微波處理對固相合成大豆分離蛋白-乳糖糖基化接枝物的影響

涂宗財，段鄧樂，王　輝，陳智韡，黃小琴

（1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.江西師范大學生命科學學院，江西 南昌 330022）

微波處理對固相合成大豆分離蛋白-乳糖糖基化接枝物的影響

涂宗財1，2，段鄧樂1，王輝1，陳智韡1，黃小琴2

（1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.江西師范大學生命科學學院，江西 南昌 330022）

以大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）和乳糖（lactose）為原料，利用微波無溶劑糖基化反應合成SPI-乳糖糖基化接枝物（SPI-L）和以金屬氧化物Al2O3為載體的微波SPI-乳糖糖基化接枝物（SPI-L-Al2O3），并通過顏色變化、熒光光譜分析、氨基酸分析、溶解性以及褐變程度等方法對比，研究兩種接枝產物的理化性質和結構變化。結果表明：SPI-L-Al2O3比SPI-L反應速率略慢，隨著微波時間的延長，兩者顏色均逐漸變深，顏色差異逐漸變大；溶解度均呈先增大后降低的趨勢；賴氨酸和精氨酸相對含量均明顯降低；SPI-L最大熒光波長先藍移后紅移，相對熒光強度先增大后減小，SPI-L-Al2O3最大熒光波長發生藍移，相對熒光強度逐漸增強。

大豆分離蛋白；乳糖；微波；接枝物；理化性質

蛋白質和糖類是組成食品體系的重要成分，在食品體系中處于共存狀態，二者之間的相互作用是影響食品體系流變學特性、穩定性和口感的主要因素［1］。蛋白質和糖易發生接枝反應，且研究發現，蛋白質與還原糖發生糖基化反應可以提高蛋白質的功能特性［2］。大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）是一種重要的植物蛋白產品，已經廣泛應用于食品及其他行業中，其蛋白質含量高達90%以上，應充分利用我國大豆資源，大力推廣大豆分離蛋白制品在食品加工中的應用［3］。另一方面，大豆分離蛋白的乳化性、凝膠性等性質與某些動物源蛋白質相比仍有較大差距，且它較差的溶解性也不利于其在食品工業中的廣泛應用，因此需要對SPI進行改性處理來獲得優良的功能特性［4］。

微波可以使電磁能通過分子運動而轉化為熱能，由于其高效、節能、安全的熱處理方法，微波加熱（microwave heating，MH）已經被廣泛地應用到食品工業中［5］，如微波加熱應用于糖基化修飾［6］。

已經有研究表明，在緩沖溶液存在的條件下，微波可以明顯地加快大豆分離蛋白-糖美拉德反應［7］。在SPI-糖濕法接枝改性研究的基礎上，通過微波輻射強化可以極大地提高接枝反應 的速率，且接枝改性產品的功能性也有很大的改善［8］。但是，微波加熱的機制是目標分子電偶極子發生旋轉和振動，因此，微波輻照常常被水分子吸收［9］。在干燥介質中，反應物混合不完全，不均勻的微波電場使反應物產生局部過熱，表面溫度更高，使固相載體反應比溶液相反應速率更快，產率更高［10］，因此微波無溶劑條件下的有機合成反應由于未使用溶劑，發生有機反應時反應物彼此直接接觸，物質本身的性質決定了反應速率和條件。氧化鋁（Al2O3）作為一種常用的金屬氧化物載體，可以反射微波，導致反應物的反應程度更均勻［5］。為了減少水分子優先被加熱而導致目標分子間接被加熱的影響，本實驗以大豆分離蛋白為研究對象，利用微波無溶劑糖基化反應合成以金屬氧化物Al2O3為載體的微波SPI-乳糖糖基化接枝物（SPI-LAl2O3）和SPI-乳糖糖基化接枝物（SPI-L），并研究接枝產物的理化性質和功能性質，旨在獲得新的、快速有效的蛋白質改性方法，為蛋白-糖接枝物的工業生產提供理論基礎和方法指導。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

大豆蛋白 谷神生物科技集團有限公司；粗蛋白、乳糖（分子質量360.31 D） 阿拉丁試劑有限公司；酸性氧化鋁（alumina，Al2O3）、NaOH、HCl 天津市大茂化學試劑廠。

1.2儀器與設備

CR-10色差儀 日本Minolta公司；T6新世紀紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；G80F20CN2L-B8（RO）型微波爐 廣東格蘭仕微波爐電器制造有限公司；L-8800氨基酸分析儀、F-7000熒光光譜儀 日本日立公司。

1.3方法

1.3.1SPI的制備

大豆蛋白與蒸餾水按質量比1∶10混合，室溫下低速攪拌2 h，攪拌過程用1 mol/L NaOH保持pH 8.5。混合液經8 000×g離心30 min除去不溶物，上清液用2 mol/L HCl調節pH值至4.5，溶液經5 000×g離心15 min，去除上清液，收集蛋白質凝乳，凝乳經蒸餾水沖洗3 次后，加入一定量蒸餾水，用1 mol/L NaOH調節溶液pH值至7.0，攪拌，待沉淀充分溶解后，溶液經8 000×g離心30 min除去不溶物，上清液冷凍干燥［11］。

1.3.2SPI-L-Al2O3的制備

稱取SPI、乳糖、Al2O3（ 5∶5∶1，m/m）若干置于研缽中研磨，混合均勻后過150 目篩，收集篩出物。SPI-乳糖- Al2O3混合物（水分含量為5.2%，水分含量測定采用GB 5009.3—2010《食品中水分的測定》中的方法）在800 W微波功率下加熱不同時間（30、60、90、120、150、180 s），冰水浴30 s結束反應。不同樣品配成50 mL溶液，4 ℃透析2 d，再將溶液稀釋至100 mL，3 000×g離心除去不溶物，樣品凍干制成干粉。

1.3.3SPI-L的制備

稱取等質量的SPI與乳糖置于研缽中研磨，混合均勻后過150 目篩，收集篩出物。SPI-乳糖混合物（水分含量為7.2%）在800 W微波功率下加熱不同時間（30、60、90、120、150、180 s），冰水浴結束反應。不同樣品配成50 mL溶液，4 ℃透析2 d，再將溶液稀釋至100 mL，3 000×g離心除去不溶物，取10 mL混合物樣品置于冰箱中保存備用，其余樣品凍干制成干粉。

1.3.4顏色變化測定

用色差計測定樣品顏色的變化。樣品置于透明自封袋中，放置在光滑黑色平板上，以此平板測量值為空白。用國際照明委員會（International Commission on Illumination，CIE）建立的色彩系統為技術標準，L表示標準白光，a、b為色度坐標。+a是向紅色變化，-a是向綠色變化；+b為向黃色變化，-b為向藍色變化。總色差（ΔΕ）通過同一樣品5 個不同位置進行評價［12-14］，按照下式計算。

式中：L、a、b為樣品測量值；L0、a0、b0為空白測量值。

1.3.5溶解度測定

將SPI及接枝物樣品配制成質量濃度為0.1 g/mL的溶液，室溫攪拌30 min，于10 000 r/min高速離心30 min，取上清液以Folin-酚法測定蛋白質含量，蛋白質總量使用凱氏定氮法測定［15-16］。蛋白質氮溶指數（nitrogen solubility index，NSI）按下式計算。

1.3.6褐變程度的測定

稱取凍干后樣品加入蒸餾水配制成5 mg/mL的溶液，用紫外分光光度計于420 nm波長處（稀釋5 倍）及294 nm波長處（稀釋10 倍）測定吸光度，用以表示褐變程度［17］。

1.3.7氨基酸組成及含量分析

分別稱取0.1 g樣品于安瓿管的底部，緩慢加入8 mL 6 mol/L HCl并輕輕轉動安瓿管，保證樣品全部在安瓿管底部并保證樣品得到全部潤濕，抽真空，維持10 min后，在酒精噴燈上封口。在110 ℃條件下水解24 h，冷卻后雙層濾紙過濾濃縮，定容至5 mL，過0.54 nm濾膜后保存備用。用Hitachi L-8800氨基酸分析儀測定氨基酸組成及各氨基酸含量［18-19］。氨基酸相對含量按下式計算。

1.3.8熒光光譜采集

樣品用10 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）稀釋，使其蛋白質質量濃度約為2 mg/mL，使用F-7000熒光光譜儀分析樣品的相對熒光強度。激發波長290 nm，狹縫5 nm，發射波長300～500 nm，狹縫5 nm，掃描速率1 200 nm/min［20］。

2　結果與分析

2.1顏色變化

表1　不同MH時間SPI-L-Al2O3顏色變化Table1　Changes in the color of SPI-L-alumina grafts under different

表2　不同MH時間SPI-L顏色變化Table2　Changes in the color of SPI-L grafts under different MH timesTable2　Changes in the color of SPI-L grafts under different MH times

由表1和表2可知，經過微波糖基化處理后，SPI的顏色變化明顯，SPI與還原糖反應產物隨著微波時間延長，標準白光（L）值逐漸減小，色度坐標a值、b值逐漸增大，說明SPI經微波糖基化處理后，樣品顏色逐漸變黑、變紅、變黃。ΔE表示總色差的大小，ΔE逐漸增大，說明隨著微波時間延長，樣品的顏色差別變大。微波時間越長，溫度越高，高溫加速了樣品分子間的相互作用，產生聚合物色素越多，造成色澤指標的變化［21］。

圖1　不同MH時間接枝物溶解度的變化Fig.1　Changes in solubility of grafts under different MH times

2.2溶解度變化蛋白質的溶解度是蛋白質肽鏈骨架上的極性基團與水分子發生水合作用的結果，能夠間接反映蛋白質分子結構的變化，以及蛋白質分子電荷和疏水性的平衡［22］。由圖1可知，隨著微波加熱時間的延長，樣品的溶解度先增大后減小。反應初期，微波加熱促使蛋白與糖結合，隨著糖鏈的引入，糖鏈的親水性羥基與水分子相互作用，從而增加SPI的NSI。反應時間進一步延長時，更多的糖鏈引入，蛋白的親水性變化不明顯，但溫度進一步升高，高溫將導致SPI變性并發生聚集，從而使NSI減小。

2.3褐變程度變化

圖2　樣品在294 nm波長處的吸光度Fig.2　Absorbance of samples at 294 nm

圖3　樣品在420 nm波長處的吸光度Fig.3　Absorbance of samples at 420 nm

樣品在294 nm波長處的吸光度可用來表示糖基化過程中中間產物的生成量［23］。由圖2可知，在微波加熱120 s內，樣品糖基化產物在294 nm波長處的吸光度顯著增加，隨著時間延長到180 s變化不明顯。這表明中間產物很大程度上 是在反應前120 s內生成的，隨著微波加熱時間延長，一些中間產物聚合形成黑色蛋白，導致只有很少的中間產物形成［24］。

糖基化反應常伴隨著褐變現象，可通過420 nm波長處吸光度來監測樣品糖基化反應的高級階段［25］。由圖3可知，隨著微波時間的增長，樣品褐變越明顯，加熱150 s后增強程度變緩，可能是微波加熱會導致糖基化反應發生，其生成褐色物質的同時也會發生焦糖化反應。加熱150 s后，褐變程度變緩，可能是由于糖基化反應使樣品中氨基含量減少并產生酸，過酸條件會減緩褐變反應的發生［23］。

2.4氨基酸組成及含量

表3　SPI及其接枝物氨基酸相對含量Table3　Relative content of amino acids in SPI and grafts

由表3可知，與未處理SPI相比，其接枝物賴氨酸（Lys）與精氨酸（Arg）相對含量明顯降低。SPI-糖的接枝反應主要是SPI中自由氨基與糖分子的還原性末端發生羰氨縮合反應。降低的自由氨基可能是賴氨酸殘基的側鏈和精氨酸的胍基基團與乳糖發生共價結合的結果。加熱也會導致胱氨酸和賴氨酸減少，加熱會使胱氨酸形成脫氫丙氨酰殘基，它能與賴氨酸ε-氨基形成賴氨酸丙氨酸［23］。

2.5熒光光譜分析

天然蛋白質中只有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸3 種氨基酸殘基有熒光性，這3 種氨基酸殘基由于側鏈芳香族基團不同而有不同的熒光光譜，并且最大熒光波長分別為348、303、282 nm。與酪氨酸、苯丙氨酸殘基相比，色氨酸殘基熒光量子產率較高，因此熒光光譜主要反映了色氨酸殘基的熒光性［20，26］。

表4　SPI及其接枝的內源性熒光變化Table4　Changes in intrinsic florescence spectra of SPI and graftsTable4　Changes in intrinsic florescence spectra of SPI and grafts

由表4可知，SPI-L經微波糖基化處理90 s后，最大熒光波長從344.2 nm藍移到340 nm，相對熒光強度由306.5增大到極大值934.2。通常而言，最大熒光波長與蛋白分子中色氨酸殘基的位置緊密相關［26］。最大熒光波長向低波長移動表明由于糖分子的引入，SPI中部分色氨酸殘基在低極性環境中發生了掩埋。相對熒光強度增強說明部分發色團暴露在分子表面，這可能是由于微波糖化處理后，SPI與糖共價結合、蛋白質-蛋白質聚集及多肽-多肽聚合，部分色氨酸殘基結合在非極性部位，從而導致相對熒光強度增加。SPI-L經微波糖化處理150 s后，最大熒光波長從344.2 nm紅移到346.6 nm，相對熒光強度由306.5減小至212.9。隨著微波時間的延長，色氨酸殘基暴露出來，導致最大熒光波長增大。另外，微波加熱處理150 s后，SPI-L相對熒光強度降低，表明隨微波時間的增長，糖分子含量的增多，SPI聚合物的“空間位阻”效應增強導致相對熒光強度降低。SPI-L-Al2O3隨著微波時間的延長，最大熒光波長藍移，相對熒光強度逐漸增強。可能是因為蛋白質與糖吸附在Al2O3載體上，由于微波透過Al2O3而不被其吸收，從而使蛋白與糖均勻吸收能量，反應程度也較均勻；微波具有局部加熱的特性，先吸收微波能的大分子有機物先發生反應，所以SPI-L微波糖基化反應較加入載體更快［5］。

3　結 論

微波對固相無溶劑糖基化接枝物SPI-L-Al2O3和SPI-L的理化性質和結構均有影響，SPI-L-Al2O3糖基化反應較SPI-L慢。隨著微波時間的延長，兩種糖基化產物在294 nm波長處的吸光度均增加，褐變程度也明顯增強，顏色差別增大，溶解度均先增大后減小；賴氨酸與精氨酸相對含量均明顯降低，最大熒光波長和相對熒光強度也有相應的變化。該研究為為蛋白質- 糖接枝物的工業化生產提供理論基礎和方法指導。

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Effect of Microwave Treatment on Solid-Phase Synthesis of Soy Protein Isolate-Lactose Graft

TU Zongcai1，2， DUAN Dengle1， WANG Hui1， CHEN Zhiwei1， HUANG Xiaoqin2
（1. State Key Laboratory of Food Science and Technology， Nanchang University， Nanchang 330047， China；2. College of Life Science， Jiangxi Normal University， Nanchang 330022， China）

Soybean protein isolate （SPI） and lactose were used as raw materials to synthesize SPI-lactose graft by solventfree glycosylation with microwave heating and SPI-lactose-Al2O3graft using Al2O3as the carrier. The chemical and structural properties of the two graft copolymers including color， fluorescence spectral characteristics， amino acid composition，solubility and degree of browning were compared. Results showed that the react ion rate of SPI-L-alumina was lower than that of SPI-L. With the extension of microwave heating time， the color of both samples were deeper， and color difference gradually increased， the solubility rose fi rst and then dropped， and the contents of lysine and arginine were signifi cantly reduced. The maximum fluorescence wavelength of SPI-L revealed a blue shift followed by a red shift with an initial increase and then a decrease in relative fl uorescence intensity， whereas the maximum fl uorescence wavelength of SPI-L-alumina displayed a blue shift with a gradual increase in relative fl uorescence intensity.

soybean protein isolate （SPI）； lactose； microwave； graft； physicochemical properties

TQ93

A

1002-6630（2015）13-0032-05

10.7506/spkx1002-6630-201513007

2014-06-30

國家重點基礎研究發展計劃（973計劃）項目（2012CB126314）；江西省重大科技創新項目（20124ACB00600）

涂 宗財（1965—），男，教授，博士，研究方向為食物資源開發與高效利用。E-mail：tuzc_mail@aliyun.com