中華稻蝗總RNA的提取及鑒定

魏福倫　徐曉舒　黃敏

摘要：提取中華稻蝗（Oxya chinensis）的總RNA，利用瓊脂糖凝膠電泳、RT-PCR、AChE片段的擴增等方法鑒定RNA的純度和完整性。結果表明，從中華稻蝗頭部提取的總RNA質量和完整性較好，能滿足后續分子生物學的研究需要。

關鍵詞：中華稻蝗（Oxya chinensis）；RNA；提取；鑒定

中圖分類號： 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）19-4862-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.19.054

Abstract： The total RNA from Oxya chinensis was extracted. The purity and integrity was detection by agarose gel electrophoresis， ultraviolet spectroscopy， reverse transcription polymerase chain reaction， and acetylcholin esterase fragment amplification. The results showed that quality and intergrity of extracted total RNA was good， and could statisfy need for follow-up molecular biology research.

Key words： Oxya chinensis； acetylcholin esterase； RNA； extraction； identification

乙酰膽堿酯酶（Acetylcholin esterase，AChE）是生物神經傳導中的一種關鍵酶，在神經傳導中執行著重要的功能。該酶能降解乙酰膽堿，終止神經遞質對于突觸后膜的興奮刺激作用，保證神經信號分子在生物體內的正常傳導。AChE上存在有機磷與氨基甲酸酯類化合物的結合位點，當這兩類化合物與AChE結合后，會造成酶催化部位的磷酰化與氨基甲酰化，使其對乙酰膽堿無法進行乙酰化作用，從而破壞了神經的正常傳導作用，使乙酰膽堿與神經后膜的乙酰膽堿受體的作用無法終止，造成生物長期處于神經興奮狀態而最終導致死亡。為了研究乙酰膽堿酯酶的具體作用機制，將AChE應用于害蟲的抗藥性研究及檢測環境中的有機磷與氨基甲酸酯類農藥，證實昆蟲AChE的突變會導致藥物抗性的產生[1]。

中華稻蝗（Oxya chinensis）隸屬于直翅目（Orthoptera）斑腿蝗科（Catantopidae）稻蝗屬（Oxya），在我國除新疆、西藏等少數地區外，大多數水稻種植區均有分布，多棲息于稻田等濕度較大的地方，以禾本科農作物為食，是我國重要的農業害蟲[2，3]，給農業生產帶來了極大的危害。近年來，對中華稻蝗的研究工作主要集中在形態分類學[3]、細胞分類學[4]、生理與發育[5，6]、分子系統學[7]和農藥毒理學[8]等方面，而從RNA的角度研究乙酰膽堿酯酶的表達尚未見相關報道。動物組織中總RNA的提取是分子生物學基本技術之一，高質量RNA是進行RT-PCR、cDNA文庫構建、Northern blot等分子生物學研究的基礎。在RNA提取過程中，由于RNase非常穩定，極易導致RNA降解，要獲得純度高、完整性好的高質量RNA有一定的難度。本研究提取了中華稻蝗的總RNA，再利用半定量逆轉錄聚合酶鏈式反應（Reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）技術進行了鑒定，以期對后續的研究奠定良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料 試驗用中華稻蝗的成蟲，采自貴州省遵義市。

1.1.2 試劑 總RNA提取試劑盒和RT-PCR試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司，焦碳酸二乙酯（DEPC）購自生工生物工程（上海）有限公司，其他試劑均為國產分析純。試劑均用0.1%的DEPC水配制，塑料耗材用0.1%的DEPC水處理過夜后濕熱高溫滅菌，研缽等器皿在180 ℃烘烤6 h以上，以避免RNA酶的污染。RT-PCR引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取 取4只中華稻蝗成蟲，分別取其頭部、胸部、腹部，除翅膀外的全蟲，分別提取其總RNA，按試劑盒說明書的方法提取。將提取的RNA稀釋50倍后，用T8紫外可見分光光度計測定OD260 nm/OD280 nm的比值。再取5 μL RNA，加入6×上樣緩沖液，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳完后觀察結果并拍照。

1.2.2 cDNA的檢測 按RT-PCR試劑盒的使用說明，將中華稻蝗的總RNA反轉錄成cDNA，作為PCR檢測的模板。選用中華稻蝗持家基因actin基因進行PCR，以驗證提取的RNA是否可用，使用的引物為P1： 5′-CACCAGGGTGTGATGGTCGG-3′，P2： 5′-CCACCGATCCAGACGGAGT-3′，目標片段大約為600 bp，PCR擴增體系（25 μL）：10 μmol/L上下游引物各1 μL，Taq 酶 0.5 μL，dNTPs 2 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，模板DNA 1μL，ddH2O 17 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性50 s，59 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃延伸5 min。PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測并拍照。

1.2.3 AchE基因cDNA片段的擴增 在NCBI的GenBank的數據庫中查找與中華稻蝗親緣關系近的物種的乙酰膽堿酯酶cDNA序列，用Clustal X進行同源性比較，利用Primer premier 5.0設計出3對簡并引物（表1）。將設計的3對引物分別用于PCR擴增，擴增程序為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性50 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，30個循環；72 ℃延伸5 min。PCR產物用1%的瓊脂糖進行電泳，電泳完后觀察結果并拍照。endprint

2 結果與分析

2.1 總RNA的質量與純度

將中華稻蝗頭部提取的總RNA樣品稀釋后，瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳條帶清晰，可見28S RNA、18S RNA兩條帶，且拖尾現象不明顯，說明提取的RNA完整性較好，蛋白質污染較少（圖1）。經紫外分光光度法檢測RNA樣品吸光度，OD260 nm/OD280 nm為1.9，表明提取的RNA樣品中蛋白質等雜質含量較低。其余部位提取的總RNA樣品質量及純度較差。

2.2 cDNA的檢測結果

對中華稻蝗頭部所提取的總RNA進行PCR檢測，目的條帶清晰，與預期大小一致（約600 bp）（圖2）。結果表明，從中華稻蝗頭部所提取的RNA質量和完整性都較好，可以滿足后續分子生物學試驗的要求。

2.3 AChE基因cDNA片段擴增結果

由圖3可以看出，用設計的3對引物擴增AChE基因片段，僅F3、R3擴增出一條1 000 bp以上的條帶。

3 小結與討論

昆蟲中AChE主要分布在由腦、食道下神經節、腹神經索組成的中樞神經系統中。在總RNA提取時，取中華稻蝗成蟲的頭部、胸部、腹部和除翅膀外的全蟲，分別提取其總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法檢測其質量和含量。經瓊脂糖凝膠電泳檢測，從中華稻蝗頭部提取的總RNA無明顯降解現象，總RNA質量、完整性良好。

對逆轉錄的cDNA進行檢測時，本試驗使用的內參基因是β-actin，目的條帶清晰，位置正確（約600 bp），說明cDNA模板的質量較好。對逆轉錄的cDNA進行后續試驗，即AChE片段擴增，其中F3、R3擴增出大于1 000 bp的片段，與預期結果一致。

綜上所述，經過瓊脂糖凝膠電泳，再進一步經過內參基因檢測和AChE片段的擴增檢驗，證明從中華稻蝗頭部提取的總RNA質量、完整性良好，可用于RT-PCR、cDNA文庫構建、Northern blot等后續分子生物學試驗。

參考文獻：

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[2] 馮祥和，牛澤民.中華稻蝗在水稻上危害損失及防治指標研究的商榷[J].昆蟲知識，1994，31（4）：198-200.

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[4] 馬恩波，白貴榮，郭亞平，等.斑腿蝗科精小管形態及其分類學意義探討[J].動物學報，2001，47（S）：30-35.

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