響應(yīng)面優(yōu)化丙酮粉法提取金銀花多酚氧化酶

屈政 羅磊 楊彬 康新艷

（河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，洛陽(yáng) 471023）

響應(yīng)面優(yōu)化丙酮粉法提取金銀花多酚氧化酶

屈政 羅磊 楊彬 康新艷

（河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，洛陽(yáng) 471023）

對(duì)丙酮粉法提取金銀花多酚氧化酶的工藝進(jìn)行研究，結(jié)果表明，緩沖液pH、料液比、提取時(shí)間對(duì)PPO比活力影響顯著。緩沖液pH與料液比交互作用極其顯著，回歸模型擬合性良好（R2=99.31%）；影響顯著順序?yàn)椋红o置時(shí)間＞緩沖液pH值＞料液比；最優(yōu)化工藝參數(shù)為：緩沖液pH7.5，料液比為1∶120，提取時(shí)間為14.5 min。在此條件下，酶比活力為137.389 U/mg。

金銀花；多酚氧化酶；丙酮粉；提??；響應(yīng)面

傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為金銀花具有清熱解毒、疏利咽喉、消暑除煩的功效。新鮮金銀花含水量約為80%，顏色嫩綠，但新鮮金銀花不利于運(yùn)輸及儲(chǔ)存，必須及時(shí)干燥。干燥過(guò)程極易造成金銀花外觀顏色嚴(yán)重褐變，同時(shí)，其主要功效成分綠原酸和木犀草苷含量明顯下降，金銀花藥用價(jià)值損失很大［1］。為探究金銀花在干燥過(guò)程中酶促褐變的機(jī)理，有必要提取分離高純度的PPO作酶學(xué)性質(zhì)的相關(guān)研究。

目前，PPO提取方法有勻漿法和丙酮粉法。勻漿法操作簡(jiǎn)單，所得酶液活性較強(qiáng)，但多酚類物質(zhì)殘留量較高，酶液純度偏低。丙酮粉法主要是通過(guò)丙酮使細(xì)胞膜的磷脂結(jié)構(gòu)破壞，從而改變細(xì)胞膜的通透性，再經(jīng)過(guò)提取可使膜結(jié)合的PPO或胞內(nèi)的PPO釋放出胞外。相對(duì)于勻漿法而言，其酶粉活性尚可、體積小且便于貯存，可直接應(yīng)用［2］。田玉庭［3］曾用丙酮粉法提取澳洲青蘋PPO，經(jīng)初步純化后，SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)僅顯示一條電泳帶。Ben-Shalom等［4］用丙酮粉法提取橄欖果實(shí)中的PPO，也取得了良好的效果。目前，尚未有響應(yīng)面優(yōu)化丙酮粉法提取金銀花多酚氧化酶的相關(guān)研究報(bào)道，本研究對(duì)其進(jìn)行初步探索。

1 材料與方法

1.1 材料

無(wú)損傷、未開(kāi)花、品質(zhì)良好的新鮮金銀花，購(gòu)于河南省孟津縣益豐金銀花生產(chǎn)基地，品種為金豐一號(hào)。丙酮、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸、氫氧化鈉、鄰苯二酚、考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清蛋白。以上均為分析純。

飛利浦HR2850攪拌機(jī)、天孚DT510L電子天平、湘儀H1850R冷凍離心機(jī)、SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)易有限公司；DYY-6C電泳儀，北京市六一儀器廠；UV2400紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；PHS-3C PH計(jì)，上海越平科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 酶的提取 10 g樣品加入一定體積-20℃ 丙酮中，打漿1 min（打10 s停5 s），迅速用布氏漏斗抽濾，將濾餅溶于冷凍丙酮中反復(fù)抽濾，至濾餅無(wú)色為止。將濾餅置于培養(yǎng)皿中，在室溫下干燥，待丙酮完全揮發(fā)后，即得丙酮粉。丙酮粉溶于一定pH磷酸鹽緩沖液中，靜置若干時(shí)間，用八層紗布過(guò)濾后在凍離心機(jī)中離心，取上清液，即為PPO粗酶液［5］。

1.2.2 酶活力的測(cè)定 向3 mL pH 7.0的磷酸鹽緩沖液和1 mL 0.01 mol/mL的鄰苯二酚的混合溶液中加入1 mL PPO粗酶液，混合均勻后，測(cè)定其在2 min內(nèi)420 nm下的吸光度，從加入粗酶液開(kāi)始計(jì)時(shí)，每10 s記錄一次OD值，用PBS和鄰苯二酚混合液為參比，通過(guò)最初直線段較穩(wěn)定的斜率來(lái)計(jì)算PPO活力［6］。一個(gè)酶活力單位（U/mL）定義為：每單位時(shí)間內(nèi)引起吸光度改變0.001所需的酶量。

其中，A：吸光度的變化量；Vr：加樣緩沖液總體積（mL）；Vs：取樣比色體積（mL）；W：取樣質(zhì)量（g）。

1.2.3 蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定 采用Bradford考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定PPO含量，用牛血清蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線［7］，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：

其中，y：吸光度，x：蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度（mg/mL）。

1.2.4 PPO比活力的測(cè)定 PPO比活力是指每毫克PPO所具有的活力數(shù)。比活力越大，表示PPO的純度越高［8］。計(jì)算公式如下：比活力=活力（U/mL）/蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度（mg/mL）。

1.2.5 單因素試驗(yàn)

1.2.5.1 緩沖液pH值的選擇 按料液比為1∶100，取1 g丙酮粉，分別加入100 mL pH為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的PBS中，靜置30 min后，8 層紗布過(guò)濾。用高速冷凍離心機(jī)在4℃、10 000 r/min的條件下離心15 min，分別測(cè)定上清液中酶的比活力。

1.2.5.2 料液比的選擇 取1 g丙酮粉，分別加入60、100、140、180、220 mL pH為7.5的磷酸鹽緩沖液中，靜置30 min后，8層紗布過(guò)濾。用高速冷凍離心機(jī)在4℃、10 000 r/min的條件下離心15 min，分別測(cè)定上清液中酶的比活力。

1.2.5.3 提取時(shí)間的選擇 取1 g丙酮粉，加入料液比1∶100，pH為7.5的磷酸鹽緩沖液中，分別靜置0 min、30 min、1 h、1.5 h、2 h后，八層紗布過(guò)濾。用高速冷凍離心機(jī)在4℃、10 000 r/min的條件下離心15 min后，測(cè)定各上清液中酶的比活力［9-11］。

1.2.6 丙酮粉法提取金銀花PPO工藝響應(yīng)面實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以緩沖液pH值、料液比、提取時(shí)間構(gòu)建二元回歸模型，采用響應(yīng)面分析方法對(duì)提取金銀花PPO比活力大小的影響進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

圖1 緩沖液pH值對(duì)PPO比活力的影響

2.1 緩沖液pH值的影響

由圖1可知，不同pH值的磷酸鹽緩沖液提取金銀花PPO丙酮粉，所得PPO比活力有明顯的差異。當(dāng)pH小于7.5時(shí)，PPO比活力隨著緩沖液pH值的增大而增大。當(dāng)pH到達(dá)7.5時(shí)，PPO比活力到達(dá)一個(gè)峰值。當(dāng)pH大于7.5時(shí)，PPO比活力出現(xiàn)明顯下降的趨勢(shì)。

2.2 料液比的影響

由圖2可知，當(dāng)料液比大于1∶100時(shí)，PPO比活力隨著料液比的增加上升明顯，當(dāng)料液比小于1∶100時(shí)，PPO比活力出現(xiàn)了略微下降的趨勢(shì)后基本保持不變。

圖2 料液比對(duì)PPO比活力的影響

2.3 靜置時(shí)間的影響

由圖3可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，PPO比活力逐漸增加，15 min時(shí)達(dá)到峰值。隨著提取時(shí)間的繼續(xù)增加，PPO比活力開(kāi)始下降?？赡艿脑蚴请S著提取時(shí)間的增加，越來(lái)越多的PPO溶入到了緩沖液中，比活力隨之增加。當(dāng)在某一時(shí)間，PPO完全溶入緩沖液后，隨著提取時(shí)間的繼續(xù)增加，受提取環(huán)境的影響，本身構(gòu)相并不穩(wěn)定的PPO活力開(kāi)始下降，因此比活力逐漸降低。

圖3 提取時(shí)間對(duì)PPO比活力的影響

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析

2.4.1 響應(yīng)面因素水平的選取 綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，緩沖液pH值、料液比、提取時(shí)間三因素對(duì)金銀花PPO的比活力有較為明顯的影響。根據(jù)Box-Behnken的原理，在單因素?cái)?shù)據(jù)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采取三因素三水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分析方法，實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素和水平

2.4.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 以pH值（X1）、料液比（X2）、提取時(shí)間（X3）為自變量，以比活力（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.4.3 回歸方程的建立與檢驗(yàn) 表2中17個(gè)實(shí)驗(yàn)選擇分為響應(yīng)面的析因點(diǎn)和零點(diǎn)，其中序號(hào)1到12的實(shí)驗(yàn)為析因試驗(yàn)，13到17為中心實(shí)驗(yàn)。析因點(diǎn)自變量在由X1、X2、X3因素所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)上取值，零點(diǎn)則在對(duì)應(yīng)區(qū)域的中心點(diǎn)。一般情況下，零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)要重復(fù)進(jìn)行5次，以便于實(shí)驗(yàn)的估計(jì)誤差。由于各因素對(duì)比活力的影響均不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，所以采用Design-Expert軟件對(duì)表2的響應(yīng)值分別進(jìn)行多元回歸擬合，并確定各因素對(duì)響應(yīng)值的影響。各因素回歸擬合后，響應(yīng)變量Y對(duì)pH值、料液比、提取時(shí)間的二次多項(xiàng)回歸模型如下：

表3 回歸模型方差分析表

2.4.4 回歸方程的參數(shù)評(píng)估 由表4可知，X1、X3、對(duì)提取金銀花PPO比活力影響極顯著，X2對(duì)提取金銀花PPO比活力影響顯著。其中，三因素對(duì)提取金銀花中PPO比活力影響的主次順序是pH值＞浸提時(shí)間＞料液比。

表4 回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表

2.4.5 最佳提取工藝的優(yōu)化及驗(yàn)證 通過(guò)Design-Expert的最優(yōu)化模型回歸分析，得到最佳的提取工藝條件為，pH7.49，料液比1∶120、靜置時(shí)間為14.37 min，此條件下PPO酶的比活力的預(yù)測(cè)值為137.389 U/mg。為便于實(shí)際操作，把最佳提取工藝修正為pH 7.5，料液比1∶120、靜置時(shí)間為14.5 min。

為驗(yàn)證響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果的可靠性，在修正條件下，采用丙酮粉法對(duì)金銀花PPO進(jìn)行了提取，進(jìn)行5次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到平均比活力為131.732 U/mg，結(jié)果與預(yù)測(cè)值相近。驗(yàn)證表明，擬合模型對(duì)于提取金銀花PPO比活力的影響有較好的預(yù)測(cè)能力。

3 討論

3.1 緩沖液pH值對(duì)PPO比活力的影響

PPO在弱堿性條件下構(gòu)相穩(wěn)定性最高，活性最大［12］；而在酸性或者強(qiáng)堿性條件下，PPO會(huì)聚集、變性，從而影響比活力。

3.2 料液比對(duì)PPO比活力的影響

料液比過(guò)高，使丙酮粉未能完全溶于緩沖液中，提取不徹底造成PPO比活力不高。隨著緩沖液體積的增加，丙酮粉中的PPO開(kāi)始逐漸完全的溶入到緩沖液中，從而比活力增加［13］。當(dāng)料液比達(dá)到一定值時(shí)，丙酮粉中PPO和緩沖液的溶合達(dá)到一種平衡狀態(tài)，當(dāng)料液比繼續(xù)增加時(shí)，PPO可能會(huì)從緩沖液中溶出，造成比活力的降低［14］。

3.3 靜置時(shí)間對(duì)PPO比活力的影響

隨著提取時(shí)間的增加，越來(lái)越多的PPO溶入到了緩沖液中，比活力隨之增加。當(dāng)在某一時(shí)間，PPO完全溶入緩沖液后，隨著提取時(shí)間的繼續(xù)增加，受提取環(huán)境的影響，本身構(gòu)相并不穩(wěn)定的PPO活力開(kāi)始下降，因此比活力逐漸降低。

3.4 回歸方程的方差分析

對(duì)該模型進(jìn)行方差分析（表3），模型的F值為111.93，P值＜0.001，遠(yuǎn)小于一般顯著性檢驗(yàn)規(guī)定（P＜0.05為顯著，P＜0.01為極顯著），說(shuō)明二次多項(xiàng)式模型極顯著；失擬項(xiàng)的P值0.5354＞0.05，說(shuō)明模型失擬度不顯著?；貧w方程的擬合度還可通過(guò)擬合優(yōu)度R2和調(diào)整后擬合優(yōu)度adjR2來(lái)驗(yàn)證，二次多項(xiàng)式的模型的預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)真實(shí)值之間的相關(guān)性達(dá)99.31%，調(diào)整擬合優(yōu)度98.42%，表明該模型能夠解釋98.42%響應(yīng)值的變化，模型擬合程度良好。故可用此模型對(duì)丙酮粉法提取PPO粗酶液的比活力的大小進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

3.5 響應(yīng)面交互作用分析

如圖4所示，X1、X2在不同程度上對(duì)PPO比活力有影響，且二者交互作用極為顯著，可能是pH影響酶液的總酶活，料液比影響酶液中酶的濃度。二者的變化，引起了PPO比活力的變化；或者是料液比對(duì)酶濃度的影響隨著pH值的變化而變化，進(jìn)而影響PPO比活力的變化。X1、X3對(duì)PPO比活力影響最大，但二者交互作用卻不顯著，可能是pH對(duì)酶活性的影響和提取時(shí)間對(duì)酶濃度的影響的差異不顯著。X2X3亦是如此。

圖4 緩沖液pH值與料液比pH與靜置時(shí)間、料液比、與靜置時(shí)間交互作用的響應(yīng)面和等高線

3.6 勻漿法和丙酮法的對(duì)比研究

有文獻(xiàn)報(bào)道，羅磊等［7］曾用響應(yīng)面優(yōu)化勻漿法提取金銀花中PPO酶，得到酶的比活力為654.998 U/mg。丙酮粉法雖然對(duì)酶活性損失較大，但其酶粉活性尚可，且純度較高，可直接應(yīng)用，并為研究PPO酶學(xué)性質(zhì)打下了良好的基礎(chǔ)。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)羅磊優(yōu)化的勻漿法和本試驗(yàn)優(yōu)化的丙酮粉法提取的粗酶液進(jìn)行檢測(cè)［18］，結(jié)果顯示丙酮粉法提取的酶液清晰，在沒(méi)有進(jìn)一步提純的條件下僅有4條譜帶；勻漿法提取的酶液譜帶較多，且不清晰。由此可見(jiàn)，勻漿法的酶液含有較多的雜蛋白，而丙酮法提取的酶液蛋白純度較高。因此，為了進(jìn)一步研究金銀花在干燥過(guò)程中的褐變機(jī)理，應(yīng)選用丙酮粉法。

4 結(jié)論

由單因素試驗(yàn)可知，緩沖液pH值、料液比、提取時(shí)間對(duì)PPO比活力有顯著的影響。構(gòu)建的二次回歸模型，擬合性良好，驗(yàn)證了三因素對(duì)PPO比活力影響顯著。其中pH值和靜置時(shí)間極其顯著、pH值和料液比交互作用極其顯著。

優(yōu)化條件為緩沖液pH 7.5，料液比為1∶120，靜置時(shí)間為14.5 min，并與驗(yàn)證試驗(yàn)相符。經(jīng)電泳檢測(cè)，丙酮粉法提取酶液純度較勻漿法高，因此選用丙酮粉法提取金銀花PPO。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Optimizing the Method of Acetone Powder to Extract Polyphenoloxidase from Honeysuckle Using Response Surface Methodology

Qu Zheng Luo Lei Yang Bin Kang Xinyan
（College of Food and Bioengineering，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471023）

In this study， the method of acetone powder was optimized to extract the polyphenoloxidase（PPO）from honeysuckle flowers（Lonicera japonica）by response surface methodology. The results showed that three operating parameters had great effects on the PPO specific activity， and their effects were ranked as follows：extraction time ＞ buffer pH ＞ material-to-liquid ratio. The established regression model was highly fitting（R2= 99. 31%）， and the interaction effect between buffer pH and material-to-liquid ratio was extremely significant. The optimal extraction condition was pH 7. 49， material-to-liquid ratio 1∶120 and extraction time 14. 5 min， under which the PPO specific activity was 137. 389 U/mg.

Lonicera japonica；polyphenoloxidase；acetone powder；extract；response surface

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.031

2014-11-18

國(guó)家自然科學(xué)基金（U1304330）

屈政，男，碩士研究生，研究方向：天然活性物質(zhì)的提?。籈-mail：402526581@qq.com

羅磊，男，博士，副教授，研究方向：天然活性物質(zhì)；E-mail：13623896431@139.com