花椒麻素的抗氧化活性

游玉明，周　敏，王倩倩，任　亭，劉　雄，*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.重慶文理學(xué)院林學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，重慶 402160）

花椒麻素的抗氧化活性

游玉明1，2，周敏1，王倩倩1，任亭1，劉雄1，*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.重慶文理學(xué)院林學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，重慶 402160）

為研究花椒麻素的抗氧化活性，采用體外抗氧化實(shí)驗(yàn)，評價(jià)不同劑量花椒麻素的總抗氧化能力、還原力以及對羥自由基（·OH）和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的清除作用，并以人肝癌細(xì)胞HepG2為模型，探討其在細(xì)胞水平的抗氧化能力。結(jié)果表明：花椒麻素具有一定的還原力和總抗氧化能力，且呈現(xiàn)良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系；但對DPPH自由基、·OH的清除作用較弱。花椒麻素在較低質(zhì)量濃度（0～50 μg/mL）條件下可使HepG2細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性降低，丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量增加，但當(dāng)花椒麻素質(zhì)量濃度達(dá)到100 μg/mL時(shí)，細(xì)胞SOD活性顯著增加，MDA含量則顯著降低（P＜0.05）。因此，花椒麻素是一類潛在的抗氧化物質(zhì)，可用于此類功能食品的開發(fā)。

花椒麻素；抗氧化活性；HepG2細(xì)胞

花椒作為我國衛(wèi)生部確認(rèn)的藥食兩用植物材料，其以獨(dú)特的辛麻味，廣泛應(yīng)用于川菜及火鍋等的烹調(diào)中，被譽(yù)為“十三香”之首、“八大味”之一［1-3］。花椒麻素是一類鏈狀不飽和脂肪酸酰胺類物質(zhì)，具有強(qiáng)烈的刺激性，是花椒產(chǎn)生麻味的物質(zhì)基礎(chǔ)［4-5］。目前，從花椒葉、莖和果皮等部位中至少分離鑒定出25 種花椒麻味物質(zhì)，主要包括α-山椒素、β-山椒素、γ-山椒素、δ-山椒素以及它們在氨基部分含有一個(gè)羥基的同系物（圖1）［6-8］。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，花椒麻素具有麻醉［9］、抗炎鎮(zhèn)痛［10］、除皺［11］以及抗癌［12］等多種生理功能，因而引起了廣泛的關(guān)注。

自由基是機(jī)體正常代謝的中間產(chǎn)物，當(dāng)機(jī)體內(nèi)自由基過剩時(shí)，其強(qiáng)氧化能力可損傷機(jī)體的組織及細(xì)胞，從而引發(fā)一系列相關(guān)疾病，如衰老、癌癥、炎癥、動脈粥樣硬化和腫瘤等［13-14］。大量研究證明，抗氧化物質(zhì)可通過捕獲或中和自由基以及干預(yù)自由基作用的通路而抑制自由基對機(jī)體的損傷［15-17］。已有研究表明，花椒提取物具有較強(qiáng)的抗氧化功效［18-20］，是一種潛在的抗氧化劑，其中花椒麻素是花椒中結(jié)構(gòu)獨(dú)特且具有明顯生物學(xué)活性的重要成分。但有關(guān)花椒麻素抗氧化活性的研究還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用體外化學(xué)分析法和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對花椒麻素的抗氧化活性進(jìn)行評價(jià)，以期為其生理功效的探討及高值化利用提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

花椒麻素 實(shí)驗(yàn)室自制；人肝癌細(xì)胞株HepG2軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所發(fā)育與疾病遺傳學(xué)研究室楊曉教授惠贈。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH，分析純）、1%青鏈霉素混合液 北京索萊寶公司；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶（生化試劑） 美國Thermo Scientific公司；胎牛血清（fetal calf serum，F(xiàn)BS） 美國Gibco公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定試劑盒、微量蛋白測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；2，4，6-三吡啶基三嗪（2，4，6-tris（2-pyridyl）-s-triazine，TPTZ）、甲醇、無水乙醇、三氯乙酸、氯化鐵等均為分析純試劑。

1.2儀器與設(shè)備

HGC-12Ax型氮吹儀 天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；HERAcell150I型CO2培養(yǎng)箱、Multiskan FC型酶標(biāo)儀、ST16型離心機(jī) 美國Thermo Scientific公司；BDS200-PH型倒置生物顯微鏡 日本Olympus公司；SW-CJ-1FD型超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3方法

1.3.1花椒麻素溶液配制

準(zhǔn)確稱取經(jīng)氮?dú)獯蹈珊蟮幕ń仿樗?0 mg，充分溶解于200 μL甲醇中，配制成終質(zhì)量濃度為50 mg/mL的花椒麻素溶液，依次進(jìn)行梯度稀釋，使樣品溶液終質(zhì)量濃度為25、50、100、200、400、800 μg/mL。

1.3.2花椒麻素總抗氧化能力的測定

按照Brand-Williams等［21］的方法，將pH 3.6的醋酸鹽緩沖液、20 mmol/L FeCl3溶液、10 mmol/L TPTZ溶液按10∶1∶1（V/V）比例配制亞鐵還原能力（ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）工作液以及濃度為0.2～1.6 mmol/L FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取20 μL不同質(zhì)量濃度的樣品及陽性對照溶液于96 孔板中，加入150 μL經(jīng)37 ℃預(yù)熱的蒸餾水和150 μL經(jīng)37 ℃預(yù)熱的TPTZ工作液，輕輕振動混勻，靜置4 min后，于593 nm波長處測定光密度（OD593nm）值。以0.2～1.6 mmol/L的FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液代替樣品，按照上述方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（回歸方程為y=0.171 9x+0.002 4，R2= 0.993 0）。根據(jù)樣品所測得OD593nm，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得FeSO4的濃度（mmol/L），以FeSO4當(dāng)量濃度（mmol/L）表示花椒麻素總抗氧化能力（U），定義為FRAP值。

1.3.3花椒麻素總還原 力測定

參照Oyaizu［22］的方法：分別吸取50 μL不同質(zhì)量濃度的樣品及陽性對照溶液，加入75 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的鐵氰化鉀溶液，混合均勻，立即 置于50 ℃水浴中保溫20 min，冷卻后加入75 μL體積分?jǐn)?shù)10%的三氯乙酸溶液混勻，3 000 r/min離心10 min，吸取100 μL上清液于新孔中，加入75 μL蒸餾水、25 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的FeCl3，室溫靜置10 min后在700 nm波長處測定其光密度（OD700nm）值。

1.3.4花椒麻素DPPH自由基清除能力測定

參照楊虎等［23］的方法：分別取100 μL不同質(zhì)量濃度的樣品及陽性對照溶液加入0.08 mg/mL的DPPH甲醇溶液100 μL，搖勻后于室溫條件下避光靜置30 min，517 nm波長處測定光密度（OD517nm）值。以DPPH溶液和甲醇溶液為空白，按照式（1）計(jì)算樣品對DPPH自由基的清除能力。

1.3.5花椒麻素羥自由基（·OH）清除能力測定

采用Fenton反應(yīng)體系建立樣品對·OH的清除模型［24］。分別取不同質(zhì)量濃度的樣品或陽性對照溶液40 μL，再加入9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液40 μL、9 mmol/L FeSO4溶液40 μL、8.8 mmol/L H2O2溶液40 μL，并用蒸餾水補(bǔ)齊至每孔200 μL，混勻后在37 ℃保溫30 min，于510 nm波長處測定光密度（OD510nm）值，以蒸餾水代替樣品或陽性對照溶液作為空白，并按照式（2）計(jì)算樣品對·OH的清除能力。

1.3.6細(xì)胞抗氧化實(shí)驗(yàn)

取對數(shù)期生長狀態(tài)良好的人肝癌細(xì)胞HepG2接種于96 孔板中，使每孔細(xì)胞數(shù)約為5×103個(gè)，在37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，加入花椒麻素溶液，使其終質(zhì)量濃度分別為25、50、100、200 μg/mL，空白對照組加入等量溶劑代替。培養(yǎng)24 h后，3 000 r/min離心5 min，小心吸棄上清液，加入100 μL經(jīng)4 ℃預(yù)冷的細(xì)胞裂解液，4 ℃條件下裂解20 min。取上述細(xì)胞裂解液，以二辛可寧酸（bicinchonininc acid，BCA）法測定蛋白質(zhì)含量，同時(shí)按試劑盒說明書方法測定細(xì)胞中SOD活力及MDA含量。

1.4數(shù)據(jù)處理

2　結(jié)果與分析

2.1花椒麻素的總抗氧化能力

圖2　不同質(zhì)量濃度花椒麻素的總抗氧化能力Fig.2　Ferric reducing power of sanshool with various concentrations

FRAP值越高，代表總抗氧化能力越強(qiáng)。由圖2可知，花椒麻素具有一定的抗氧化能力，并且隨著質(zhì)量濃度的增加，總抗氧化能力呈緩慢增長趨勢，這與陽性對照VC的趨勢一致。當(dāng)花椒麻素質(zhì)量濃度為400 μg/mL時(shí)，其總抗氧化能力顯著增加（P＜0.05），但與VC相比還有較大的差距，其總抗氧化能力僅為相同質(zhì)量濃度下VC的22.2%。

2.2花椒麻素的總還原力

圖3　不同質(zhì)量濃度花椒麻素的總還原力Fig.3　Reducing power of sanshool with various concentrations

物質(zhì)的還原力是評價(jià)其潛在抗氧化活性的重要指標(biāo)，還原力強(qiáng)弱與抗氧化能力大小呈正比。由圖3可知，花椒麻素具有良好的總還原力，當(dāng)質(zhì)量濃度在50～400 μg/mL范圍內(nèi)，其總還原力顯著增加（P＜0.05），且在該質(zhì)量濃度范圍內(nèi)花椒麻素的總還原力與其質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系（R2=0.997），但當(dāng)其質(zhì)量濃度超過400 μg/mL時(shí)，其總還原力基本保持不變，表明過高質(zhì)量濃度的花椒麻素并不能增加其總還原力。與陽性對照VC相比，在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，兩者的總還原力比較接近。

圖4　不同質(zhì)量濃度花椒麻素對DPPH自由基的清除作用Fig.4　DPPH radical scavenging activity of sanshool with various concentrations

2.3花椒麻素的DPPH自由基清除能力DPPH自由基是一種以氮為中心的穩(wěn)定的有機(jī)自由基，紫色溶液，在517 nm波長處有強(qiáng)吸收，通過測定樣品對DPPH自由基的清除能力可以表示其抗氧化性的強(qiáng)弱。由圖4可知，花椒麻素對DPPH自由基具有一定的清除作用，且隨著質(zhì)量濃度的增加，清除作用有緩慢增加，當(dāng)其質(zhì)量濃度達(dá)到400 μg/mL時(shí)，其對DPPH自由基的清除效果顯著增加（P＜0.05），但與陽性對照VC相比，其對DPPH自由基的清除能力僅為相同質(zhì)量濃度下VC的20.8%。

2.4花椒麻素的·OH清除能力

圖5　不同質(zhì)量濃度花椒麻素的·OH清除能力Fig.5　Hydroxyl radical scavenging activities of sanshool with various concentrations

·OH是一種氧化能力極強(qiáng)的自由基，它可使細(xì)胞內(nèi)的糖、蛋白質(zhì)、核酸及脂類等物質(zhì)發(fā)生氧化反應(yīng)，進(jìn)而造成組織過氧化及細(xì)胞膜的損傷。由圖5可知，在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，花椒麻素對·OH的清除率基本保持不變，當(dāng)花椒麻素質(zhì)量濃度為25 μg/mL時(shí)，對·OH的清除率為13.4%，而隨著花椒麻素的質(zhì)量濃度增加至800 μg/mL時(shí)，其對·OH的清除率僅增加至16.4%（P＞0.05）。與同等質(zhì)量濃度下的陽性對照VC相比，花椒麻素對·OH的清除率能力遠(yuǎn)不如VC。

2.5花椒麻素的細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力

圖6　花椒麻素對HepG2細(xì)胞SOD活力（a）及MDA含量（b）的影響Fig.6　Effect of sanshool on SOD activity （a） and MDA content （b） in HepG2 cells

由圖6可知，HepG2細(xì)胞經(jīng)花椒麻素作用24 h后，與空白對照組（0 μg/mL）相比，隨著花椒麻素質(zhì)量濃度的增加，HepG2細(xì)胞內(nèi)SOD活力呈現(xiàn)出先下降隨后上升的趨勢，當(dāng)花椒麻素質(zhì)量濃度達(dá)到100 μg/mL時(shí)，SOD活力顯著增加（P＜0.05），而細(xì)胞內(nèi)MDA含量則與SOD活力呈現(xiàn)出相反的變化趨勢，當(dāng)花椒麻素質(zhì)量濃度達(dá)到100 μg/mL時(shí)，其MDA含量顯著降低（P＜0.05）。

3　結(jié)論與討論

自由基是游離存在的，含有不配對電子的基團(tuán)，正常情況下，機(jī)體的氧化與抗氧化存在動態(tài)平衡，當(dāng)在患病或衰老等狀態(tài)下，則出現(xiàn)自由基水平升高，造成細(xì)胞蛋白質(zhì)氧化、核酸斷裂及脂質(zhì)過氧化等產(chǎn)生，進(jìn)而影響細(xì)胞的正常功能［25-26］。本實(shí)驗(yàn)采用體外化學(xué)分析法研究了花椒麻素的總抗氧化能力、總還原力以及對DPPH自由基和·OH的清除能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，花椒麻素對DPPH自由基、·OH的清除能力較弱，具有一定的總抗氧化能力，但其對鐵的還原力較強(qiáng)，并隨著劑量增加而增大，呈現(xiàn)良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系，與陽性對照VC相比無顯著差異（P＞0.05）。

為了更全面評價(jià)花椒麻素的抗氧化能力，本實(shí)驗(yàn)以人肝癌細(xì)胞HepG2為模型，探討了其在細(xì)胞水平上的抗氧化能力。SOD是一種通過清除超氧陰離子自由基從而起到保護(hù)機(jī)體抵抗自由基損傷的重要抗氧化酶，是生物體內(nèi)清除自由基的第一道防線；MDA是自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)的氧化終產(chǎn)物，可引起細(xì)胞毒性，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，其含量間接反映出細(xì)胞受損傷的程度，常將兩者聯(lián)合應(yīng)用于評價(jià)細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平［27-28］。本研究的結(jié)果顯示，隨著花椒麻素質(zhì)量濃度增加，SOD活力呈現(xiàn)先下降隨后上升的趨勢，且差異顯著（P＜0.05）；而MDA含量隨著花椒麻素質(zhì)量濃度的增加呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢。有研究表明，花椒麻素存在潛在的細(xì)胞毒性，且可減緩胃癌細(xì)胞循環(huán)周期，有效阻止癌細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的失控［29-30］，這可能使得較低質(zhì)量濃度的花椒麻素不能有效抑制肝癌細(xì)胞增殖，癌細(xì)胞內(nèi)過剩的自由基不能得到有效清除，導(dǎo)致SOD活力降低，MDA含量增加；隨著花椒麻素質(zhì)量濃度的增加，HepG2細(xì)胞活性被抑制，細(xì)胞內(nèi)自由基減少，MDA含量降低，SOD活力增加，這可能也是花椒麻素抑制腫瘤的作用機(jī)制之一。

綜上所述，花椒麻素具有一定的抗氧化能力，且在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，能有效降低HepG2細(xì)胞內(nèi)的MDA含量，增加SOD活力。

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Antioxidant Activity in vitro of Sanshool from Sichuan Peppers （Zanthoxylum bungeanum）

YOU Yuming1，2， ZHOU Min1， WANG Qianqian1， REN Ting1， LIU Xiong1，*
（1. College of Food Science， Southwest University， Chongqing 400715， China；2. College of Forestry and Life Science， Chongqing University of Arts and Sciences， Chongqing 402160， China）

The an tioxidant activity in vitro of sanshool from Sichuan peppers （Zanthoxylum bungeanum） was assessed by total antioxidant capacity， reducing power and scavenging capacities against hydroxyl and 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl（DPPH） free radicals as well as its cellular antioxidant activity on human liver HepG2 cells. The results indicated that sanshool had a certain reducing power and total antioxidant capacity in a dose-effect manner， but the scavenging activity on DPPH and hydroxyl radicals was a little weak. The cellular antioxidant activity on human liver HepG2 cells showed that at lower concentrations （0-50 μg/mL） of sanshool， superoxide dismutase （SOD） activity was decreased and malondialdehyde（MDA） content was increased. At a concentration up to 100 μg/mL， SOD activity was increased significantly and MDA content was reduced significantly （P ＜ 0.05）. Therefore， sanshool is can be considered as a potential antioxidant ingredient for functional foods.

sanshool； antioxidant activity； HepG2 cells

TS201.4

A

1002-6630（2015）13-0027-05

10.7506/spkx1002-6630-201513006

2014-08-27

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（NSFC31171679）；重慶市科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目（CSTC2010BB1350）

游玉明（1983—），男，講師，博士研究生，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與營養(yǎng)學(xué)。E-mail：xuxiaojiaoyou@126.com

劉雄（1970—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樘妓衔锕δ芘c利用、食品化學(xué)與營養(yǎng)學(xué)。

E-mail：liuxiong848@hotmail.com