組織T細胞因子4、P糖蛋白和抗凋亡蛋白B細胞淋巴瘤-xl在結直腸癌中的表達及其臨床意義

楊偉　金田野　劉峰　孫政

廣州醫科大學附屬廣州市第一人民醫院胃腸外科，廣東廣州510180

組織T細胞因子4、P糖蛋白和抗凋亡蛋白B細胞淋巴瘤-xl在結直腸癌中的表達及其臨床意義

楊偉金田野劉峰孫政▲

廣州醫科大學附屬廣州市第一人民醫院胃腸外科，廣東廣州510180

目的探討組織T細胞因子4（TCF-4）、P糖蛋白（P-gp）和抗凋亡蛋白B細胞淋巴瘤-xl（Bcl-xl）在結直腸癌中的表達及其臨床病理特征的關系。方法選取廣州醫科大學附屬廣州市第一人民醫院2013年1～12月100例手術切除結直腸癌組織及距病灶10 cm以上的正常組織，應用免疫組化的方法，分別檢測TCF-4、P-gp和Bcl-xl蛋白在結直腸癌組織及正常組織的表達，并分析其與臨床病理的關系。結果TCF-4、P-gp和Bcl-xl在結直腸癌組織中的陽性表達率分別為85%、67%和84%，明顯高于正常黏膜組織（9%、2%、7%），差異有統計學意義（P＜0.05）；結直腸癌組織中TCF-4、P-gp，Bcl-xl三者間表達呈正相關（r=0.301、0.581、0.390，P＜0.01）。結直腸癌組織中TCF-4和Bcl-xl陽性表達與腫瘤組織的分化程度呈正相關（r=0.390，P＜0.01），結直腸癌組織中TCF-4、P-gp，Bcl-xl陽性表達與患者年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、組織學類型之間無明顯相關（P＞0.05），與浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移、TNM分期有關（P＜0.05）。結論結直腸癌組織中TCF-4、P-gp和Bcl-xl的表達與浸潤、轉移、TNM分期及復發密切相關，可作為判斷結直腸癌患者預后的指標，P-gp和Bcl-xl在結直腸癌中的多藥耐藥機制可能與Wnt/β-Catenin-TCF信號通路TCF-4有關。

結直腸癌；組織T細胞因子4；P糖蛋白；抗凋亡蛋白B細胞淋巴瘤-xl

結直腸癌（colorectal cancer）是近年來在國內外嚴重危害人類生命的惡性腫瘤之一［1］，其發病率和死亡率都呈上升趨勢，目前主要采取手術和放療、化療為主的綜合性治療［2］，化療是進展期結直腸癌治療的重要臨床措施，而化療的最大障礙是結直腸癌細胞的多藥耐藥性（multidrug resistance，MDR）。由于結直腸癌細胞的MDR，是導致結直腸癌治療失敗的關鍵原因［3］。多種機制參與介導了腫瘤MDR的產生［4］，但MDR具體機制仍未明確，其中Wnt/β-catenin-TCF信號通路是研究的熱點［5］，但有關Wnt/β-catenin-TCF信號通路中轉錄調控元件TCF對結直腸癌多藥耐藥相關基因的調控作用鮮有研究報道。本研究擬通過免疫組織化學的方法檢測CRC組織T細胞因子4（T cell factor 4，TCF-4）、P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）、抗凋亡蛋白B細胞淋巴瘤-xl（B-cell lymphoma-extra large，Bcl-xl）的表達情況，并結合臨床資料分析其與臨床病理特征的關系，探討TCF-4、P-gp、Bcl-xl在結直腸癌發生、發展、MDR的作用及其相關性。

1　資料與方法

1.1一般資料

隨機選擇廣州醫科大學附屬廣州市第一人民醫院2013年1～12月外科手術切除并有完整臨床治療的結直腸癌患者100例，所選病例術前均未接受化療、放療或者其他針對腫瘤的治療。所有臨床標本的使用均征得患者知情同意并通過醫院倫理委員會審核批準后用于實驗。其中男56例，女44例，年齡28～82歲，平均（64.3±0.1）歲；結腸癌64例，直腸癌36例；按WHO病理分級：高分化15例，中分化68例，低分化17例；按UICC標準行TNM標準臨床分期：A期5例，B期33例，C期33例，D期29例。另外取其相配對癌旁10 cm正常黏膜組織作為對照。

1.2方法

TCF-4、P-gp、Bcl-xl免疫組織化學染色采用鏈霉素-生物素過氧化物酶（SP）染色法，嚴格按說明書操。TCF-4、P-gp、Bcl-xl單克隆抗體為即用型工作液，用已知陽性切片做陽性對照，用PBS做陰性對照。TCF-4、P-gp、Bcl-xl單克隆抗體、SP試劑盒及DAB顯色試劑盒，以上材料均購買于福州邁新生物技術開發公司。

1.3判斷標準

TCF-4蛋白在石蠟中陽性染色主要定位于細胞漿及細胞核，呈現棕黃色顆粒，Bcl-xl、P-gp蛋白在石蠟中陽性染色主要定位于細胞膜和/或細胞漿。根據腫瘤細胞顯色的比例及染色強度。以陽性細胞率評分：計數10個高倍視野，陽性細胞數＜5%為0分，5%～25%為1分，＞25%～50%為2分，＞50%～75%為3分，＞75%為4分。以顯色程度評分：淡黃色為1分；黃色為2分；棕黃色為3分。兩項結果相加＜2分為陰性（-），2～3分為弱陽性（+），4～5分為中度陽性（++），6～7分為強陽性（+++）。其中+～+++為陽性。

1.4統計學方法

采用統計軟件SPSS 13.0對數據進行分析，正態分布計量資料以均數±標準差表示，兩獨立樣本的計量資料采用t檢驗；計數資料以率表示，采用χ2檢驗或Fisher精確概率法。相關性采用Spearman相關性分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1 TCF-4、P-gp、Bcl-xl在結直腸癌及正常組織的表達

TCF-4蛋白陽性表達主要定位于細胞漿及細胞核，以細胞核為主，呈現棕黃色顆粒（圖1）；Bcl-xl、P-gp蛋白陽性表達主要定位于細胞膜和/或細胞漿，呈現棕黃色顆粒（圖2～3）。

圖1　組織T細胞因子4在組織中的陽性表達（SP，200×）

圖2　P糖蛋白在組織中的陽性表達（SP，200×）

圖3　抗凋亡蛋白B細胞淋巴瘤-xl在組織中的陽性表達（SP，200×）

結直腸癌組織中TCF-4、P-gp、Bcl-xl陽性表達率分別為：85%（85/100）、67%（67/100）、84%（84/100），而在癌旁正常組織中的陽性表達率分別為：9%（9/ 100）、2%（2/100）、7%（7/100），癌組織顯著高于正常組織，差異有高度統計學意義（χ2=115.937、93.484、119.548，P＜0.01）。

2.2結直腸癌組織TCF-4、P-gp、Bcl-xl表達的相關性分析

Spearman相關性分析顯示：TCF-4與P-gp、Bcl-xl表達呈正相關（r=0.301、0.581，P＜0.01）；P-gp、Bcl-xl表達呈正相關（r=0.390，P＜0.01）

2.3結直腸癌組織TCF-4、P-gp、Bcl-xl的表達與臨床病理參數的關系

TCF-4、P-gp及Bcl-xl在結直腸癌組織中的表達與患者發病年齡、性別、組織學類型、腫瘤部位、腫瘤大小無明顯關系（P＞0.05）；但與浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移、復發腫瘤者及TNM分期有關（P＜0.05）；不同分化程度的P-gp表達差異無統計學意義（P＞0.05），不同分化程度的TCF-4、Bcl-xl表達差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1　結直腸癌組織TCF-4、P-gp、Bcl-xl的表達與臨床病理參數的關系［n（%）］

3　討論

TCF-4是Wnt/β-catenin-TCF信號轉導通路中的核內轉錄因子。Wnt通路對于細胞生長、分化的調控，是通過其核內轉錄因子TCF激活一系列靶基因的轉錄來實現的［6］。本研究發現TCF-4在結直腸癌中的表達率明顯高于正常黏膜組織；TCF-4在結直腸癌組織中的表達與腫瘤的分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移、復發有關（P＜0.05），而且TCF-4陽性表達率隨腫瘤浸潤深度增加、分化程度增高、淋巴結轉移、遠處轉移、術后復發而增高，這說明TCF-4蛋白表達增強時，腫瘤分期越晚，淋巴結轉移越多，組織分化越差可能預后也越差。李春艷等［7］研究發現TCF-4高表達與NSCLC的分化密切相關。有的研究認為TCF-4的表達與浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移及腫瘤復發有密切相關［8］。然而楊連赫［9］研究表明TCF-4蛋白的表達情況與患者的TNM分期顯著相關，而與淋巴結轉移無關，這可能與研究樣本量少、檢測手段的標準化不足有關。Potocnik等［10］研究表明Wnt通路是通過TCF-4激活MDR基因轉錄多藥耐藥蛋白實現，從而導致多藥耐藥。因此，TCF-4在細胞惡性轉化的過程中起至關重要的作用，與結直腸癌的發生、預后相關。

P-gp是由MDRI基因編碼、具有能量依賴性藥泵功能，與藥物結合，同時在其核酸結合位點上結合，水解后所釋放的能量使藥物泵出細胞外，同時使藥物在細胞內再分布，使藥物聚集于與藥物作用無關的細胞器內，從而產生耐藥［11］。本研究發現P-gp在結直腸癌中的表達率明顯高于正常黏膜組織；P-gp在結直腸癌組織中的表達與浸潤程度、淋巴結轉移、遠處轉移、TNM分期、腫瘤復發相關；表明P-gp參與結直腸癌的發生、發展及MDR的產生。P-gp在結直腸癌組織中伴淋巴結轉移、遠處轉移者高表達；腫瘤侵犯程度越深、P-gp陽性表達率越高；術后腫瘤復發者P-gp蛋白陽性表達率比未復發者高。黎騁［12］研究表明P-gp表達與淋巴結轉移、浸潤深度有關。然而葉正龍等［13］研究表明P-gp表達與淋巴結轉移及分化程度無關。也有研究認為：P-gp表達與TNM臨床分期有關［14］。陳曉耕等［15］證實了P-gp的表達與腫瘤組織分化程度有關，分化程度越高，陽性表達率越低；而Nooter等［16］研究卻得出了相反的結論；因此，有關P-gp的表達情況尚需進一步深入研究探討。由此可見P-gp不宜用作判斷腫瘤惡性程度的指標，其表達可能具有個體差異性。因此化療前檢測P-gp可有效預防盲目用藥同時需根據P-gp動態變化適當調整化療藥物的使用，以免引起繼發耐藥。

Bcl-xl是Bcl-2家族的凋亡抑制基因，Bcl-xl可通過其分子表面的“疏水口袋”與含有BH3的促凋亡蛋白結合從而拮抗后者促進細胞凋亡的作用。此外Bcl-xl還可與Apaf-1、caspase-9形成復合物而抑制caspase-9等的激活，從而導致細胞內重要凋亡相關蛋白質的溶解并抑制細胞凋亡［17-18］。Konishi等［19］研究發現，直腸癌中hRFI過表達可以通過上調NF-κB活性的途徑使Bcl-xl表達上調，從而抵抗5-FU誘導的線粒體凋亡通路。本研究發現Bcl-xl在結直腸癌中的表達率明顯高于正常組織；與Bcl-xl在結直腸癌組織中的表達與患者腫瘤的分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移、TNM分期及腫瘤復發復發有相關性，而且Bcl-xl陽性表達率隨腫瘤分化程度增高、浸潤深度增加、淋巴結轉移、遠處轉移、術后復發而增高，而與其他臨床病理特征無關，這說明Bcl-xl蛋白表達增強時，腫瘤分期越晚，淋巴結轉移越多，可能預后也越差，這與文獻報道的研究基本相符合［20］。然而有研究表明，與腫瘤的浸潤深度及淋巴結轉移情況無關［21］。本研究表明分化程度差、浸潤較深、有淋巴結轉移、遠處轉移者腫瘤復發者，Bcl-xl蛋白表達陽性率較高。因此本研究認為Bcl-xl可作為反映結直腸癌惡性生物學行為及預后的潛在標志物，提示Bcl-xl在結直腸癌的發生發展中有重要作用，測定結直腸癌組織中Bcl-xl的表達可能對判斷預后有一定幫助。

本研究結果顯示，結直腸癌組織TCF-4、P-gp、Bcl-xl三者間表達呈正相關。Wang等［22］在大腸癌的研究中發現，P-gp的表達受β-catenin/TCF的調節，并且這種調節是通過TCF-4激活P-gp啟動子而實現的。細胞質內由于β-catenin的積聚而進入核內與TCF-4形成激活復合體，再進一步激活TCF-4的下游靶基因，并使其表達增強，結果P-gp分泌增加；抗凋亡抑制基因Bcl-xl表達上調，參與抑制結直腸癌細胞凋亡的同時降低了結直腸癌細胞對化療藥物的敏感性，使細胞凋亡減少，細胞增殖失控，導致結直腸癌的發生、侵襲和轉移及MDR，有研究表明P-gp與Bcl-xl呈正相關［21］，與本研究相一致，提示P-gp和Bcl-xl在結直腸癌中的高表達可能是協同導致MDR。

綜上所述，深入研究TCF-4、P-gp、Bcl-xl三者之間作用調控機制及其相互之間的關系，對揭示結直腸癌的發病機制、進展及MDR有重要意義；聯合檢測TCF-4、P-gp和Bcl-xl不但有望成為結直腸癌的早期診斷和判斷預后的重要指標，而且為結直腸癌臨床上的靶點治療提供新的依據和思路，為不同患者制訂個體化治療方案，為評估化療方案的療效提供理論依據。

［1］Ferlay J，Soerjomataram I，Dikshit R，et al.Cancer incidence andmortalityworldwide:sources，methodsandmajorpatterns in GLOBOCAN 2012［J］.Int J Cancer，2015，136（5）：E359-E386.

［2］Engstrom PF，Arnoletti JP，Benson AB，et al.NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology：colon cancer［J］.J NatlCompr Canc Netw，2009，7（8）：778-831.

［3］Foo J，Michor F.Evolution of acquired resistance to anticancer therapy［J］.J Theor Biol，2014，355：10-20.

［4］Kessenbrock K，Plaks V，Werb Z，et al.Matrix metalloproteinases：regulators of the tumor microenvironment［J］. Cell，2010，141（1）：52-67.

［5］MacDonald BT，Tamai K，He X.Wnt/beta-catenin signaling：components，mechanisms，anddiseases［J］.Dev Cell，2009，17（1）：9-26.

［6］Meinhardt G，Haider S，Haslinger P，et al.Wnt-dependent T-cell factor-4 controls human etravillous trophoblast motility［J］.Endocrinology，2014，155（5）：1908-1920.

［7］李春艷，崔澤實，盧瑤，等.β-連環素/T細胞因子4信號通路在非小細胞肺癌中的研究［J］.中華病理學雜志，2005，34（9）：599-600.

［8］Jiang Y，Zhou XD，Liu YK，et al.Association of hTcf-4 gene expression and mutation with clinicopathological characteristics of hepatocellular carcinoma［J］.World Journal of Gastroenterology，2002，8（5）：804-807.

［9］楊連赫，徐洪濤，王妍，等.TCF-4在肺癌中高表達并與肺癌的進展有關［J］.中國肺癌雜志，2008，11（2）：214-219.

［10］Potocnik U，Ravnik-Glavac M，Glavac D，et al.Functional MDR1 polymorphisms（G2677T and C3435T）and TCF4 mutations in colorectal tumors with high microsatellite instability［J］.Cell Mol Biol Lett，2002，7（1）：92-5.

［11］Samanian S，Mahjoubi F，Mahjoubi B et al.MDR1 gene polymorphisms：possible association with its expression and clinicopathology characteristics in colorectal cancer patients［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2011，12（11）：3141-3145.

［12］黎騁.結直腸癌組織中耐藥基因P-gp、GST、TopoⅡ的表達［J］.胃腸病學和肝病學雜志，2014，23（7）：779-782.

［13］葉正龍，盛德平，楊勇，等.GST-π、P-gp和Ts在消化道腫瘤中的表達及臨床意義［J］.現代腫瘤醫學，2012，20（9）：1894-1896.

［14］Mao ZP，Zhao LJ，Zhou SH，et al.Expression and significance of glucose transporter-1，P-glycoprotein，multidrug resistance-associated protein and glutathione S-transferase-π in laryngeal carcinoma［J］.Oncol Lett，2015，9（2）：806-810.

［15］陳曉耕，王清水，陳新.P-gp、GST-π在癌旁正常組織表達對胃癌預后影響的研究［J］.瘤防治研究，2001，28（3）：182.

［16］Nooter K，Dela Riviere GB，Klijn J，et al.Multidrug resistance protein in recurrent breast cancer［J］.Lancet，l997，349（9069）：1885-1886.

［17］Jazirehi AR，Gan XH，De Vos S，et al.Rituximab（anti-CD20）selectively modifies Bcl-xL and apoptosis protease activating factor-1（Apaf-1）expression and sensitizes human non-Hodgkin's lymphoma B cell lines to paclitaxel-induced apoptosis［J］.Mol Cancer Ther，2003，2（11）：1183-1193.

［18］Burek M，Maddika S，Burek CJ，et al.Apoptin-induced cell death is modulated by Bcl-2 family members and is Apaf-1 dependent［J］.Oncogene，2006，25（15）：2213-2222.

［19］Konishi T，Sasaki S，Watanabe T，et al.Over expression of hRFI inhibits 5-fluorouracil-induced apoptosis in colorectal cancer cells via activation of NF-kappaB and upregulation of BCL-2 and BCL-XL［J］.Oncogene，2006，25（22）：3160-3169.

［20］侯文權，周凌云，周友明.Bcl-xl和VEGF-C蛋白在非小細胞肺癌中的表達和意義［J］.中國醫學創新，2010，7（8）：25-27.

［21］胡梅潔，袁耀宗，孫穎，等.胃癌多藥耐藥相關蛋白表達的臨床分析［J］.胃腸病學，2011，16（5）：293-297.

［22］Wang B，Zou Q，Sun M，et al.Reversion of trichostatin A resistance via inhibition of the Wnt signaling pathway in human pancreatic cancer cells［J］.Oncol Rep，2014，32（5）：2015-2022.

Expression and clinical significance of T cell factor 4，P-glycoprotein and Bcl B-cell lymphoma-extra large-xl in colorectal cancer

YANG WeijinTIAN YeLIU FengSUN Zheng▲
Department of Gastrointestinal Surgery，Guangzhou First People's Hospital Affiliated to Guangzhou Medical University，Guangdong Province，Guangzhou510180，China

Objective To investigate the expressions of T cell factor 4（TCF-4），P-glycoprotein（P-gp），and B-cell lymphoma-extra large（Bcl-xl）and their relationship with clinical pathological characteristic in tissues of colorectal cancer.Methods From January to December 2013，in Guangzhou First People's Hospital Affiliated to Guangzhou Medical University，TCF-4，P-gp and Bcl-xl expression were assessed by immunohistochemistry in paraffin samples from 100 colorectal cancer specimens and normal colorectal mucosa specimens（more than 10cm away from the cancerous lesions）.Relationships among TCF-4 expression，P-gp expression，Bcl-xl expression and clinicopathological characteristics were analyzed.Results Expression rate of TCF-4，P-gp and Bcl-xl in colorectal cancer specimens were 85%，67%and 84%，these were higher higher than those in normal colorectal mucosa（9%，2%，7%），the differences were statistically significant（P＜0.05）.The expressions of TCF-4，P-gp and Bcl-xl in cancerous tissues were positively correlated with each other（r=0.301，0.581，0.390，P＜0.01）.The expressions of TCF-4 and Bcl-xl in cancerous tissues were positively correlated with the differentiation of tumor（r=0.390，P＜0.01），the expressions of TCF-4，P-gp and Bcl-xl were no significantly correlated with the age，the gender，tumor sides，tumor location，histological types（P＞0.05），but they were significantly correlated with depth of invasion，lymph node metastasis，tumor metastasis，TNM stage，tumor recurrence（P＜0.05）.Conclusion TCF-4，P-gp and Bcl-xl are overexpressed in colorectal cancer and correlated with tumor invasion，lymph node metastasis tumor metastasis，TNM stage，tumor recurrence，and they can be used as prognostic factors in patients with colorectal cancer.In the multidrug resistance mechanism of colorectal cancer，P-gp and Bcl-xl may connect with TCF-4 of Wnt/β-Catenin-TCF signal pathways.

Colorectal cancer；T cell factor 4；P-glycoprotein；B-cell lymphoma-extra large

R735.3

A

1673-7210（2015）12（b）-0075-05

2015-08-13本文編輯：蘇暢）

廣東省社會發展領域科技計劃項目（93077）。▲