逐瘀通脈膠囊聯合針刺對腦卒中大鼠皮質區病理變化的影響

詹宇豪，王智惠，張文麗，王亞飛，李　倩，李　旗

逐瘀通脈膠囊聯合針刺對腦卒中大鼠皮質區病理變化的影響

詹宇豪1，王智惠2，張文麗2，王亞飛1，李倩2，李旗1

目的 觀察逐瘀通脈膠囊聯合針刺對腦卒中大鼠皮質區病理變化的影響。方法 將50只健康雄性SD大鼠隨機分為5組：對照組（A）、模型組（B）、通脈組（C）、針刺組（D）及針藥聯合組（E），采用兩血管法建立腦卒中模型，蘇木精—伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）觀察各組大鼠腦皮質病理改變，高倍鏡下圖像分析軟件計數，檢測神經元生存密度。結果 光鏡下可見B組較A組皮質區的細胞排列紊亂，且有壞死軟化病灶，神經元出現不同程度的細胞變性，神經元生存密度下降；C、D、E組較B組皮質區細胞壞死減少，變性程度減輕，血管及血管周圍間質水腫好轉，神經元生存密度增加；E組與C、D組比較，腦皮質區細胞排列較密集，部分錐體細胞胞體突起明顯，大部分缺血神經元病理變化明顯改善，神經元生存密度明顯增加。結論 逐瘀通脈膠囊聯合針刺可以明顯改善大鼠腦皮質區神經細胞病理變化，增加神經元生存密度。

逐瘀通脈膠囊；腦卒中；針灸

腦卒中是臨床常見病、多發病之一，又稱腦血管意外，常見于中年以上人群的急性發作，可發生意識障礙、癡呆、肢體癱瘓和死亡，在腦血管疾病中呈逐年上升的趨勢。在人類對抗腦血管疾病的歷史進程中，中醫針灸及中藥發揮了非常重要作用。針灸可改善腦血流量，加速血管的修復和再生，逐瘀通脈膠囊可降低血液黏度，抑制血小板聚集，增加腦部供氧量，有關其臨床應用已有文獻［1］報道；而且針刺結合藥物治療腦血管病的療效優于單純針刺組或藥物組，聯合治療在臨床上存在一定的優勢［2］，但其具體機制尚不明確。本研究觀察逐瘀通脈膠囊聯合針刺對腦卒中大鼠皮質區腦細胞的病理變化及神經元生存密度的影響，為腦卒中針藥聯合治療提供理論基礎。

1　材料與方法

1.1材料 健康雄性清潔級SD大鼠50只，體重240～300 g，購于北京維通利華公司，動物實驗許可證號：SCXK（京）2014-0030；逐瘀通脈膠囊（國藥準字Z20000138），購于哈藥集團三精千鶴制藥有限公司；30號1寸毫針，購于蘇州天協針灸器械有限公司。

1.2分組及針藥方法 動物隨機分成正常組（A）、模型組（B）、通脈組（C）、針刺組（D）及針藥聯合組（E），每組10只。A組不做任何處理；B組以純凈水10 ml/（kg·d）灌胃；D組與E組于第1次腦缺血后2 h內給予針刺，以后1次/d針刺大椎、百會穴各30 min，每隔5 min捻針1次；C及E組每日給予逐瘀通脈膠囊0.4 g/（kg·d），在第1次腦缺血后2 h內立即灌胃治療，以后1次/d。各組治療均在上午10點左右進行，連續治療5周，大鼠常規飼養自由進食。

1.3模型制備 通過雙側頸總動脈結扎建立腦缺血卒中模型，模型大鼠在l周內分2次，分別在第1天與第7天結扎雙側頸總動脈。術前禁水4 h、禁食12 h，10%水合氯醛（0.3 ml/100 g）腹腔注射麻醉，頸部皮膚消毒，取頸部正中切口，鈍性分離一側迷走神經與頸總動脈，用4號絲線雙重結扎頸總動脈，一側結扎后間隔7 d后進行同法結扎對側頸總動脈。大鼠術后置于保溫毯上至蘇醒，使其肛溫保持在36.5～37 ℃。制作模型過程中未見死亡動物。

1.4腦皮質病理變化觀察 以10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉，開胸暴露心臟，用10號針頭經左心室穿刺至主動脈，固定穿刺針后連接點滴管，剪開右心耳，立即用0.9%生理鹽水快速灌注，直至肝臟顏色變淺、右心房流出清亮色液體時，用4%多聚甲醛先快后慢灌注固定，至大鼠尾巴僵硬，斷頭取腦，冰盤上快速去除腦干、小腦迅速分離出大腦頂葉皮質，肉眼觀察腦皮質病理大體病理改變，10%多聚甲醛室溫固定24 h后，石蠟包埋后連續做冠狀切片，再進行HE染色觀察病理變化。

1.5皮質神經元密度分析 在高倍鏡下觀察大鼠的頂葉皮質區切片，隨機選擇5個高倍視野拍照，用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件進行分析，計數神經元，計算平均數，轉換為單位面積下數值，求出頂葉神經元密度，以“個/mm2”表示。

1.6統計學處理 使用SPSS 17.0軟件進行統計分析，各組數據以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結 果

2.1各組大鼠腦皮質區病理學改變 A組頂葉皮層組織較致密清晰，染色均勻，血管及血管周圍間質形態結構正常，神經元胞質呈淡紅色，胞核藍染，細胞輪廓清楚，形態呈不規則形、顆粒狀或錐體狀，神經細胞的數目較多（圖1A）。B組皮層組織結構紊亂，染色較淡，有壞死軟化病灶，血管及血管周圍間質水腫形態結構異常，部分血管擴張，小動脈出現管壁輕度增厚，可見內彈力膜出現厚薄不一的皺褶，管腔狹窄；血管平滑肌細胞部分增生，胞質輕度濃染，出現外膜膠原纖維增生的早期血管病變，血管內皮細胞部分脫落；神經元變性壞死，數量明顯減少，排列稀疏，錐體細胞層變薄，核變淺，基質疏松及空泡形成，有的神經元中央尼氏小體溶解，核固縮、消失，隱約可見細胞輪廓的死亡細胞形成的鬼影細胞，大部分神經元出現不同程度的變性（圖1B1、圖1B2）。C組皮質神經元分布稍密集，部分染色均勻，錐體細胞層部分較規則，胞體部分突起。血管及其周圍仍有部分水腫，內皮細胞未見脫落（圖1C）。D組神經元數量增多，仍有部分細胞固縮、壞死，可見鬼影細胞，部分錐體細胞脫失，部分血管內皮細胞基本完整，部分小血管水腫減輕（圖1D）。E組頂葉皮層組織神經元分布比較密集，組織結構紊亂及間質水腫減輕，鬼影細胞及細胞壞死明顯減少，細胞變性程度減輕，大部分錐體細胞缺血明顯改善，血管及血管周圍間質水腫改善，小動脈管壁基底膜完整，內皮細胞基本正常（圖1E）。

圖1　各組大鼠腦皮質區病理學改變

2.2 大鼠皮質神經元密度計數 A組、B組、C組、D組與E組神經元平均生存密度計數分別為（338.2±15.6）、（158.7±17.2）、（213.2±14.4）、（184.2±12.5）、（255.5±11.7）個/mm2。與A組比較，B組大鼠皮質神經元生存密度下降，差異有統計學意義（F=8.27，P＜0.05）；與B組比較，C組（F=9.43，P＜0.05）、D組（F=8.85，P＜0.05）及E組（F=9.64， P＜0.05）大鼠神經元生存密度呈上升趨勢，差異有統計學意義；與C組（F=14.02，P＜0.05）及D組（F=19.58，P＜0.05）比較，E組神經元密度明顯增加，差異有統計學意義；但C、D組比較，差異無統計學意義（圖2）。

圖2　各組大鼠皮質神經元密度（個/mm2）

3　討 論

腦卒中是神經內科最常見的疾病之一，患者中大約有80%～85%屬于缺血性腦卒中。腦主要依靠葡萄糖有氧氧化提供能量進行生理活動，對缺氧敏感，缺血時間較長可引起嚴重的不可逆性損傷，即使是短暫的腦缺血也會引起能量代謝異常，并由此引發腦血流恢復后一系列生化反應，導致血管和神經元損傷。谷氨酸、興奮毒性和自由基在引發腦損傷方面發揮了重要作用［3，4］。腦缺血后，過多神經遞質進入突觸間隙，激活了各種鈣離子進入細胞的通道，三磷酸腺苷（adenosine triphosphate， ATP）能量供給衰竭，將鈣離子排出細胞的能量降低，細胞內鈣離子增加，激活各種脂酶，核酸酶和蛋白酶，這些酶在缺血狀態下持續被激活直接引發細胞的結構損傷，改變了白細胞的趨向性以及細胞膜的通透性，這些變化進一步加重了缺血性神經元的損傷，尤其是大量吸附在受損內皮細胞上的白細胞可以進入腦實質，造成缺血后進行性腦細胞損傷。

針刺療法和中藥方劑在治療腦卒中起到了重要作用，針刺可以減輕慢性腦缺血大鼠對腦組織自由基的反應性損傷，降低丙二醛、活性氧活性，提高超氧化物歧化酶等抗氧化作用產物的含量，以及自由基反應酶的活性，抑制腦細胞脂質過氧化、減輕自由基對腦組織的損傷作用［5］；頭穴叢刺對慢性腦缺血后新生血管的形成有一定的促進作用［6］。神經元生存密度越高表明其生存程度越高，神經元變性、壞死及凋亡情況越少。本研究發現模型組大鼠皮層細胞排列稀疏，出現神經元體積縮小、變形等不同程度病理改變，如果細胞壞死后的酶類繼續分解發展，則更進一步導致細胞溶解和消失。通脈組和針刺組較模型組神經元數量雖有所增多，神經元生存密度也見上升，但仍有部分細胞固縮、壞死；逐瘀通脈膠囊聯合針刺組較通脈組和針刺組頂葉皮層神經元生存密度明顯增加，細胞固縮、壞死明顯減少，變性程度減輕。說明逐瘀通脈膠囊聯合針刺可保護腦卒中缺血后皮質神經元的病理損傷，提高神經元生存程度；且逐瘀通脈膠囊聯合針刺優于單一治療組，針藥聯合應用抑制了腦神經細胞缺血缺氧引起的進一步病理改變，改善了腦細胞形態，可能是針刺和藥物療效相加的結果，也可能是針刺穴位后藥物在體內的代謝及吸收過程產生了影響并起到了增效作用，但針藥結合產生增效作用的確切機制并不清楚，這為進一步探索臨床應用針藥聯合治療疾病提供了實驗依據。

［1］郭宏偉，周志鴻，曾樹林，等. 逐瘀通脈膠囊對血管性癡呆患者認知功能及血清脂聯素、超氧化物歧化酶濃度的影響［J］. 中國醫藥指南， 2011， 34（9）： 184-185.

［2］王華政， 王玉祥， 倪浩斌. 針藥結合治療腦梗死后血管性癡呆的臨床療效觀察［J］. 現代診斷與治療， 2015，26（1）： 57-67.

［3］Cappellari M，Tomelleri G， Di Matteo A，et al. Dide-Botcazo syndrome due to bilateral occlusion of posterior cerebral artery ［J］. Neurol Sci， 2010， 31（1）： 99-101.

［4］Allen C L，Bayraktutan U. Oxidative stress and its role in the pathogenesis of ischaemic stroke ［J］. Int J Stroke，2009，4（6）： 461-470.

［5］張文麗，詹宇豪，沈俊明，等.針刺對慢性腦缺血腦皮質區自由基相關指標影響及其機制［J］. 中國醫學創新，2014， 11（15）： 31-33

［6］王春霞，孫遠征.頭穴叢刺法對慢性腦缺血大鼠海馬血管內皮生長因子表達的影響［J］. 針刺研究， 2012， 37（5）： 375-379.

（2015-07-24收稿 2015-08-25修回）

（責任編輯 張亞麗）

Effect of Zhuyu Tongmai capsule combined with acupuncture on pathological changes of cerebral cortex in rats with cerebral apoplexy

ZHAN Yuhao1， WANG Zhihui2， ZHANG Wenli2， WANG Yafei1， LI Qian2， and LI Qi1. 1. Specialty of Acupuncture and Massage，College of Traditional Chinese Medicine， 2. Medical Research Center， North China University of Science and Technology， Tangshan 063000， China

Objective To observe the pathological changes of cerebral cortex in cerebral apoplexy rats after Zhuyu Tongmai capsule combined with acupuncture. Methods 50 healthy male SD rats were randomly divided into five groups： control group （A），model group （B）， capsule group （C）， acupuncture group （D）， and Zhuyu Tongmai capsule combined with acupuncture group （E）. Twovessel method was applied to build cerebral apoplexy models， then the changes of rat brain cortical pathology was observed through HE staining and test survival density of the neuron by using counting software at high magnification image. Results Cells in cerebral cortex are more disordered in group B than in group A under light microscope. There were some necrosis and softening lesions， neurons appeared in different degrees of cell degeneration， and survival density of neurons decreased in group B. Compared with group B， necrosis cells decreased， degeneration degree lessen， blood vessels and interstitial edema around blood vessels turned better， neural survival density increased in group C， D and E. Compared with group C and D， cerebral cortex cells arranged closely， dendrite of some pyramidal cells increased， pathological changes of most ischemic neurons improved， neural density increased significantly in group E. Conclusions Zhuyu Tongmai capsule combined with acupuncture can obviously improve the rats’ cerebral cortex nerve cell pathological changes and increase the neuronal survival density.

Zhuyu Tongmai capsule； stroke； acupuncture

ZHANG Wenli， E-mail: dianj@163.com

R74

10.13919/j.issn.2095-6274.2015.09.007

大學生創新創業計劃項目（校級x2014008，省級國家級201410081030）；河北省中醫藥局項目（2014058）；唐山市科技局項目（13130293z）

詹宇豪，本科在讀，E-mail： 815152835@qq.com

063000 唐山，華北理工大學：1.中醫學院針灸推拿專業，2.醫學實驗研究中心

張文麗，E-mail： dianj@163.com