荷包豬SLA-DRB基因cDNA的克隆及分子進(jìn)化特征分析

姜平額爾敦木圖高鳳山

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010018；2.大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，大連 116622）

荷包豬SLA-DRB基因cDNA的克隆及分子進(jìn)化特征分析

姜平1，2額爾敦木圖1高鳳山1，2

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010018；2.大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，大連 116622）

旨在研究荷包豬SLA-DRB基因的分子特征，設(shè)計(jì)引物用RT-PCR擴(kuò)增3頭荷包豬DRB基因cDNA，并克隆至pMD18-T Vector，陽(yáng)性克隆測(cè)序并做序列分析，分別進(jìn)行同源性、分子進(jìn)化及主要氨基酸變異位點(diǎn)分析。結(jié)果表明，成功從3頭荷包豬中擴(kuò)增得到SLA-DRB基因，分別命名為SLA-DRB-HB01-03，經(jīng)序列測(cè)定后，證實(shí)cDNA全長(zhǎng)為836 bp，其中1-801為ORF區(qū)，共編碼266個(gè)氨基酸。同源性分析顯示，SLA-DRB-HB與其他SLA-DRB等位基因的同源性介于90.3%-99.8%之間。分子進(jìn)化分析表明，荷包豬SLA-DRB-HB獨(dú)立分支，與其他等位基因相比較，進(jìn)化更加原始。氨基酸變異位點(diǎn)和多態(tài)性分析結(jié)果顯示，SLA-DRBHB本身存在一定的多態(tài)性。

荷包豬；SLA-DRB；分子進(jìn)化；多態(tài)性

動(dòng)物識(shí)別自己、排除非己以維持機(jī)體正常生理活動(dòng)和抵抗疾病的能力是免疫系統(tǒng)的核心職能。這種能力很大程度上是由各物種的主要組織相容性抗原復(fù)合體（Major histocompatibility complex，MHC）基因所決定［1］。豬的主要組織相容性復(fù)合體又稱(chēng)豬的白細(xì)胞抗原（Swine lymphocyte antigen，SLA），由Vaiman等［2］和Viza等［3］于1970年首次發(fā)現(xiàn)。Rabin等［4］發(fā)現(xiàn)其定位于豬的第7號(hào)染色體上；Geffrotin等［5，6］用原位雜交、染色體標(biāo)記和基因間常規(guī)連鎖分析，進(jìn)一步確定SLA基因位于第7號(hào)染色體的短臂上。目前SLA可分為3個(gè)主要類(lèi)群：Ⅰ類(lèi)區(qū)域基因、Ⅱ類(lèi)區(qū)域基因和Ⅲ類(lèi)區(qū)域基因［7］。其中，Ⅱ類(lèi)基因位于SLA-D區(qū)，它控制著機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答，并在調(diào)節(jié)機(jī)體的抗病能力方面起到非常重要的作用［8］。

SLA Ⅱ類(lèi)基因主要包括DRa、DRb、DQa、DQb、Dob、Dpa、TAP、LMP等。Ⅱ類(lèi)基因有α和β兩種基因，分別編碼α肽鏈和β肽鏈。SLAⅡ類(lèi)也包含多種基因座，其中只有SLA-DR和SLA-DQ在蛋白質(zhì)水平上進(jìn)行表達(dá)。SLA-DR分子是跨膜異二聚體，它由一條約34 kD的α鏈與一條約29 kD的β鏈以非共價(jià)鍵結(jié)合而成，每一條鏈分為3個(gè)區(qū)，N端的胞外區(qū)、中間的穿膜區(qū)和C端的胞質(zhì)區(qū)［9］。其中穿膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)與Ⅰ類(lèi)分子的相應(yīng)結(jié)構(gòu)類(lèi)似，而胞外區(qū)則不同，該區(qū)可分為兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，在α鏈上為α1和α2，β鏈上為β1和β2（α和β鏈均包含約90個(gè)氨基酸殘基），與免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)類(lèi)似。α1和β1，特別是β1有較高的可變性，故呈現(xiàn)較高多態(tài)性，這樣有利于機(jī)體適應(yīng)不同外來(lái)抗原。α1和β1各形成4條β折疊股和1條α螺旋，8條β折疊股組成一個(gè)底層，支撐2個(gè)α螺旋，α鏈和β鏈2個(gè)α螺旋形成肽結(jié)合區(qū)（PBD）深槽的側(cè)面?？缒て斡?5個(gè)疏水性氨基酸殘基組成，可能形成α螺旋穿過(guò)脂質(zhì)雙分子層，并使分子固定在細(xì)胞膜上［10］。

荷包豬是遼寧省特有的珍貴地方品種，也是國(guó)家級(jí)的種質(zhì)資源保護(hù)品種，已被列入《國(guó)家畜禽品種資源保護(hù)名錄》［11］。荷包豬由于其地處遼西交通不便的山區(qū)一帶——葫蘆島市建昌縣和朝陽(yáng)市凌源、喀左、朝陽(yáng)三縣與建昌接壤的地方，長(zhǎng)期進(jìn)行自繁自育，原始進(jìn)化，因而推測(cè)其基因進(jìn)化程度不高，穩(wěn)定的基因特征非常適合作為科學(xué)研究的模式實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。目前為止，已經(jīng)成功地克隆了荷包豬SLA-Ⅰ類(lèi)基因全部序列，并分析了其分子進(jìn)化特征［12］。為了更全面地研究荷包豬的SLA分子進(jìn)化特征，有必要研究其他SLA功能基因。為此，本研究將選擇SLA-DR基因?yàn)檠芯繉?duì)象，克隆其β鏈序列，對(duì)其進(jìn)行分子進(jìn)化和氨基酸變異位點(diǎn)多態(tài)性分析，旨在為全面解析SLA-Ⅱ類(lèi)分子的進(jìn)化特征提供新的數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料 荷包豬脾臟（3個(gè)個(gè)體）（遼寧省畜牧科學(xué)研究院荷包豬保種場(chǎng)）。

1.1.2 主要試劑 pMD18-T Vector，E. coli JM109，總核酸提取試劑盒TRIZOL，反轉(zhuǎn)錄試劑盒Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-），DNA回收試劑盒Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0，EcoRⅠ及Hind Ⅲ限制性?xún)?nèi)切酶均為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 擴(kuò)增荷包豬SLA-DRB的引物的設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)：上游引物：DRBF1：5'-GTTCTCCAGCATGTTGCATCTGTG-3'；下游引物：DRBR1：5'-AGAGGATGCTTGCTTGGAGTCTC-3'。

1.2.2 總RNA提取及RT-PCR 采用TRIZOL試劑盒并按照文獻(xiàn)［13］方法從脾臟提取總RNA。然后以O(shè)ligo（dT）作為引物，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明將核酸反轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后以引物DRBF1/DRBR1擴(kuò)增SLA-DRB，PCR程序?yàn)椋?4℃ 3 min；94℃ 1 min，65℃ 1 min，72℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。擴(kuò)增PCR產(chǎn)物經(jīng)純化試劑盒回收。

1.2.3 基因克隆及重組子篩選 將純化后的SLADRB分別與pMD18-T載體連接，并轉(zhuǎn)化宿主菌JM109。重組菌用含Amp的LB培養(yǎng)基進(jìn)行抗性篩選，堿裂解法提質(zhì)粒，EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳分析［14］。

1.2.4 序列測(cè)定與分析 通過(guò)將培養(yǎng)得到的3個(gè)體陽(yáng)性克隆送至上海生工測(cè)序，將獲得的3個(gè)個(gè)體的SLA-DRB基因cDNA分別命名為：SLA-DRB-HB01、SLA-DRB-HB02和SLA-DRB-HB03，應(yīng)用GENTYX9.0（Software Development co.，Ltd）軟件進(jìn)行拼接，序列通過(guò)SAKURA系統(tǒng)登錄入DDBJ/GenBank。

1.2.5 SLA-DRB同源性分析 從DDBJ/EMBL/Gen-Bank中搜索所有SLA-DRB各等位基因cDNA全序列，見(jiàn)表1。用DNAMAN Version 5.2.2（Lynnon Biosoft）對(duì)各等位基因之間氨基酸序列進(jìn)行比較，按照文獻(xiàn)［15］所述方法并略作改動(dòng)進(jìn)行關(guān)鍵位點(diǎn)氨基酸置換率的計(jì)算和統(tǒng)計(jì)。之后應(yīng)用DNAStar 7.2分析各等位基因之間核酸序列同源性。

表1 DDBJ/EMBL/GenBank中SLA-DRB基因

1.2.6 SLA-DRB分子進(jìn)化研究 以人的HLA-DRB3（U66825）為參照，運(yùn)用DNAMAN Version 5.2.2（Lynnon Biosoft） 和Mega5.0軟 件（Mega software co.，Ltd）的Neighbor-Joining法繪制SLA-DRB各等位基因之間分子進(jìn)化樹(shù)。

1.2.7 SLA-DRB多態(tài)性分析 首先通過(guò)獲得荷包豬SLA-DRB基因序列推導(dǎo)其氨基酸序列，應(yīng)用DNAMAN對(duì)獲得的3個(gè)個(gè)體的氨基酸序列的主要氨基酸變異位點(diǎn)進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)其變異位點(diǎn)。然后與從GenBank中獲得人的經(jīng)典HLA-DRB基因序列推導(dǎo)獲得的氨基酸序列，以HLA-DRB多態(tài)性位點(diǎn)作為參照，分析荷包豬SLA-DRB-HB的多態(tài)性。

2 結(jié)果

2.1 豬SLA-DRB基因座的克隆

3個(gè)個(gè)體的RNA利用引物DRBF1/DRBR1經(jīng) RT-PCR得到大約800 bp的條帶，與理論計(jì)算值836 bp大小相符合，產(chǎn)物命名為SLA-DRB-HB01、SLA-DRB-HB02和SLA-DRB-HB03，（圖1-A）。分別將SLA-DRB-HB01-03克隆入pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化JM109，培養(yǎng)后用堿裂解法提質(zhì)粒，EcoR Ⅰ和HindⅢ雙酶切篩選和鑒定，證實(shí)插入片段與目的基因大小相符（圖1-B）。

2.2 豬SLA-DRB基因座序列測(cè)定

經(jīng)序列測(cè)定和GENTYX9.0（Software Development co.，Ltd）軟件分析，SLA-DRB-HB長(zhǎng)度為836 bp，其中1-801為ORF區(qū)，共編碼266個(gè)氨基酸。3個(gè)個(gè)體SLA-DRB-HB01、SLA-DRB-HB02、SLA-DRBHB03序列分別提交至GenBank，獲得序列號(hào)分別為L(zhǎng)C20542、LC20543和LC20544。

2.3 豬SLA-DRB基因座序列比較與分析

經(jīng)與DDBJ/EMBL/GenBank上所有SLA-DRB序列比較，發(fā)現(xiàn)SLA-DRB-HB推導(dǎo)的氨基酸序列與其它SLA-DRB等位基因的突變位點(diǎn)主要集中在信號(hào)肽區(qū)（1-29）、β1區(qū)（30-123） 和β2區(qū)（124-217）。其中信號(hào)肽區(qū)超過(guò)4個(gè)等位基因發(fā)生氨基酸突變的位點(diǎn)包括2、10、11、17、18和19。在β1區(qū)超過(guò)4個(gè)以上等位基因發(fā)生氨基酸突變的位點(diǎn)有27個(gè)。β2區(qū)突變位點(diǎn)有11個(gè)，然而超過(guò)4個(gè)等位基因發(fā)生突變的位點(diǎn)只有201位。穿膜和胞漿功能區(qū)（218-226）變異位點(diǎn)共有6個(gè)，其中只有第232位超過(guò)4個(gè)等位基因發(fā)生氨基酸位點(diǎn)突變（圖2）。

圖1 PCR擴(kuò)增SLA-DRB-HB基因（A）及雙酶切鑒定（B）

2.4 SLA-DRB各等位基因之間氨基酸置換率分析

經(jīng)計(jì)算各等位基因主要位點(diǎn)氨基酸置換率，發(fā)現(xiàn)變異主要集中在β1區(qū)，其中置換率超過(guò)0.5的有13個(gè)位點(diǎn)，置換率超過(guò)1的有5個(gè)位點(diǎn)。β2只有一個(gè)位點(diǎn)置換率超過(guò)0.5。其余的功能區(qū)氨基酸置換率均在0.5以下（圖3）。

2.5 SLA-DRB-HB與SLA-DRB各等位基因同源關(guān)系分析

SLA-DRB-HB與其它SLA-DRB序列通過(guò)DNAStar 7.2進(jìn)行同源比較和分析，同源性在90.3%-99.8%之間。其中與美國(guó)辛克萊Sinclair品系A(chǔ)Y135575和中國(guó)Taihu品系A(chǔ)Y243103同源性最高，均達(dá)到了99.8%，與AY135581同源性最低，僅為90.3%（圖4）。

2.6 SLA-DRB種內(nèi)分子進(jìn)化特征分析

根據(jù)豬SLA-DRB-HB各等位基因以及所有SLADRB等位基因，利用DNAMAN和Mega5.0軟件繪制SLA-DRB-HB基因的分子進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果（圖5）顯示，荷包豬3個(gè)個(gè)體SLA-DRB-HB聚類(lèi)成一個(gè)遺傳關(guān)系最近的家族，其中SLA-DRB-HB01和SLA-DRB-HB02相對(duì)接近。荷包豬與我國(guó)貴州SLA-DRB-AY102480、美國(guó)的Sinclair品系SLA-DRB-AY24135575-Sinclair以及我國(guó)的太湖SLA-DRB-AY243103遺傳關(guān)系相對(duì)接近，而與我國(guó)的五指山品系SLA-DRB-DQ395123以及韓國(guó)的SLA-DRB*1101-DQ883225遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.7 荷包豬SLA-DR-HB多態(tài)性分析

2.7.1 SLA-DRB-HB 分子內(nèi)可能的變異位點(diǎn)比較將SLA-DRB-HB 3個(gè)等位基因利用DNAMAN進(jìn)行序列比較分析，結(jié)果（表2）發(fā)現(xiàn)變異主要集中在β1和β2區(qū)，其中β1區(qū)存在5個(gè)變異位點(diǎn)，分別是38（S→ F）、53（V→ M）、57（D→ E）、69（S→F→L）和116（D→V）；β2區(qū)也有5個(gè)位點(diǎn)發(fā)生變異，分別在128（A→V）、130（V→A）、158（A→ V）、174（A→ T）、183（A→ T） 和 213（V→A）；而穿膜區(qū)則僅出現(xiàn)了1個(gè)變異位點(diǎn)，265位（P→L）。

2.7.2 SLA-DRB-HB 與人HLA-DRB多態(tài)性位點(diǎn)比較分析 SLA-DRB-HB經(jīng)過(guò)與人HLA-DRB相比較，發(fā)現(xiàn)在人DRB β1區(qū)17個(gè)典型的多態(tài)性氨基酸殘基位點(diǎn)中，SLA-DRB-HB只有1個(gè)位點(diǎn)（β25）保留，而參照序列保留了4個(gè)位點(diǎn)（β25、β28、β30和β31）（圖6）。

3 討論

本研究克隆的荷包豬SLA-DRB-HB基因，與DDBJ/EMBL/GenBank上所有SLA-DRB序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)SLA-DRB-HB推導(dǎo)的氨基酸序列與其他SLA-DRB等位基因的突變位點(diǎn)主要集中在β1區(qū)（30-123）和β2區(qū)（124-217）。經(jīng)過(guò)氨基酸置換率分析，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)氨基酸置換率高的位點(diǎn)均分布在β1區(qū)。β1區(qū)的氨基酸突變主要集中在37-42以及52-60，該研究結(jié)果與之前的報(bào)道基本一致［21］。而β1區(qū)是承擔(dān)SLA II類(lèi)分子抗原多肽結(jié)合與遞呈的功能區(qū)［16］，從結(jié)果可以推測(cè)β1區(qū)某些關(guān)鍵的氨基酸位點(diǎn)或區(qū)域由于不斷與不同抗原多肽結(jié)合，在進(jìn)化上造成選擇壓力，從而導(dǎo)致氨基酸位點(diǎn)突變。因此，β1區(qū)的37-42以及52-60非常可能與抗原多肽結(jié)合及遞呈有關(guān)。

圖2 SLA-DRB-HB與DDBJ/EMBL/GenBank上其他SLA-DRB的多重序列比較

SLA-DRB-HB與SLA-DRB其他等位基因同源性比較，同源率介于90.3%-99.8%之間。其中與美國(guó)辛克萊Sinclair品系 AY135575和中國(guó)的Taihu品系A(chǔ)Y243103同源性最高，均達(dá)到了99.8%，而與AY135581的同源性最低，只有90.3%。結(jié)果說(shuō)明荷包豬很可能與美國(guó)辛克萊Sinclair品或中國(guó)的Taihu豬在進(jìn)化上或遺傳上具有某種聯(lián)系。

從分子進(jìn)化樹(shù)中發(fā)現(xiàn)，在人HLA-DRB作為參照的情況下，SLA-DRB-HB在遺傳關(guān)系上位于SLADRB基因家族的較遠(yuǎn)分支且獨(dú)立成一支。說(shuō)明該基因與其他SAL-DRB具有相對(duì)遠(yuǎn)的遺傳距離和親緣關(guān)系，是SLA-DRB等位基因家族的一個(gè)遠(yuǎn)系成員，進(jìn)化比較緩慢。其中，SLA-DRB-HB與我國(guó)貴州SLA-DRB-AY102480、美國(guó)的Sinclair品系SLADRB-AY24135575-Sinclair以及我國(guó)的太湖SLA-DRBAY243103遺傳關(guān)系相對(duì)接近，基本上與上述同源性分析的結(jié)果一致，荷包豬是否與這些同源性和進(jìn)化關(guān)系密切的品種存在共同的祖先，有待于進(jìn)一步調(diào)查。經(jīng)分析，該荷包豬只分布于我國(guó)遼寧省偏僻的山區(qū)，這種原始低等進(jìn)化的分子特征是由于地理生殖隔絕造成的［22］。今后，可以以荷包豬為選配品種，進(jìn)行優(yōu)化育種，而本研究為今后荷包豬的遺傳育種提供基因方面的參考數(shù)據(jù)。

圖3 SLA-DRB各等位基因氨基酸置換率

圖4 SLA-DRB-HB與其他SLA-DRB同源性比對(duì)

通過(guò)對(duì)3個(gè)個(gè)體SLA-DRB-HB的氨基酸序列進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，主要變異位點(diǎn)集中在β1區(qū)和β2區(qū)，而且這些位點(diǎn)比較分散，只有2個(gè)變異位點(diǎn)（38和57）位于β1區(qū)的37-42和52-60，另外還有一個(gè)位點(diǎn)位于胞質(zhì)區(qū)。推測(cè)這些變異位點(diǎn)并不是由于在進(jìn)化過(guò)程中不斷接觸不同的抗原肽形成選擇壓力等造成的，而可能是存在其他外來(lái)因素，如在該品系進(jìn)化過(guò)程中某一階段有過(guò)與其他品種發(fā)生雜交等造成。進(jìn)一步分析荷包豬SLA-DRB-HB與人HLA-DRB主要多態(tài)性位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，荷包豬只保留了1個(gè)人HLA-DRB的典型多態(tài)性位點(diǎn)［23］，而參照序列保留了4個(gè)。該結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明荷包豬與人的親緣關(guān)系相對(duì)于其他品系更遠(yuǎn)，亦即其進(jìn)化更原始，該結(jié)論與之前對(duì)荷包豬的研究所得出的結(jié)論基本一致［24］。該結(jié)果也揭示作為進(jìn)化更原始的荷包豬，其基因資源非常寶貴，適合于作科學(xué)研究的模型材料。

4 結(jié)論

本研究成功克隆了荷包豬SLA-DRB-HB三個(gè)等位基因，獲得基因序列號(hào)，序列分析證明荷包豬的SLA-DRB相對(duì)于其他品系豬基因進(jìn)化比較原始。

圖5 SLA-DRB-HB各等位基因的分子內(nèi)關(guān)系進(jìn)化樹(shù)

表2 比較SLA-DRB-HB各等位基因的氨基酸變異位點(diǎn)

圖6 SLA-DRB-HB與人HLA-DRB β1多態(tài)性位點(diǎn)比較

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

The Cloning of cDNA of SLA-DRB from Hebao Pigs and the Analysis of Their Molecular Evolutionary Characteristics

Jiang Ping1，2Erdemtu1Gao Fengshan1，2
（1. College of Veterinary Medicine，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010018；2. College of Life Science and Technology，Dalian University，Dalian 116622）

In order to study the molecular characteristics of SLA-DRB derived from Hebao pigs， a pair of primers were designed to amplify the cDNA of SLA-DRB from 3 Hebao pigs. Then the amplified cDNA were cloned into pMD18-T vector and the positive clones were sequenced and analyzed by homology comparing， molecular evolution analysis， and comparing and analyzing the key amino acid sites. It was shown that the SLA-DRB alleles were amplified successfully from the tissues of the 3 Hebao pigs， and the alleles were designated as SLA-DRB-HB01， 02， and 03. After sequencing， the results showed that the cDNA of SLA-DRB-HB alleles was 836 bp， and the open reading fragments（ORF）of SLADRB-HB locating at sites of 1-801， encoding 266 amino acids. By homology analyzing， the SLA-DRB-HB genes had a homology value of 90.3%-99.8% with other SLA-DRB alleles. The analysis of molecular evolution showed that the SLA-DRB-HB alleles were clustered an independent branch of phylogenetic tree， and SLA-DRB-HB evolved more primarily in contrast to other SLA-DRB alleles. The analysis of the mutated amino acids sites and the polymorphism of SLA-DRB-HB demonstrated that they had polymorphism.

Hebao pig；SLA-DRB；molecular evolution；polymorphism

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.022

2015-04-04

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31172304），遼寧省博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目（20081078）

姜平，女，碩士，研究方向：動(dòng)物解剖學(xué)與免疫學(xué)；E-mail：1224763183 @qq.com

高鳳山，男，博士，教授，研究方向：基因工程和動(dòng)物分子免疫學(xué)；E-mail：gfsh0626@126.com額爾敦木圖，男，博士，教授，研究方向：動(dòng)物解剖學(xué)與黏膜免疫學(xué)；E-mail：erdemtu962@sina.com