蜜蜂個體發育過程中特定腸道菌的形成

郭軍　李繼蓮　吳杰　編譯

（中國農業科學院蜜蜂研究所，北京　100093）

蜜蜂個體發育過程中特定腸道菌的形成

郭軍李繼蓮吳杰編譯

（中國農業科學院蜜蜂研究所，北京100093）

（續2015年第1期）

3　結果

3.1qPCR結果

蜂群的來源對細菌數量沒有顯著影響，因此，來自不同群體的蜜蜂在后續分析中進行合并分析。工蜂日齡對BFG豐富度具有很大的影響，主要是由于NEWs采集于1日齡，幾乎沒有BFG種系型，只有較少的104個拷貝，而成年工蜂的16S rRNA基因的拷貝數可達106（P=2.4×10-106，Tukey's HSD法）。由于1日齡個體表現出較少的腸道菌且不能代表成熟工蜂，后續分析均采用存在1日齡和不存在1日齡個體進行統計分析。1日齡后，總BFG的16S rRNA基因拷貝隨著日齡增加而增加，在9日齡和30日齡之間時超過2倍。

平均所有日齡后，Firm-5種系型的16S rRNA基因拷貝數比Beta或Gamma-1種系型要多（P= 0.0011，Tukey's HSD法）。Beta和Gamma-1種系型代表了23%和25%的總BFG 16S rRNA基因拷貝，而Firm-5種系型代表了52%。總的16S rRNA基因拷貝數量在不同腸道器官之間變化較大（P=6.6×10-84和9.8×10-80，Tukey's HSD法）。平均下來，在整個消化道內，BFG 16S rRNA基因拷貝總數在蜜囊中占0.007～0.062%，中腸中占1～4%，回腸中占4～10%，直腸中占87～94%。每個種系型的數量的描述只針對特定的腸道器官，而不考慮宿主的日齡和細菌類型。

只有1日齡樣品未能表現出顯著的日齡-腸道器官相互作用（P=1.6×10-33，Tukey's HSD）。所有的1日齡樣品均表現出較低的豐富度。腸道器官的這三種細菌種系型的相對豐富度有所不同，另外，不論是否排除1日齡數據，器官-細菌種系型的交互作用均顯著（P=3.7×10－5和2.4×10－5，Tukey's HSD法）。總BFG數量在不同腸道器官上有幾個數量級的變化。另外，根據ANOSIM，蜜囊/直腸，中腸和后腸具有明顯不同的菌群組成（P=＜0.0001；R=0.3575）。蜜囊和直腸的BFG組成差異不顯著，并包括大部分的Firm-5種系型（69%和81%）。中腸中Gamma-1占主導地位（47%），Beta種系型在回腸中占主導地位（42%）。

3.2FISH顯微檢測

首先對不含FISH探針的工蜂腸道組織的自發熒光進行觀察，5日齡幼蟲和新出房工蜂的腸道樣品中缺乏任何FISH探針，而哺育蜂和采集蜂的腸道對每個探針都產生信號。這些結果表明幼蟲和很年輕的工蜂包含很少或沒有細菌。在FISH調查中，NEWs，哺育蜂和采集蜂可被近似認為是與相應的已經知道日齡和行為的1，9和30日齡個體相對應。

與幼蟲和NEWs相比，哺育蜂和采集蜂FISH圖像表明其腸道內具有大量的細菌。相似的細菌定殖類型也在采集蜂和哺育蜂中觀察到。哺育蜂/采集蜂的蜜囊中幾乎沒有細菌。哺育蜂/采集蜂的中腸中具有較小數量的細菌，包括Beta種系型，沿著整個長度的中腸分布，但細菌的加載量在向中腸后部分布時有所增加，在中腸后部，Gamma-1為優勢細菌。

哺育蜂/采集蜂的回腸的細菌與中腸中的顯著不同。沿著回腸的長度有較大的內陷并充滿大量細菌細胞。這一細菌團主要有BFG種系型組成。另外，一些細胞只被通用細菌探針染色（eub339），Gamma-1和Beta種系型是回腸中細胞數量最多的細菌種系型。Beta種系型常直接與回腸內膜相聯系，而Gamma-1種系型常發現于回腸內陷內。Firm-5種系型雖不是優勢菌但其菌簇可以看到。哺育蜂/采集蜂的直腸能夠容納花粉細胞而有一定程度的自體發光，在大多數波長下用于激發FISH探針。然而，直腸中大量細菌群體大大超過花粉的數量并能很容易的通過圖像鑒定出來。Firm-5是直腸中豐富度最高的種系型而只有很少數量的Beta和Gamma-1種系型可以觀察到。另外，直腸中有很多細菌只能被通用探針示蹤（eub339）而不是特定探針，這表明，很多直腸內的群體與Beta，Firm-5，或Gamma-1種系型無關聯。我們還注意到Firm-5探針很特殊不能與Firm-4雜交，另外乳酸菌種系型可能在直腸中比較豐富。

3.3幼蟲中細菌的PCR檢測

對全部幼蟲的DNA樣品進行細菌PCR擴增，健康群來自3個地方，一群表現出感染歐洲幼蟲腐臭病的癥狀。所有樣品均具有Apis mellifera ef1α基因的陽性擴增，表明所提DNA達到PCR質量要求。采用通用細菌16S rRNA基因引物進行擴增，在35只健康個體中只有6只（3日齡幼蟲，5日齡幼蟲，或NEW）具有擴增產物。

相反，采用通用16S rRNA基因引物在大多數（10/ 14）先前檢測出感染歐洲幼蟲腐臭病的蜂群中產生出條帶。這些蜂群中，3日齡幼蟲大部分缺乏細菌（1/5陽性反應），5日齡幼蟲全部含有細菌（5/5），并且大多數剛出房工蜂個體含有細菌（4/5）。幾乎所有的種系型-特異性PCR結果都是陰性；然而，一些個體的Alpha-2.2種系型在所有健康蜂和感染歐幼病蜂群中呈陽性。有限的測序結果表明，在感染歐幼病蜂群中陽性通用16S rRNA基因產物表現出多樣的細菌物種，包括常見的繼發性感染源——糞腸球菌（Enterococcus faecalis）。

3.4評估新出房工蜂中特定微生物的來源

所有的DNA樣品都具有ef1α基因的陽性擴增，表明DNA具有較好的質量。由于籠子的蜜蜂僅僅被提供蜂糧作為食物，也是潛在的微生物來源，一些樣品（3/ 12）產生真菌的擴增產物，而完全沒有細菌存在（0/ 12）。來自蜂房中西方蜜蜂蜂糧含有細菌和真菌（2/2 samples）；然而，特征性的微生物種系型幾乎不存。只有Alpha-2.2存在特征性的種系群。

所有在籠中飼養的剛出房的工蜂（具有哺育蜂）都對細菌呈陽性對真菌呈陰性。除了Alpha-1種系型外，哺育蜂幾乎對所有的種系型都呈陽性。新出房工蜂暴露在這些哺育蜂周圍，盡管哺育蜂含有一些特定種系型的共生菌，但這些NEWs并未像哺育蜂一樣能夠被這些共生菌定殖，NEWs與哺育蜂的腸道勻漿接觸后對很多Apis mellifera的特定菌的種系型呈陽性。飼養在含有巢框的籠中的NEWs能夠獲得一些菌的種系型，但個體之間的菌的定殖不一致（不管它們是否與哺育蜂接觸）。

4.討論

從結果可以得出蜜蜂腸道定殖的菌群相對一致，主要是Beta，Firm-5，和Gamma-1這幾種類型，并且受宿主日齡和腸道形態的影響。腸道菌群的豐富度和群落結構隨著蜜蜂的生活史而變化，并且在成年蜂腸道不同器官部位也有所不同。在幼蟲和新出房的工蜂中不存在腸道菌。腸道菌在成年工蜂腸道中的建立主要發生在子脾中的蜜蜂出房后與蜂箱接觸和不同同伴之間的交哺作用；特定種系型的腸道菌在工蜂一生中保持穩定。

在先前的調查中觀察到，所有自然狀態下飼養的蜜蜂工蜂均棲息著特定種系型的腸道菌。通過焦磷酸測序技術進行的深度測序結果再次確認BFG種系型在蜜蜂腸道菌中占據優勢，約占總的16S rRNA基因序列覆蓋度的73%。Gamma-2也是主要的種系型之一，約占這些序列的23%。腸道中較少的菌落類型如雙歧桿菌也始終存在可能也起到了主要的功能。個體之間這種種系型比例的差異在其他一些研究中也有觀察到，這也可能反映出不同的DNA提取方法和步驟或不同蜂群之間的生物差異。

4.1成年工蜂

隨著工蜂日齡的增加，它們需要更多時間進行箱外任務，并將暴露在不同食物和各種微生物環境中。總的來說，從箱內哺育子代到箱外環境中進行采集，成年蜂個體的微生物保持相對穩定。結果表明老年工蜂（30日齡）的腸道菌較多并且Gamma-1和Gamma-2比列較高（30日齡的樣品聚類在9日齡樣品的范圍之外）。

蜜囊是腸道內的一種肌肉質的可膨脹器官，以適應采集蜂采集花蜜。雖然蜜囊經常含有營養豐富的花蜜并可作為微生物的能量來源，但它幾乎不包含有細菌蜜囊這種頻繁的填充和排空采集的花蜜到蜂箱中可擾亂微生物群落結構并阻止細菌定殖。或者是花蜜在蜜囊中釀造時由于加入了酶從而阻止了細菌的生長，這些酶也被認為是蜂蜜具有抗菌特性的主要原因。

中腸是成蜂的主要消化位點，在成蜂中腸內，上皮細胞分泌的酶可以消化食物，還能通過特化的中腸細胞和后腸上皮細胞進行吸收。不像其它腸道部位，中腸壁缺乏一個薄的內膜表皮層。相反，中腸上皮細胞可產生圍食膜，圍食膜是一種松散的薄膜可以輔助消化，保護上皮細胞以防粗糙的食物粒子。中腸上皮細胞可連續生產這種膜狀物并在食物通過時脫落，這樣可以阻止微生物附著。消化酶和圍食膜的存在可以解釋中腸中腸道菌比較貧瘠的原因（占BFG微生物總數的1-4%），盡管中腸是蜜蜂消化道中最大的器官。另外，FISH顯微檢測結果表明大多數中腸細菌都處于較后的位置，靠近幽門部，這表明，中腸的部分微生物可能在解剖切割中腸時從回腸轉入到中腸后部。西方蜜蜂的回腸是在中腸和直腸之間的相對較小的器官，它具有較深的內折以便提供表面區域來吸收未被中腸收集的營養。盡管中腸比回腸大，但回腸中BFG的群體數量幾乎比中腸大量兩倍（占總BFG的5～10%）。與中腸相比，回腸的內膜折疊中具有豐富的附著點，使其有機會接觸一些消化而未被吸收的營養。FISH圖片進一步提供了附著點對細菌定殖的重要性證據，尤其是Beta和Gamma-1種系型。回腸的細菌群落相對于腸道壁來說表現為分層次的生物膜鄰近宿主組部位具有Beta種系型生物膜結構，Gamma-1種系型分布在鄰近Beta和回腸壁的厚墊上，此外，Firm-5種系型沿著回腸壁周圍的小囊中分布。Beta種系型的附著可能使后面的種系型，如Gamma-1易于定殖和附著。產生的生物薄膜可能產生microgradients微梯度（如營養、氧氣和pH），這些可能提供分散的生態位以利于各種底物的利用，類似于白蟻的腹部菌群。

直腸像蜜囊一樣，具有一定的膨脹性，可適應更大的容量；這發生于工蜂連續保留消化廢物直到它們飛出箱外排泄飛行時。在這相對靜態的環境下，類似于白蟻的胃，直腸的內容物（主要是空的花粉外壁）可為細菌提供營養來源，因為發現于花粉壁的碳水化合物很難被蜜蜂消化。由于直腸營養豐富的環境，其中棲息著大部分始終穩定的微生物，占每只蜜蜂總的BFG 16S rRNA基因總數的87～94%。Firm-5種系型是直腸中的優勢種群，并在直腸內腔中普遍存在，并散布于消化的花粉外殼上。總的來說，直腸包含了大多數BFG種系型的16S rRNA基因拷貝，并且還含有一些額外的細菌細胞，這些細菌只與通用真細菌探針雜交而不與特定的BFG探針雜交。這些非BFG細菌細胞大部分代表了除去特定特征微生物后的剩余的種系型（如Alpha-1，Alpha-2.1，Alpha-2.2，Bifido，Firm-4，和Gamma-2）。FISH顯微鏡方法對這些其它種系型的調查將闡明它們在蜜蜂腸道中的分布。

4.2幼蟲

在動物中腸道菌普遍存在，基于非培養的方法對來自3個不同地理區域的健康蜜蜂群中幼蟲的研究表明幼蟲中存在很少或幾乎沒有腸道菌。蜜蜂幼蟲中缺乏或不存在腸道菌似乎顯得很奇怪，因為哺育蜂中具有特征性的腸道菌并通過口頭飼喂幼蟲。蜜蜂幼蟲具有看不見的盲腸能夠阻止消化廢物排泄出去，直到化蛹前才第一次排泄，蜜蜂幼蟲腸道中缺乏或不存在細菌在傳統的細菌培養方法中也已經有報道。然而，其他一些依賴培養的研究提出幼蟲腸道在自然狀態下具有大量特征種系型的細菌。在這些研究中，幼蟲未進行表面消毒，并且從子代巢房中的污染可能傳播一小部分這些種系型的細菌到幼蟲體表。大部分幼蟲都是篩選自感染類芽孢桿菌的幼蟲，觀察到已知感染歐洲幼蟲腐臭病的蜂群可潛在改變幼蟲微生物的自然動態并允許微生物定殖。Mohr和Tebbe采用依賴培養的方法測定細菌16S rRNA基因但并未測定成蜂和幼蟲的總的細菌，他們連續三年采樣后發現成年工蜂腸道菌群保持一致（包括本文報道的類型），但幼蟲與成蜂不同，并存在采樣年份內和年份之間的變化，并缺乏特征性的微生物種系型。這種細菌存在的不規律性表明幼蟲腸道微生物的存在來自其食物即蜂糧中。當前的調查表明，幼蟲中的細菌除了Alpha-2.2外缺乏其他特征性細菌。Alpha-2.2可在未加工的蜂糧中發現，并在先前的研究中發現于各種蜜蜂和胡蜂種中。另外一個可能性是蜂糧中的細菌群落的變異可以解釋為什么不同幼蟲之間細菌的變化。

試圖判定益生細菌的保護功能的研究主要集中在引入不同的乳酸菌（包括Firm-5）給幼蟲并讓這些幼蟲感染病原菌，然而，這些實驗依賴的菌株主要來自成年工蜂，因此并不能代表幼蟲中自然存在的Firm-5。幼蟲中細菌的缺乏表明幼蟲具有不斷增長的抑制抗菌能力或強烈免疫反應（由幼蟲和/或通過哺育蜂交哺行為產生）。很多社會性昆蟲的幼蟲只被飼喂成年蜂加工過的食物，這就可能改變食物成分，如抑制微生物生長或富含特定的無病原菌/益生菌等物質，因此使幼體失去了感染病原體的機會。這可能對蜜蜂尤其重要，因為，很多破壞性的蜜蜂疾病都能侵染子脾（如真菌，細菌，蛛型綱動物和原生動物）。這些病原菌經常在蜜蜂消化食物時通過中腸壁并感染宿主組織。另外一個可能是幼蟲腸道中的抗菌成分阻止了成年蜂腸道中存在的特定菌種系的增殖但未能阻止具有抗性的幼蟲病原菌的定殖。

4.3剛出房工蜂

同預期的結果一樣，新出房工蜂含有很少或不含細菌，因為蜜蜂經歷了一個復雜的變態過程，這一過程可引起腸道內膜的脫落。與剛出房工蜂的工蜂相比，9日齡的成年工蜂已經具有一個發育完全的腸道菌群并與年老的工蜂并無顯著差異。因為9日齡的個體中細菌已經完全定殖，在它們第一次采集飛行前已經在箱內獲得了微生物群。目前對蜜蜂垂直和水平傳播細菌的界限還比較模糊。工蜂個體可能并未從母親體內獲得細菌而是通過直接或間接的通過姐妹間或與蜂箱的接觸而建立起自己的菌群。細菌的傳遞發生于蜂群內或超個體之間，如同白蟻和切葉蟻。因此，新出房的工蜂可能通過攝食巢脾中儲存的蜂蜜和蜂糧及與老齡工蜂交哺花蜜來獲得特定腸道菌，或者通過與巢脾的接觸來獲得。在通常的傳遞路線中種系型可能存在不同，在當前的調查中，蜂糧缺乏幾乎所有的特征細菌種系型，并且并未將特征種系型的細菌傳遞給新出房工蜂。進一步地說，試驗表明：蜜蜂特定細菌種系型可通過與巢脾接觸形成，或從子脾中自然出房的蜜蜂通過暴露（及通過可能的交哺現象）到年老的伙伴中獲得特定菌群。蜂群中蜜囊通常被稱作“社會性的胃”，因為蜜囊儲存的蜂蜜可在同伴蜜蜂個體之間共享。盡管蜜囊中只含有很少的微生物，一些細菌轉運細胞可以在幼蜂腸道中定殖從而不斷繁殖成一個完整的微生物群。而社會性交哺現象可能使同群內個體之間的微生物變得更加均勻。另外，食糞性，即通過直接或間接接觸蜂箱表面的糞便，也是另一個潛在的傳播途徑。

4.4蜜蜂腸道菌的潛在作用

很多對動物的研究揭示腸道菌對宿主具有一些獨特的有益功能。與蜜蜂關系較近的熊蜂腸道內也含有與Beta和Gamma-1相一致的種系型，此外，最近的研究還證實了腸道菌在成年熊蜂體內具有抵抗寄生性病原體的作用。這也進一步說明蜜蜂（Apis mellifera）的Beta或Gamma-1這兩種種系型也可能具有抵抗疾病功能的可能性。由于蜜蜂這一重要傳粉昆蟲對農業生態系統的重要作用以及蜜蜂與人類食物供應的緊密聯系，因此蜜蜂腸道菌的這些潛在有益功能至關重要。