中華稻蝗總RNA的提取及鑒定

魏福倫　徐曉舒　黃敏

摘要：提取中華稻蝗（Oxya chinensis）的總RNA，利用瓊脂糖凝膠電泳、RT-PCR、AChE片段的擴(kuò)增等方法鑒定RNA的純度和完整性。結(jié)果表明，從中華稻蝗頭部提取的總RNA質(zhì)量和完整性較好，能滿足后續(xù)分子生物學(xué)的研究需要。

關(guān)鍵詞：中華稻蝗（Oxya chinensis）；RNA；提取；鑒定

中圖分類號： 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）19-4862-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.19.054

Abstract： The total RNA from Oxya chinensis was extracted. The purity and integrity was detection by agarose gel electrophoresis， ultraviolet spectroscopy， reverse transcription polymerase chain reaction， and acetylcholin esterase fragment amplification. The results showed that quality and intergrity of extracted total RNA was good， and could statisfy need for follow-up molecular biology research.

Key words： Oxya chinensis； acetylcholin esterase； RNA； extraction； identification

乙酰膽堿酯酶（Acetylcholin esterase，AChE）是生物神經(jīng)傳導(dǎo)中的一種關(guān)鍵酶，在神經(jīng)傳導(dǎo)中執(zhí)行著重要的功能。該酶能降解乙酰膽堿，終止神經(jīng)遞質(zhì)對于突觸后膜的興奮刺激作用，保證神經(jīng)信號分子在生物體內(nèi)的正常傳導(dǎo)。AChE上存在有機(jī)磷與氨基甲酸酯類化合物的結(jié)合位點，當(dāng)這兩類化合物與AChE結(jié)合后，會造成酶催化部位的磷酰化與氨基甲酰化，使其對乙酰膽堿無法進(jìn)行乙酰化作用，從而破壞了神經(jīng)的正常傳導(dǎo)作用，使乙酰膽堿與神經(jīng)后膜的乙酰膽堿受體的作用無法終止，造成生物長期處于神經(jīng)興奮狀態(tài)而最終導(dǎo)致死亡。為了研究乙酰膽堿酯酶的具體作用機(jī)制，將AChE應(yīng)用于害蟲的抗藥性研究及檢測環(huán)境中的有機(jī)磷與氨基甲酸酯類農(nóng)藥，證實昆蟲AChE的突變會導(dǎo)致藥物抗性的產(chǎn)生[1]。

中華稻蝗（Oxya chinensis）隸屬于直翅目（Orthoptera）斑腿蝗科（Catantopidae）稻蝗屬（Oxya），在我國除新疆、西藏等少數(shù)地區(qū)外，大多數(shù)水稻種植區(qū)均有分布，多棲息于稻田等濕度較大的地方，以禾本科農(nóng)作物為食，是我國重要的農(nóng)業(yè)害蟲[2，3]，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了極大的危害。近年來，對中華稻蝗的研究工作主要集中在形態(tài)分類學(xué)[3]、細(xì)胞分類學(xué)[4]、生理與發(fā)育[5，6]、分子系統(tǒng)學(xué)[7]和農(nóng)藥毒理學(xué)[8]等方面，而從RNA的角度研究乙酰膽堿酯酶的表達(dá)尚未見相關(guān)報道。動物組織中總RNA的提取是分子生物學(xué)基本技術(shù)之一，高質(zhì)量RNA是進(jìn)行RT-PCR、cDNA文庫構(gòu)建、Northern blot等分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)。在RNA提取過程中，由于RNase非常穩(wěn)定，極易導(dǎo)致RNA降解，要獲得純度高、完整性好的高質(zhì)量RNA有一定的難度。本研究提取了中華稻蝗的總RNA，再利用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）技術(shù)進(jìn)行了鑒定，以期對后續(xù)的研究奠定良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料 試驗用中華稻蝗的成蟲，采自貴州省遵義市。

1.1.2 試劑 總RNA提取試劑盒和RT-PCR試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，焦碳酸二乙酯（DEPC）購自生工生物工程（上海）有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。試劑均用0.1%的DEPC水配制，塑料耗材用0.1%的DEPC水處理過夜后濕熱高溫滅菌，研缽等器皿在180 ℃烘烤6 h以上，以避免RNA酶的污染。RT-PCR引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取 取4只中華稻蝗成蟲，分別取其頭部、胸部、腹部，除翅膀外的全蟲，分別提取其總RNA，按試劑盒說明書的方法提取。將提取的RNA稀釋50倍后，用T8紫外可見分光光度計測定OD260 nm/OD280 nm的比值。再取5 μL RNA，加入6×上樣緩沖液，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳完后觀察結(jié)果并拍照。

1.2.2 cDNA的檢測 按RT-PCR試劑盒的使用說明，將中華稻蝗的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，作為PCR檢測的模板。選用中華稻蝗持家基因actin基因進(jìn)行PCR，以驗證提取的RNA是否可用，使用的引物為P1： 5′-CACCAGGGTGTGATGGTCGG-3′，P2： 5′-CCACCGATCCAGACGGAGT-3′，目標(biāo)片段大約為600 bp，PCR擴(kuò)增體系（25 μL）：10 μmol/L上下游引物各1 μL，Taq 酶 0.5 μL，dNTPs 2 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，模板DNA 1μL，ddH2O 17 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，59 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測并拍照。

1.2.3 AchE基因cDNA片段的擴(kuò)增 在NCBI的GenBank的數(shù)據(jù)庫中查找與中華稻蝗親緣關(guān)系近的物種的乙酰膽堿酯酶cDNA序列，用Clustal X進(jìn)行同源性比較，利用Primer premier 5.0設(shè)計出3對簡并引物（表1）。將設(shè)計的3對引物分別用于PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性50 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖進(jìn)行電泳，電泳完后觀察結(jié)果并拍照。endprint

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的質(zhì)量與純度

將中華稻蝗頭部提取的總RNA樣品稀釋后，瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳條帶清晰，可見28S RNA、18S RNA兩條帶，且拖尾現(xiàn)象不明顯，說明提取的RNA完整性較好，蛋白質(zhì)污染較少（圖1）。經(jīng)紫外分光光度法檢測RNA樣品吸光度，OD260 nm/OD280 nm為1.9，表明提取的RNA樣品中蛋白質(zhì)等雜質(zhì)含量較低。其余部位提取的總RNA樣品質(zhì)量及純度較差。

2.2 cDNA的檢測結(jié)果

對中華稻蝗頭部所提取的總RNA進(jìn)行PCR檢測，目的條帶清晰，與預(yù)期大小一致（約600 bp）（圖2）。結(jié)果表明，從中華稻蝗頭部所提取的RNA質(zhì)量和完整性都較好，可以滿足后續(xù)分子生物學(xué)試驗的要求。

2.3 AChE基因cDNA片段擴(kuò)增結(jié)果

由圖3可以看出，用設(shè)計的3對引物擴(kuò)增AChE基因片段，僅F3、R3擴(kuò)增出一條1 000 bp以上的條帶。

3 小結(jié)與討論

昆蟲中AChE主要分布在由腦、食道下神經(jīng)節(jié)、腹神經(jīng)索組成的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。在總RNA提取時，取中華稻蝗成蟲的頭部、胸部、腹部和除翅膀外的全蟲，分別提取其總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法檢測其質(zhì)量和含量。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，從中華稻蝗頭部提取的總RNA無明顯降解現(xiàn)象，總RNA質(zhì)量、完整性良好。

對逆轉(zhuǎn)錄的cDNA進(jìn)行檢測時，本試驗使用的內(nèi)參基因是β-actin，目的條帶清晰，位置正確（約600 bp），說明cDNA模板的質(zhì)量較好。對逆轉(zhuǎn)錄的cDNA進(jìn)行后續(xù)試驗，即AChE片段擴(kuò)增，其中F3、R3擴(kuò)增出大于1 000 bp的片段，與預(yù)期結(jié)果一致。

綜上所述，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳，再進(jìn)一步經(jīng)過內(nèi)參基因檢測和AChE片段的擴(kuò)增檢驗，證明從中華稻蝗頭部提取的總RNA質(zhì)量、完整性良好，可用于RT-PCR、cDNA文庫構(gòu)建、Northern blot等后續(xù)分子生物學(xué)試驗。

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