粉紅黏帚霉糖化酶基因的克隆、表達及酶學性質分析

張亮花爾并王華明

（1. 天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2.中國科學院天津工業生物技術研究所，天津 300308）

粉紅黏帚霉糖化酶基因的克隆、表達及酶學性質分析

張亮1，2花爾并1王華明2

（1. 天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2.中國科學院天津工業生物技術研究所，天津 300308）

用黑曲霉（Aspergillusniger）G1為宿主菌表達粉紅黏帚霉（Gliocladiumroseum）糖化酶。運用PCR技術從粉紅粘帚霉中擴增得到一個疑似糖化酶基因序列（約1.8 kb），并將其連接到載體pGm上組建成重組質粒pGm-3440。將重組質粒轉化到黑曲霉G1菌株中，經amdS篩選及PCR驗證獲得表達糖化酶的黑曲霉重組工程菌。重組菌的發酵結果顯示，糖化酶基因在黑曲霉中得到了分泌表達，用國標法（QB/T 1803-1993）測得重組糖化酶活性達292 U/mL。進一步對其酶學性質進行分析發現，該重組酶最適溫度和pH分別為50℃和5.0，該酶的耐熱性較差，pH穩定性較好。

糖化酶；粉紅黏帚霉；黑曲霉G1；分泌表達

糖化酶，又稱葡萄糖淀粉酶［Glucoamylase，系統命名為淀粉 α-1，4-葡聚糖葡萄糖水解酶，α-1，4-Glucanglucohydrolase（EC.3.2.1.3）］，是一種具有外切活性的酶，它能把淀粉、糊精、糖原等從非還原性末端水解α-1，4-葡萄糖苷鍵，而得到終產物β-D-葡萄糖，也能緩慢水解α-1，6-葡萄糖苷鍵或α-1，3-葡萄糖苷鍵，轉化為葡萄糖［1-3］。糖化酶在工業上具有重要的用途，例如，低熱量啤酒的釀造，酒精工業中谷物的水解，淀粉糖工業中生產葡萄糖、高葡萄糖糖漿，農用化學品及藥物合成等［4-6］。糖化酶來源廣泛，已報道的產糖化酶真菌有23個屬，35個種，細菌有3屬3種［7］。由于黑曲霉能幾乎100%水解淀粉產生葡萄糖，其產生的糖化酶轉苷酶活性較低［8］。因此，工業生產用的糖化酶主要來自于黑曲霉。近些年，科學家們對糖化酶的研究主要集中在新基因、固定化、耐熱機制、基因的調控轉錄及糖化酶的新應用等方面［9-11］。

黑曲霉是一種酶系豐富、代謝產物復雜的絲狀真菌。黑曲霉表達系統具有優于大腸桿菌表達系統和釀酒酵母表達系統的獨特優點。大腸桿菌在高表達外源蛋白時容易形成包涵體，缺少真核細胞的一些翻譯后的修飾，其表達產物往往不具有生物活性，且包涵體的分離純化也比較困難。釀酒酵母分泌蛋白的能力較弱，且往往會過度糖基化，表達真核生物蛋白通常沒有活性。黑曲霉具有較強的蛋白質分泌能力，并具有與哺乳動物相似的糖基化修飾系統，可以對表達的蛋白進行正確的翻譯后加工與修飾［12，13］。另外，黑曲霉已被美國政府認定為食品藥品的安全生產菌株，其發酵工藝及下游分離純化技術已相當成熟［14］。因此，黑曲霉作為一種重要生產菌株被廣泛用于發酵工業。已報道的黑曲霉產品包括檸檬酸、葡糖酸、沒食子酸、蛋白酶及淀粉酶等。

粉紅黏帚霉（Gliocladiumroseum）異名粉紅螺旋聚孢霉（Clonostachysrosea），是一種重寄生真菌（hyperparasites），能夠寄生于其它真菌而營寄生生活。由于粉紅黏帚霉能有效地抑制病原真菌的繁殖，自20世紀90年代發現以來粉紅黏帚霉主要被用作植物病原菌的生防菌［15-17］。目前國內外對粉紅黏帚霉的研究主要在其寄生機理以及植物病害的防治效果上，對其基因的克隆研究較少，尚未見有粉紅黏帚霉糖化酶基因的研究報道。本研究首次將來源于粉紅黏帚霉的糖化酶基因在黑曲霉G1中進行重組表達，并以酶活性高低和酶學性質為指標，旨在獲得一種酶活性高、耐熱性強、生產成本低、有重要應用價值的新型糖化酶。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株大腸桿菌DH5α感受態購自北京全式金生物技術有限公司；粉紅黏帚霉、黑曲霉G1為本實驗室保藏。本研究所采用的黑曲霉G1宿主菌為糖化酶glaA基因和蛋白酶pepA基因雙敲除的菌株。

穿梭載體pGm圖譜如圖1所示，共計8 982 bp，其上有來源于黑曲霉的糖化酶強啟動子PglaA，來源于塔賓曲霉的終止子TglaA，并含有氨芐青霉素和乙酰胺選擇性標記，3個常用的酶切位點Xba I、Pac I和Xho I。

圖1 穿梭載體pGm圖譜

酶和試劑：PhusionDNA聚合酶購自賽默飛世爾科技公司，Xba I、Xho I限制性內切酶、Gel Extraction Kit、Plasmid Kit、T4連接酶購自Fermentas公司，Fungal DNA Kit 購自OMEGA公司，預制蛋白膠購自英濰捷基（上海）貿易有限公司，酵母膏、蛋白胨購自OXOID公司，裂解酶、乙酰胺、氨芐青霉素購自Sigma公司，其余試劑為國產分析純。

培養基與溶液LB、CMA、amdS篩選培養基［18］、MMSA、CSL、PromosoySpecial Medium 發酵培養基、Solution A、Solution B、Solution C、裂解液、微量元素。

粉紅黏帚霉全基因組測序工作由編號為11ZCZDSY08300的天津市工業微生物基因組解析項目完成，序列暫未公開。本實驗所用的啟動子為黑曲霉糖化酶強啟動子，誘導物為麥芽糖，該麥芽糖存在于發酵培養基中。

1.2 方法

1.2.1 糖化酶基因在粉紅黏帚霉全基因組中的挖掘 用序列比對的方法將黑曲霉糖化酶（GenBank編號XP_001390530.1）序列與粉紅黏帚霉全基因組預測蛋白序列進行比對，獲取相似性較高的序列。將相似性較高的序列在NCBI數據庫中進行BLAST比對分析，并用SignaIP分析信號肽，最終確定要克隆的糖化酶基因g3440。

1.2.2 糖化酶基因g3440的克隆 以粉紅黏帚霉全基因組DNA為模板進行PCR擴增獲得目的基因，PCR過程所用到的引物分別為：上游引物5'-CCGCTCGAGAGGATGGTGAAGATAATTC CCACTGTGC-3'，下游引物5'-TGCTCTAGATCATCG CCAGTTATCATTAGTCGAG-3'，下劃線處表示Xho I、Xba I兩限制酶酶切位點。PCR反應體系為20 μL：5×Phusion HF Buffer 4 μL，dNTP（10 mmol/L）0.4 μL，上下游引物（100 μmol/L）各0.4 μL，基因組1 μL，PhusionDNA polymerase 0.2 μL，Milli-Q H2O 13.6 μL。反應條件：98℃預變性30 s；98℃變性10 s，72℃延伸1 min，30個循環；72℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的擴增產物。

1.2.3 重組表達載體的構建 用膠回收試劑盒純化PCR產物，純化后的PCR產物及pGm載體用Xho I、Xba I限制性內切酶進行雙酶切，回收目的基因片段及載體片段進行連接，連接產物轉化感受態大腸桿菌DH5α，經Amp抗性篩選陽性克隆，提取質粒，進行菌落PCR鑒定。鑒定正確后，委托英濰捷基（上海）貿易有限公司進行測序。將測序正確的質粒命名為pGm-3440。

1.2.4 黑曲霉原生質體的轉化及篩選 將黑曲霉G1孢子在CMA液體培養基中30℃、200 r/min條件下培養過夜。用無菌濾布收集菌體并用Solution A沖洗，轉移菌體至40 mL裂解液（40 mL Solution A中加0.6 g裂解酶）中，30℃、200 r/min裂解2-3 h。過濾并用兩個無菌50 mL離心管收集原生質體，每管加Solution B至25 mL，4 000 r/min、5 min，棄上清；每管加 25 mL Solution B，4 000 r/min、5 min，棄上清；合并兩管，加20 mL Solution B，4 000 r/min、5 min，棄上清。加10 μL DNA、12.5 μL Solution C、100 μL原聲質體，冰浴20 min。取出，加1 mL Solution C、2 mL Solution B，9 mL MMSA上層培養基，混勻倒入平板MMSA中，培養7-10 d直至長出轉化子。用amdS篩選培養基進行轉化子篩選，將轉化子進行基因組提取并進行PCR鑒定及測序鑒定，鑒定正確的菌株即為重組黑曲霉菌株。

1.2.5 重組菌的發酵驗證 挑取重組黑曲霉菌株，接種于20 mL發酵培養基中，30℃、200 r/min培養5 d，14 000 r/min離心10 min收集上清液。取30 μL上清液，加10 μL 4×Loading Buffer，沸水煮5 min，用10%預制膠上樣10 μL進行電泳，電泳條件200 V、45 min。

1.2.6 重組酶活性測定 重組糖化酶酶活測定按國家行業標準QB/T1803-1993進行。酶活定義：1 mL液體酶，于40℃、pH值為4.6的條件下，1 h分解可溶性淀粉產生1 mg葡萄糖，即為1個酶活力單位，以（U/mL）表示。

1.2.7 生淀粉糖化酶活性測定 預先將酶液用乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH6.0）稀釋100倍，取3 mL加入250 mL三角瓶中，加入0.9 g玉米淀粉，再加入緩沖液24 mL，60℃、100 r/min培養1 h，并設未加酶液作為空白對照。取出加入3 mL 10%碳酸鈉溶液，4 000 r/min離心10 min，取上清，用GOPOD試劑盒檢測還原糖的含量。

1.2.8 重組酶最適溫度及熱穩定性測定 用DNS法在pH4.6條件下測定不同溫度下重組酶的活力，以最高酶活100%計。在不同溫度下將重組酶保溫一段時間（5、10、15、30、60 和90 min），在最適條件下測定剩余酶活，以未處理的酶液酶活為100%計。1.2.9 重組酶最適pH及pH穩定性測定 在最適溫度下測定不同pH值下重組酶的活力，以最高酶活100%計。在室溫下將重組酶在不同pH值緩沖溶液中放置一段時間（1、2、4、8、20和32 h），在最適條件下檢測剩余酶活力，以未處理的酶液酶活為100%計。

2 結果

2.1 糖化酶基因的挖掘

用序列比對的方法從粉紅黏帚霉全基因組中獲得了一個可能編碼糖化酶的基因g3440，其注釋信息為E5AAM7_Glucoamylase。該基因編碼一個含有527個氨基酸的蛋白質，其序列已在2013年申請的專利（申請號201310718737.2）中公開。用VectorNTI軟件預測其分子量為56.4 kD。該蛋白序列與黑曲霉糖化酶相似性達48%，覆蓋度達97%（圖2）。用SignaIP分析發現該序列存在一個信號肽切割位點，推斷的信號肽切割位點在S22-E23之間，該信號肽屬于真核生物信號肽。

圖2 粉紅黏帚霉g3440基因的氨基酸序列與黑曲霉糖化酶序列同源性比對分析

該基因大小為1 825 bp，其cDNA大小為1 584bp，含有3個內含子序列，大小分別為173、13和55 bp。將g3440基因的氨基酸序列在NCBI數據庫中進行BLAST比對，結果顯示該序列與NCBI中已公布的來源于Leptosphaeriamaculans JN3 的糖化酶（GenBank編號XP_003844197.1）相似性最高（62%），因此，可判斷本研究擴增到的是一個新糖化酶基因。

2.2 PCR擴增產物鑒定

通過對粉紅黏帚霉菌全基因組基因進行PCR，獲得了大小正確的（1 825 bp）核苷酸序列（圖3）。

圖3 PCR擴增產物的電泳分析

2.3 轉化子基因組PCR鑒定

提取黑曲霉轉化子（5個）的基因組，PCR驗證及電泳分析結果如圖4所示。

圖4 轉化子菌株基因組PCR鑒定

2.4 重組菌的發酵產酶鑒定

SDS-PAGE（圖5）顯示1、4、5號轉化子均有表達。目的基因隨機重組到黑曲霉G1基因組中，2、3號菌可能是目的基因隨機重組的位點不正確，未能轉錄與翻譯。目的蛋白的分子量稍微偏大，用NetNGlyc 1.0 Server進行分析發現該氨基酸序列中有2個潛在的N-糖基化位點，因此推斷該蛋白可能進行了糖基化修飾，造成其實際分子量比根據氨基酸預測值大［19］。

圖5 黑曲霉轉化子的SDS-PAGE分析

2.5 重組酶的活性及酶學性質分析

2.5.1 重組酶活性測定 用國標法（QB/T 1803-1993）對重組酶液進行酶活性測定，結果顯示1號轉化子酶活性高達292 U/mL，4、5號轉化子酶活性分別為257 U/mL和263 U/mL。

2.5.2 生淀粉糖化酶活性測定 重組酶生淀粉糖化酶活性測定結果見表1。反應前后葡萄糖的變化可知1、4、5號轉化子生淀粉糖化酶活性均較低，甚至比出發菌株G1還低，因此認為沒有生淀粉糖化酶活性。

表1 葡萄糖的含量

2.5.3 重組酶的最適溫度及熱穩定性測定 用DNS法，在不同溫度下測定重組酶的活性。結果（圖6）顯示該酶的最適溫度為50℃。將重組酶在不同溫度下保溫并進行酶活性測定，結果（圖7）表明重組酶的耐熱性較差，在最適溫度下保溫15 min酶活性大約損失一半。

圖6 重組酶最適溫度曲線

圖7 重組酶熱穩定性曲線

2.5.4 重組酶的最適pH及pH穩定性測定 在不同pH值下對重組酶活性進行測定，發現重組酶的最適pH為5.0（圖8）。在將重組酶在不同pH溶液中室溫放置一段時間，并進行酶活性測定，結果（圖9）發現重組酶的pH穩定性較好，在pH5.0-6.0的緩沖液中放置20 h后仍有80%以上的酶活力。

圖8 重組酶最適pH曲線

圖9 重組酶pH穩定性曲線

3 討論

隨著全球經濟的發展，能源短缺的問題日益突出，可再生能源的開發與利用受到了世界各國的高度重視。淀粉是綠色植物果實、種子、塊莖、塊根的主要成分，是空氣中二氧化碳和水經光合作用合成的產物，是地球上最豐富的貯藏性多糖。然而，大多數微生物多以葡萄糖、麥芽糖等低聚糖為最適底物，天然淀粉卻不能被有效的利用。將天然淀粉轉化為可發酵性糖成為一個亟待解決的問題。糖化酶是水解淀粉的重要酶類之一，它可以水解生淀粉或低聚糖非還原性末端α-1，4-糖苷鍵生成葡萄糖。許多糖化酶水解生淀粉的活性較低且熱穩定性差，工業上在進行糖化前需將淀粉質原料進行高溫糊化和液化，并進行降溫冷卻，增加了生產成本。開發出酶活性高，耐熱性強的新型糖化酶可大大降低生產成本，提高發酵工業的經濟效益。近幾年，國內對新型糖化酶基因及表達的研究較少，對黑曲霉糖化酶基因、表達及產酶條件的研究較多。2008年，李昆等［20］用黑曲霉糖化酶基因啟動子PglaA替換質粒pRS303K上KmR基因啟動子，構建成糖化酶基因啟動子功能檢測質粒pRS-PglaA-KmR，并將其轉化E. coli JM109，通過對重組菌的氨基糖苷磷酸轉移酶基因活性檢測發現PglaA在E. coli中具有驅動KmR基因表達的活性。2011年賀瑩等［21］對黑曲霉IN7-31產糖化酶的液態發酵參數與技術優化進行研究，其搖瓶發酵糖化酶酶活高達3 044 U/mL，較優化前提高了1.59倍。2012年，王強等［22］將黑曲霉糖化酶基因在畢赤酵母X33中進行了成功表達，其表達量達180 mg/L。本研究采用基因工程技術手段將粉紅黏帚霉糖化酶基因插入到黑曲霉G1染色體中，并實現了成功表達，該重組酶酶活達292 U/mL，最適溫度和pH分別為50℃和5.0。本研究為后續新型糖化酶的開發奠定了基礎，同時也為糖化酶的研究提供了一種新的出發菌株。隨著老一代糖化酶逐漸被新型糖化酶取代，篩選和開發高比酶活、耐高溫或用于生淀粉加工的新型糖化酶基因，對于淀粉加工產業和釀酒糖化過程優化等工業生產技術提升提供支持。同時，新型糖化酶的開發可以打破國際專利對傳統糖化酶的保護壁壘和技術壟斷，為我國淀粉質原料的降解提供更高效的酶及輔助因子。傳統糖化酶大都存在酶活性不高，耐熱性差等問題，在實際生產運用中能耗大、耗時長、成本高，而開發出酶活性高，耐熱性強的新型糖化酶可大大降低淀粉質原料的糖化成本，提高糖化效率。此外，傳統糖化酶的生產菌株大多是野生菌株經過反復誘變而得到的突變株，在實際生產中存在著易污染、生產條件復雜且難以控制等技術性難題，而新型糖化酶菌株通過基因工程技術手段定向構建，可有效解決這些問題。本研究獲得的重組酶活性有待進一步提升，同時該酶的酶學性質在耐熱方面也需要改善。進行密碼子優化及高通量篩選，提升重組酶的活性和酶學性質將是下一步研究工作的重心。

4 結論

本研究首次克隆并報道了粉紅黏帚霉糖化酶基因，并將其轉化到黑曲霉G1中獲得了糖化酶的表達。120 h搖瓶發酵后，發酵液上清糖化酶活性達292 U/mL。對重組糖化酶的酶學性質進行研究表明，其最適溫度和pH分別為50℃和5.0，該酶熱穩定性較差，pH穩定性較好，在pH5.0-6.0的緩沖液中室溫放置20 h后仍有80%的殘余酶活。

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（責任編輯 李楠）

Cloning，Expression and Characterization of Glucoamylase from Gliocladium roseum

Zhang Liang1，2Hua Erbing1Wang Huaming2
（1. College of Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457；2.Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308）

Glucoamylase from Gliocladium roseum was secretively expressed in Aspergillus niger G1 strain. A putative glucoamylase gene（about 1. 8 kb）was amplified by PCR using genomic DNA of G. roseum as template. The amplified products were ligated into the clone vector pGm to construct recombinant plasmid pGm-3440. The recombinant plasmid transformed into A. niger G1 strain， and amdS screening and PCR validation confirmed that an engineering Aspergillus strain of expressing glucoamylase was obtained. Fermentation of recombinant strain indicated that secretive expression of the glucoamylase gene was available in A. niger， and its enzyme activity was measured by method defined in national standard（QB/T 1803-1993）， and it reached 292 U/mL. Further enzymatic analysis demonstrated that the optimum pH and temperature for the recombinant enzyme were 5. 0 and 50℃， respectively. Meanwhile， it had poor thermal resistance， but promising pH stability.

glucoamylase；Gliocladium roseum；Aspergillus niger G1；secretive expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.029

2014-10-21

“十二五”基礎前沿專項（Y1J4061201）

張 亮，男，碩士研究生，研究方向：生物工程；E-mail：929850607@qq.com

花爾并，男，博士，教授，研究方向：藥物合成，E-mail：huarb@tust.edu.cn；王華明，男，博士，教授，研究方向：新型工業酶及表達系統，E-mail：wang_hm@tib.cas.cn