癥機制中的作用及調控［J］.中國藥理學通報，2005，21（11）：1281-1285.

［8］張繼紅，馬存根.糖尿病患者血管病變與血清可溶性黏附分子間的關系［J］.臨床和實驗醫學雜志，2007，6（9）：91-92.

［9］鄭永強，土卓.蕎麥黃酮復方制劑對2型糖尿病大鼠心血管病變的保護作用［J］.時珍國醫國藥，2012，23（4）：868-870.

［10］田風勝，李振彬，王元松.大黃對糖尿病大鼠血管病變保護機制的研究［J］.中國中藥雜志，2008，33（6）：672-675.

［11］倪偉建，丁海華，唐麗琴.小檗堿對糖尿病腎病大鼠腎組織VEGF表達的影響［J］.中國藥理學通報，2015，31（6）：795-800.

［12］萬強，周鳳華，崔小冰.小檗堿通過JNK通路降低內臟脂肪素誘導人臍靜脈內皮細胞分泌IL-6和TNF-α的研究［J］.中草藥，2015，46（7）：1012-1017.

［13］陶婷婷，梁國強.小檗堿對高胰島素下內皮細胞前列環素、內皮素分泌水平的影響［J］.山東醫藥，2014，54（2）：35-36.［14］朱凌波，張鵬程，洪小蘇.小檗堿抗兔動脈粥樣硬化的實驗研究［J］.安徽醫藥，2013，17（11）：1849-1852.

［15］李淼，尹華，張成龍.三黃方對LPS誘導RAW264.7炎癥因子分泌的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2013，19（23）：213-215.

［16］盧聰，陳玉成，曾智.大黃素抑制血管平滑肌細胞增殖的研究進展［J］.中國中藥雜志，2012，14（4）：417-420.

［17］趙鳳鳴，方泰惠，土明艷.大黃酸對過氧化氫誘導損傷的血管內皮細胞的保護作用［J］.中藥藥理與臨床，2011，2（2）：45-48.

［18］周媛媛，沈捷，馬向華.大黃酸對IL-6誘導的血管平滑肌細胞增殖及PCNA，MMP-3/TIMP-1 mRNA的影響［J］.江蘇醫藥，2010，36（20）：2438-2440.

［19］景浩然，楊紅云，王少峽，等.大黃酚對LPS誘導小膠質細胞炎性因子分泌的影響［J］.天津中醫藥大學學報，2013，32（3）：148-150.

［20］李巖，孫冬梅，萬幸，等.黃芩苷對小鼠巨噬細胞CD36表達及腫瘤壞死因子-α分泌的影響［J］.廣州中醫藥大學學報，2013，3（1）：55-59.

［21］陳曜曜，紀相福，牛培廣，等.NO介導黃芩苷抑制血管平滑肌細胞增殖的作用［J］.海峽藥學，2013，25（8）：180-184.

Influence of Sanhuang Tablets on intercellular adhesion molecule-1 and vascular cell adhesion molecule-1 expression of thoracic aorta in diabetes mellitus rats

TIAN Fengsheng1WANG Tong2WANG Xia3CUI Ronggang1LI Juan1LI Huajun1
1.Department of Endocrinology，Affiliated Cangzhou Integrated Chinese and Western Medicine Clinical Medical School of Hebei Medical University，Hebei Province，Cangzhou061001，China；2.Department of Cardiology，Affiliated Cangzhou Integrated Chinese and Western Medicine Clinical Medical School of Hebei Medical University，Hebei Province，Cangzhou061001，China；3.Cangzhou Medical College of Hebei Provence，Hebei Province，Cangzhou 061001，China

Objective To explore influence of Sanhuang Tablets on intercellular adhesion molecule-1（ICAM-1）and vascular cell adhesion molecule-1（VCAM-1）expression of thoracic aorta in diabetes mellitus rats.Methods According to method of random number table，all rats were divided into normal group（n=10）and making model group（n=30）.DM rats randomly selected from making model group were divided into model control group（n=10）and Sanhuang Tablets group（n=10）.Model control group and normal group were given normal saline lavage，Sanhuang Tablets group was given Sanhuang Tablets lavage.After 8 weeks of administration，model control group and Sanhuang Tablets group was dead one rat respectively，the final two groups of 9 rats.Blood sugar，blood lipids，endothelin-1（ET-1），nitric oxide（NO）levels were detected.ICAM-1 and VCAM-1 expression of thoracic aortic pathology were observed by using SP immunohistochemical staining.Results Before and after administration，blood glucose levels of model control group and Sanhuang Tablets group were higher than those of normal group（P＜0.05），there was no statistical difference between model control group and Sanhuang Tablets group（P＞0.05）.Triglyceride levels of model control group and Sanhuang Tablets group were higher than those of normal group（P＜0.05），there was no statistical difference between model control group and Sanhuang Tablets group（P＞0.05）.ET-1 levels of model control group and Sanhuang Tabletsgroup were higher than those of normal group（P＜0.05），ET-1 level of Sanhuang Tablets group was lower than that of model control group（P＜0.05）.NO levels of model control group and Sanhuang Tablets group were lower than those of normal group（P＜0.05），NO level of Sanhuang Tablets group was higher than that of model control group（P＜0.05）. Positive expression of ICAM-1 and VCAM-1 in model control group and Sanhuang Tablets group were significantly higher than those in normal group（P＜0.01）.Positive expression of ICAM-1 and VCAM-1 in Sanhuang Tablets group were significantly lower than those in model control group（P＜0.01）.Conclusion Sanhuang Tablets can inhibit increase of ET-1 and decrease of NO in diabetic rats，and it can inhibit the expression of VCAM-1 and ICAM-1.

Sanhuang Tablets；Diabetes；Intercellular adhesion molecule-1；Vascular cell adhesion molecule-1

R-332

A

1673-7210（2015）12（b）-0016-05

2015-08-17本文編輯：李亞聰）

河北省滄州市科學技術研究與發展指導計劃項目（09ZD284）。