CD44V6在結腸癌組織和外周血中的表達及其臨床意義

黃微　宋云駿　姜林鶴　劉運江

1.河北省承德市腫瘤醫院，河北承德067000；2.河北省承德市中心醫院，河北承德067000

CD44V6在結腸癌組織和外周血中的表達及其臨床意義

黃微1宋云駿2▲姜林鶴1劉運江1

1.河北省承德市腫瘤醫院，河北承德067000；2.河北省承德市中心醫院，河北承德067000

目的檢測結腸癌組織和外周血中CD44V6的表達，分析與結腸癌的臨床病理學特征和患者預后的關系。方法收集2011年1月～2012年12月在承德市中心醫院腫瘤科手術治療的57例患結腸癌者，收集其手術切除的癌組織、癌旁組織和外周血血清標本，另取10例健康者外周血作為對照。分別應用免疫組織化學方法（SP）和酶聯免疫吸附實驗（ELISA）檢測CD44V6的表達，分析其與結腸癌的臨床病理特征之間的關系以及與患者預后的相關性。結果CD44V6在結腸癌組織中的表達（63.16%）明顯高于其在癌旁正常組織的表達水平（10.00%），差異有高度統計學意義（P＜0.01）。患者血清中CD44V6為（14.62±3.34）ng/mL，而健康者血清中為（3.22±1.65）ng/mL，兩組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。結腸癌中的CD44V6表達與腫瘤的浸潤深度、分化程度、淋巴結轉移情況及臨床分期有關（P＜0.05）。通過Kaplan-Meier生存分析發現，CD44V6高表達的患者5年生存率（47.22%）明顯低于低表達患者（73.91%），差異有統計學意義（P＜0.05）。結論CD44V6在結腸癌組織和血清中高表達，并可能成為預測結腸癌浸潤轉移和預后的指標。

結腸癌；CD44V6；免疫組化；酶聯免疫吸附實驗

結腸癌是全世界常見的一種消化道惡性腫瘤，可發生在結腸的任何部位。近年來，該病在我國發病率和死亡率均呈明顯上升趨勢［1］。結腸癌的治療手段主要是手術和輔助治療，盡管這些年得到了很大發展，但患者的遠期生存率卻無明顯提高，這主要是由于術后復發和轉移所致。因此，人們期望通過研究結腸癌的腫瘤分子，尋找能夠預測結腸癌轉移侵襲和預后的指標，為臨床病理診斷和治療提供更多的幫助。

CD44V6是目前研究較多的關于結腸癌的蛋白黏附因子，其在肺癌、食管癌及乳腺癌等多種實體癌中均有明顯表達。Bendardaf等［2］報道CD44V6與腫瘤分級和浸潤的深度呈相關性，提示黏附分子在局部侵襲和轉移的結直腸癌中與腫瘤分化、浸潤有關。Heider等［3］研究發現，CD44V6的表達多發生于腫瘤晚期，且在發生轉移的結腸癌患者中表達更強，密度更大。Gurtne［4］和Gkrause［5］等研究都發現，進展期胃癌、結直腸癌患者血清中CD44V6水平增高，但當腫瘤切除后血清中CD44V6水平下降，提示血清CD44V6水平有可能作為惡性腫瘤患者腫瘤負荷及轉移的指標。因此，CD44V6的表達與患者臨床病理特征和生存率的關系值得進一步研究。本研究通過免疫組織化學染色法和酶聯免疫吸附實驗（ELISA）檢測CD44V6在結腸癌組織和血清中的表達，并分析CD44V6的表達與臨床病理特征的相關性以及與結腸癌患者預后的關系，為CD44V64作為臨床判斷預測結腸癌轉移和預后指標提供參考。

1　材料與方法

1.1一般資料

選取2011年1月～2012年12月在承德市中心醫院腫瘤科手術治療的結腸癌患者57例，所有患者術前均未接受放、化療及免疫治療。患者年齡36～70歲，中位年齡47歲；其中男35例，女22例。手術切除組織，4%多聚甲醛固定并進行石蠟包埋。同時收集距離癌組織15 cm遠處的腸黏膜組織作為正常對照。根據第6版的惡性腫瘤TNM分類進行臨床分期，并由兩位病理科醫師進行準確的確診。其中結腸癌38例、直腸癌19例。按照浸潤深度分為：浸潤至漿膜及漿膜外32例、未超過肌層25例；根據腫瘤分化程度分為：高分化腺癌11例、中分化腺癌34例，低分化腺癌12例。Duke's分期：A期6例、B期18例、C期33例；按照是否有淋巴結轉移分為：淋巴結轉移陽性33例、淋巴結轉移陰性24例。同時在術前取患者空腹靜脈血2～3 mL，待血液凝固后分離上清液，在-70℃下冰凍保存。另取10例健康者外周血作為正常對照。

1.2免疫組織化學染色法

免疫組織化學染色（SP兩步法）熱修復抗原后采用兩步法檢測結腸癌和癌旁組織中CD44V6的表達。實驗步驟嚴格按試劑盒說明書進行操作。CD44V6單克隆抗體為北京中杉金橋生物科技有限公司產品，工作濃度均為1∶100。染色判斷標準：按Heider等［3］的標準，選擇5個具有代表性的高倍視野（400×），以細胞膜或細胞質出現棕黃或棕褐色為陽性染色，不著色為陰性（-），著色為（+）。通過電話或書信方式隨訪患者生存情況。

1.3 ELISA

CD44V6 ELLSA試劑盒購買北京金杉公司，實驗方法嚴格按照試劑盒說明書進行操作，檢測血清中CD44V6的含量。

1.4統計學方法

采用統計軟件SPSS 13.0對數據進行分析，正態分布計量資料以均數±標準差（x±s）表示，兩獨立樣本的計量資料采用t檢驗；計數資料以率表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。Kaplan-Meier法計算生存率。

2　結果

2.1 CD44V6在結腸癌患者組織和血清中的表達

CD44V6陽性物質定位于細胞膜和/或細胞質（圖1）。57例結腸癌組織中36例CD44V6的表達為陽性，陽性表達率為63.16%（36/57）；在癌旁正常組織中的陽性表達為8.77%（5/57）。在結腸癌組織中的陽性表達明顯高于正常組織，差異有高度統計學意義（χ2= 9.722，P=0.002）。

結腸癌患者血清中CD44V6表達水平為（14.62± 3.344）ng/mL，而正常對照組血清中CD44V6表達水平為（3.22±1.65）ng/mL，結腸癌組表達水平顯著高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖1　免疫組化檢測結腸癌組織中CD44V6的表達（sp法，400×）

2.2 CD44V6在結腸癌組織和血清中的表達與臨床病理特征的關系

CD44V6在結腸癌組織中的表達與患者的年齡、性別及腫瘤的直徑大小無相關性（P＞0.05），而與腫瘤的浸潤深度（P=0.034）、組織學分化程度（P=0.001）、淋巴結轉移（P=0.001）及臨床病理分期（P=0.000）有關。見表1。

CD44V6在結腸癌血清中的表達水平在患者不同性別及年齡間無明顯差異（P＞0.05），而與腫瘤的直徑大小（P=0.037）、浸潤深度（P=0.001）、組織學分化程度（P=0.002）、淋巴結轉移（P=0.000）及臨床病理分期（P=0.000）有關。見表1。

表1　CD44V6在結腸癌組織和血清中的表達與臨床病理特征的關系

2.3 CD44V6在結腸癌患者組織中的表達與生存率的關系

在57例結腸癌患者中，5年后生存的患者34例，其中17例CD44V6表達陽性，陽性率為50.00%；死亡患者23例，其中19例CD44V6表達陽性，陽性率為82.61%。CD44V6陰性表達組平均生存時間為（55.810±2.046）個月，CD44V6陽性表達組平均生存時間為（49.361±2.136）個月，差異有統計學意義（χ2= 5.543，P=0.019）。見圖2。

圖2　Kaplan-Meier生存分析CD44V6表達水平與結腸癌患者預后關系

3　討論

結腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，在惡性腫瘤中位居第3位。目前結腸癌的治療主要采用以手術為主結合放化療的綜合治療。但結腸癌的遠期生存率并不高，其中肝轉移是治療失敗的主要原因之一［6］。隨著對結腸癌病因、發病機制的深入研究，人們發現了眾多結腸癌早期診斷和預后有意義的腫瘤標志物，其中最廣泛的就是CD44V6。

CD44是一種廣泛分布的多功能、多結構的細胞表面跨膜糖蛋白［7］，屬于未分類的細胞粘附分子，主要參與腫瘤的異質性黏附，即腫瘤細胞與宿主細胞和宿主基質的黏附，腫瘤的異質性黏附在腫瘤細胞侵襲和轉移過程起促進作用。近年來研究發現，CD44能促進腫瘤細胞與血管內皮細胞之間的黏附，并促進與基底膜的浸潤，同時影響細胞骨架蛋白的分布及構型，增加癌細胞的運動能力，進而促進腫瘤的轉移［8-9］。CD44V6是CD44的外顯子不能表達方式體現一種變異蛋白，參與了腫瘤細胞的黏附，生長調控，逃逸，分化以及游動［10］。CD44V6是一組跨膜糖蛋白，是細胞外基質ECM家族中一個重要成員的受體，主要在結腸癌中表達［11］。CD44V6參與了很多重要的細胞活動過程，如黏附，生長調控，逃逸，分化以及游動，也因此被認為既是一種腫瘤抑制因子又是一種生長侵襲促進因子。有學者［12］通過免疫組織化學法檢測直腸癌組織中的CD44V6的表達情況，結果表明CD44V6能夠提示癌癥的遠處轉移，可以作為判斷結腸癌預后的重要指標。郭慶喜等［13］研究也發現CD44V6、MMP-7和E-cadherin與結直腸癌侵襲和轉移性有關，對結直腸癌的預后判斷有重要意義。黃榮暉等［14］研究也表明在發生遠處轉移的結腸癌中CD44V6的表達水平要明顯增高。陳兵［15］研究發現CD44V6表達與胃癌的分化程度、浸潤深度T分期、淋巴結轉移和臨床腫瘤TNM分期密切相關。

本研究采用免疫組化法檢測結腸癌及癌旁組織中CD44V6蛋白的表達情況，結果顯示，在57例結腸癌組織中CD44V6的表達率明顯高于其在癌旁組織中的表達。隨浸潤程度的加重，CD44V6蛋白的陽性表達率明顯增加（P=0.034）；在腫瘤細胞的不同分化程度間，CD44V6的表達差異有高度統計學意義（P=0.001）。在臨床分期上，Duke's C期病例組的陽性率高于Duke's A、B期，差異有高度統計學意義（P=0.000）。淋巴結轉移組的陽性表達率也明顯高于淋巴結未轉移組（P=0.001）。以上結果提示CD44V6蛋白表達的結腸癌具有更強的侵襲力，易發生淋巴結轉移，在結腸癌的臨床病理進展和侵襲轉移過程中發揮重要的促進作用［16-18］。另外，本研究還通過ELISA法測定了結腸癌患者血清中的CD44V6的表達水平，并探討其表達水平與結腸癌患者的臨床病理特征的關系，結果顯示CD44V6在結腸癌患者血清中的表達均明顯高于正常血清，這提示CD44V6和MMP-2可能與結腸癌的發生發展有關。同時還發現血清中的CD44V6表達與結腸癌的腫瘤大小，浸潤深度及淋巴結轉移也存在密切的關系。Bendardaf等［12］在早期的研究報道稱CD44V6在結腸癌組織中的表達與腫瘤的TNM分期、淋巴結轉移及血管受侵明顯相關，這與本研究結果相一致。以上研究都提示CD44V6與結腸癌的浸潤轉移有關，有可能成為判斷結腸癌浸潤轉移的一個指標。另外，本研究還發現CD44V6表達程度越高預示著患者的預后越差，提示CD44V6也可作為結腸癌的一個預后指標，一定程度上可以反映病情的進展，為臨床評價療效、評估病情及指導治療提供參考依據。

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Expression of Cd44V6 in colorectal cancer tissue and serum and its clinical significance

HUANG Wei1SONG Yunjun2▲JIANG Linhe1LIU Yunjiang1
1.Tumour Hospital of Chengde City，Hebei Province，Chengde067000，China；2.Central Hospital of Chengde City，Hebei Province，Chengde067000，China

Objective To investigate the expression of CD44V6 in colorectal cancer tissue and serum，and analyze its relationship with clinicopathological parameters and prognosis.Methods From January 2011 to December 2012，in Tumour Hospital of Chengde City，57 patients with coloreactal cancer underwent surgery were selected，the samples of colorectal cancer tissues，para-carcinoma tissue and serum were collected，and serum samples from 10 healthy persons were selected as control.The CD44V6 expression in tissue was detected by immunohistochemistry and the expression in serum was detected by ELISA.The relationship between CD44V6 expression and colorectal cancer patient clinicopathological parameters and prognosis were analyzed.Results The expression of CD44V6（63.16%）in colorectal cancer tissue was obviously higher than that in para-carcinoma normal tissue（10.00%），the difference was statistically significant（P＜0.01）.The expression levels of CD44V6 in serum from patients［（14.62±3.34）ng/mL］was higher than that from normal healthy persons［（3.22±1.65）ng/mL］，the difference was statistically significant（P＜0.05）.There were relationship between the expression of CD44V6 and tumor depth，the degree of differentiation，lymph nodes and pathological degree（P＜0.05）.Kaplan-Meier survival analysis showed that the 5-year survival rate in CD44V6 of high expression patients（47.22%）was significantly lower than that of low expression patients（73.91%），the difference was statistically significant（P＜0.05）.Conclusion The expression of CD44V6 was upregulated in tissue and serum of colorectal cancer patients.CD44V6 may be used as an important marker to predict invasion，metastasis and prognosis in colorectal cancer.

Colorectal cancer；CD44V6；Immunohistochemistry；ELISA

R735.3

A

1673-7210（2015）12（b）-0083-04

2015-08-03本文編輯：蘇暢）

河北省承德市科學技術研究與發展計劃項目（20142116）。