雞胸軟骨Ⅱ型膠原免疫活性肽的制備及其性質(zhì)

劉露露，曹　慧*，徐　斐，于勁松，袁　敏

（上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093）

雞胸軟骨Ⅱ型膠原免疫活性肽的制備及其性質(zhì)

劉露露，曹慧*，徐斐，于勁松，袁敏

（上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093）

以水解度為指標(biāo)，優(yōu)化了中性蛋白酶酶解雞胸軟骨Ⅱ 型膠原的條件，在此基礎(chǔ)上制備不同水解度Ⅱ型膠原酶解復(fù)合物，并以淋巴細(xì)胞增殖率為指標(biāo)對(duì)其免疫活性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，中性蛋白酶的酶解能力最強(qiáng)，其最佳酶解條件為：酶解溫度50 ℃、pH 7.5、底物質(zhì)量濃度25 mg/mL、加酶量40 U/mg、酶解時(shí)間150 min。當(dāng)Ⅱ型膠原在水解度為18%時(shí)，其對(duì)淋巴細(xì)胞的增殖活性達(dá)到58.69%。Ⅱ型膠原酶解復(fù)合物的質(zhì)量濃度對(duì)淋巴細(xì)胞的增殖率也有顯著影響，當(dāng)其質(zhì)量濃度達(dá)到1 mg/mL時(shí)，對(duì)淋巴細(xì)胞增殖能力達(dá)到最大。免疫活性較高的Ⅱ型膠原酶解復(fù)合物的分子質(zhì)量主要分布于1 000～180 D范圍內(nèi)，占其總含量的75.21%。

Ⅱ型膠原；免疫活性肽；中性蛋白酶；淋巴細(xì)胞增殖活性

Ⅱ型膠原免疫活性肽是指以Ⅱ型膠原為原料制備的對(duì)機(jī)體的免疫功能具有生理調(diào)節(jié)作用的肽類化合物［1-2］。它能夠刺激淋巴細(xì)胞增殖，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力，而且不會(huì)引起機(jī)體的免疫排斥反應(yīng)［3］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病與Ⅱ型膠原的自身免疫反應(yīng)有關(guān)，通過口服Ⅱ型膠原來誘導(dǎo)免疫耐受對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎具有顯著防治作用［4-6］。進(jìn)一步研究顯示，Ⅱ型膠原中的免疫活性肽能與人類的白細(xì)胞抗原HLA-DR4相結(jié)合，形成的復(fù)合物再經(jīng)分泌途徑呈現(xiàn)于抗原遞呈細(xì)胞（antigen processing cells，APCs）細(xì)胞表面，供受體特異性T細(xì)胞表面受體（T cell receptor，TCR）所識(shí)別，進(jìn)一步結(jié)合成TCR-HLA/DR4-抗原肽三分子復(fù)合體，T細(xì)胞被活化、增殖并分泌各種免疫因子而啟動(dòng)免疫應(yīng)答［7-12］。因而，本實(shí)驗(yàn)以雞胸軟骨Ⅱ型膠原為原料，采用酶法制備Ⅱ型膠原免疫活性肽，并對(duì)其免疫活性進(jìn)行了研究，以期為免疫活性肽的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

Ⅱ型膠原 上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院資源綜合利用實(shí)驗(yàn)室自制［13］。

中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶 江蘇銳陽生物科技有限公司；胰蛋白酶、胃蛋白酶 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；淋巴細(xì)胞 上海拜力生物科技有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

BX41顯微鏡 奧林巴斯有限公司；TLID-2005袖珍型低溫恒溫槽 寧波天恒儀器廠；UV-6000 PC紫外-可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；Biocell ht2酶標(biāo)儀 鄭州博賽生物工程有限公司。

1.3方法

1.3.1不同蛋白酶酶解Ⅱ型膠原條件的優(yōu)化

將制備的雞胸軟骨Ⅱ型膠原［13］溶解于雙蒸水中，并配制成一定質(zhì)量濃度的溶液，置于酶反應(yīng)器中，調(diào)節(jié)反應(yīng)所需的溫度和pH值，然后向其中加入不同蛋白酶，使其在各自最適的條件下進(jìn)行酶解。于酶解過程中，不斷向反應(yīng)體系中加入0.5 mol/L的氫氧化鈉維持其所需pH值，并記錄堿液消耗量，酶解一定時(shí)間后，沸水浴中滅酶10 min，終止酶解反應(yīng)。根據(jù)反應(yīng)過程中消耗的堿量及水解度計(jì)算公式可計(jì)算出不同蛋白酶對(duì)Ⅱ型膠原的水解度［14-15］。

式中：V為NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積/mL；c為NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度/（mol/L）；α為氨基離解度；m為底物中蛋白質(zhì)總量/g；htot為底物蛋白質(zhì)肽鍵總數(shù)/（mmol/g）。

在最優(yōu)水解酶的基礎(chǔ)上考察酶解溫度（40、50、60 ℃）、pH值（6.5、7、7.5）、底物質(zhì)量濃度（20、25、30 mg/mL）、加酶量（20、30、40 U/mg）及酶解時(shí)間（0～300 min）對(duì)中性蛋白酶酶解Ⅱ型膠原能力的影響。

1.3.2不同水解度Ⅱ型膠原酶解物的制備

取一定量的雞胸軟骨Ⅱ型膠原［13］，用雙蒸水配制成25 mg/mL的溶液，放置在酶反應(yīng)器中，根據(jù)1.3.1節(jié)中的反應(yīng)條件進(jìn)行酶解。達(dá)到一定的水解度后立即取出，沸水浴滅酶活10 min。冷凍干燥得到固體樣品，貯藏于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3不同水解度Ⅱ型膠原免疫活性的測(cè)定

于96 孔培養(yǎng)板中加入100 μL小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液（1×106～2×106mL），再各加入100 μL不同水解度Ⅱ型膠原樣品，混勻后，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)68 h。在無菌的條件下向每孔加入10 μL噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT），混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再向每孔加入100 μL二甲基亞砜，室溫下放置10 min。采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以培養(yǎng)液作為對(duì)照。

式中：A對(duì)照為對(duì)照組樣品在570 nm波長(zhǎng)處的吸光度；A實(shí)驗(yàn)為各樣品在570 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

1.3.4不同水解度Ⅱ型膠原酶解物分子質(zhì)量分布的測(cè)定采用高效凝膠過濾色譜法測(cè)定Ⅱ型膠原酶解復(fù)合物分子質(zhì)量的分布情況。色譜條件：色譜柱：TSKgel 2000 SWXL（300 mm×7.8 mm）；流動(dòng)相：乙腈-水-三氟乙酸（40∶60∶0.1，V/V）；檢測(cè)：UV220 nm；流速：0.5 mL/min；柱溫：30 ℃。上柱樣品制備：分別稱取適量分子質(zhì)量標(biāo)樣和樣品溶于10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，微孔濾膜過濾后進(jìn)樣。凝膠過濾色譜柱分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞色素C（Mw12 500）、桿菌酶（Mw1 450）、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（Mw451）及乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（Mw189）。

1.4統(tǒng)計(jì)分析

以上指標(biāo)測(cè)定重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)用3 次平均值表示，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1不同蛋白酶對(duì)Ⅱ型膠原蛋白酶解能力的比較

圖1　不同蛋白酶酶解Ⅱ型膠原的動(dòng)力學(xué)曲線Fig.1　Hydrolysis curves for type II collagen with different proteases

以水解度為指標(biāo)比較了幾種蛋白酶在相同加酶量（30 U/mg）以及各自最適條件下對(duì)膠原蛋白的酶解效果，如圖1所示。中性蛋白酶在最適酶解條件下，對(duì)Ⅱ型膠原水解度顯著高于其他酶類（P＜0.01）。中性蛋白酶能最大程度地酶解膠原蛋白，其水解度為25.10%。這可能因?yàn)橹行缘鞍酌竵碓从诳莶菅挎邨U菌，可裂解蛋白質(zhì)中的Tyr、Trp、Phe等氨基酸的肽鍵，是溫和的蛋白質(zhì)水解內(nèi)切酶，對(duì)很多蛋白質(zhì)和肽類有酶解作用，因此選用中性蛋白酶作為酶解Ⅱ型膠原蛋白的工具酶。

2.2中性蛋白酶對(duì)Ⅱ型膠原酶解條件的優(yōu)化

2.2.1酶解溫度對(duì)Ⅱ型膠原蛋白水解度的影響

在pH值為7、底物質(zhì)量濃度為25 mg/mL、加酶量30 U/mg、酶解時(shí)間300 min的條件下，考察不同酶解溫度（40、50、60 ℃）對(duì)中性蛋白酶酶解Ⅱ型膠原的影響，結(jié)果如圖2所示。酶解溫度在50 ℃時(shí)，中性蛋白酶對(duì)Ⅱ型膠原的水解度顯著高于其他溫度（P ＜0.01），在酶解溫度為50 ℃時(shí)酶解程度最大，為26.08%。這可能是由于50 ℃時(shí)能夠達(dá)到中性蛋白酶催化酶解反應(yīng)所需的活化能，反應(yīng)速率加快；而溫度過高或過低，會(huì)對(duì)中性蛋白酶的結(jié)構(gòu)和活性產(chǎn)生影響，酶活性受到抑制，導(dǎo)致酶解能力降低。因此選擇50 ℃作為中性蛋白酶酶解Ⅱ型膠原的最適溫度。

圖2　酶解溫度對(duì)Ⅱ型膠原水解度的影響Fig.2　Effect of temperature on type II collagen hydrolysis

2.2.2酶解pH值對(duì)Ⅱ型膠原蛋白水解度的影響

在酶解溫度50 ℃、底物質(zhì)量濃度25 mg/mL、加酶量30 U/g、酶解時(shí)間300 min的條件下考察不同pH值（6.5、7、7.5）對(duì)中性蛋白酶酶解Ⅱ型膠原的影響。結(jié)果如圖3所示。

圖3　酶解pH值對(duì)Ⅱ型膠原蛋白水解度的影響Fig.3　Effect of pH on hydrolysis efficiency of type II collagen

由圖3可知，中性蛋白酶對(duì)Ⅱ型膠原蛋白的酶解能力隨pH值的升高而顯著增大（P＜0.01），當(dāng)pH值為7.5時(shí)酶解程度達(dá)到最高。這可能是因?yàn)樵谒嵝詶l件下，中性蛋白酶與底物所帶電荷發(fā)生變化，導(dǎo)致中性蛋白酶的立體構(gòu)象產(chǎn)生變化，從而改變了其與Ⅱ型膠原之間的親和力，導(dǎo)致催化能力下降，進(jìn)而Ⅱ型膠原水解度被降低。酶的最適pH值會(huì)受底物種類、質(zhì)量濃度以及緩沖液組成等多種因素的影響，故而其最適pH值不是一個(gè)常數(shù)，只有在一定的條件下才有意義。因此選擇pH 7.5作為中性蛋白酶酶解Ⅱ型膠原的最適pH值。

2.2.3底物質(zhì)量濃度對(duì)Ⅱ型膠原水解度的影響

在酶解溫度50 ℃、pH值為7.5、加酶量30 U/g、酶解時(shí)間為300 min的條件下，考察不同底物質(zhì)量濃度（20、25、30 mg/mL）對(duì)中性蛋白酶酶解Ⅱ型膠原的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4　底物質(zhì)量濃度對(duì)Ⅱ型膠原水解度的影響Fig.4　Effect of substrate concentration on hydrolysis of type II collagen

由圖4可知，Ⅱ型膠原質(zhì)量濃度為25 mg/mL時(shí)，中性蛋白酶對(duì)Ⅱ型膠原的水解度顯著高于其他質(zhì)量濃度（P＜0.01）。這是由于高質(zhì)量濃度Ⅱ型膠原降低了水的有效濃度，阻礙了分子擴(kuò)散，從而降低了酶促反應(yīng)速率；同時(shí)質(zhì)量濃度過高，使得反應(yīng)體系過于黏稠，不利于反應(yīng)的操作和進(jìn)行。因此選擇25 mg/mL作為中性蛋白酶酶解Ⅱ型膠原的最佳底物質(zhì)量濃度。

2.2.4加酶量對(duì)Ⅱ型膠原水解度的影響

在酶解溫度為50℃、pH值為7.5、底物質(zhì)量濃度為25 mg/mL、酶解時(shí)間為300 min的條件下，考察不同加酶量（20、30、40 U/g）對(duì)中性蛋白酶酶解Ⅱ型膠原的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5　加酶量對(duì)Ⅱ型膠原水解度的影響Fig.5　Effect of enzyme concentration on hydrolysis efficiency of type II collagen

由圖5可知，Ⅱ型膠原水解度隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)、加酶量的增大而顯著增加（P＜0.01）。當(dāng)加酶量為40 U/mg時(shí)中性蛋白酶對(duì)Ⅱ型膠原的酶解程度與30 U/mg時(shí)的水解度差異不顯著（P＞0.05），但顯著高于20 U/mg時(shí)水解度（P＜0.01）。因此選擇40 U/mg作為中性蛋白酶酶解Ⅱ型膠原的最佳加酶量。

2.2.5最適酶解條件下中性蛋白酶對(duì)Ⅱ型膠原的酶解動(dòng)力學(xué)曲線

綜合以上單因素試驗(yàn)結(jié)果，得出中性蛋白酶對(duì)Ⅱ型膠原的最佳酶解參數(shù)分別為：酶解溫度50 ℃、pH 7.5、底物質(zhì)量濃度25 mg/mL、加酶量40 U/mg。根據(jù)此最佳酶解條件繪制中性蛋白酶對(duì)Ⅱ型膠原的酶解動(dòng)力學(xué)曲線。

圖6　中性蛋白酶酶解Ⅱ型膠原的動(dòng)力學(xué)曲線Fig.6　Hydrolysis curve for type II collagen with neutral protease

由圖6可知，在最適酶解條件下，Ⅱ型膠原水解度隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，最后趨于平緩。中性蛋白酶具有一定專一性的酶，有其特定的肽鍵作用位點(diǎn)，隨著酶解反應(yīng)的進(jìn)行，蛋白底物的特定的肽鍵會(huì)越來越少，反應(yīng)速率也會(huì)越來越慢。因此蛋白酶的酶解作用大多集中在前60～120 min。此外，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，酶的活力會(huì)有所下降，這也是制約中性蛋白酶進(jìn)一步酶解Ⅱ型膠原的原因之一。

2.3不同水解度Ⅱ型膠原酶解復(fù)合物的免疫活性

根據(jù)中性蛋白酶酶解Ⅱ型膠原的最佳條件，制備不同水解度的Ⅱ型膠原酶解復(fù)合物，并對(duì)其淋巴細(xì)胞增殖活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖7所示。

圖7　不同水解度Ⅱ型膠原酶解復(fù)合物促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖能力Fig.7　Effect of enzymatic hydrolysates with different DH fro m type II collagen on the proliferation of lymphocytes

由圖7可知，不同水解度Ⅱ型膠原酶解復(fù)合物對(duì)淋巴細(xì)胞均有一定的增殖作用，且酶解復(fù)合物促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖能力隨水解度的增加呈先增強(qiáng)后降低的趨勢(shì)。當(dāng)Ⅱ型膠原水解度達(dá)到18%時(shí)，酶解復(fù)合物促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖能力達(dá)到最高，為58.69%。這可能是由于在水解的初始，Ⅱ型膠原中的多肽鏈緊密折疊在一起，其具有免疫活性的氨基酸殘基或基團(tuán)被包埋在分子內(nèi)部，從而活性較低。隨著酶解反應(yīng)的進(jìn)行，大分子肽段被切割，釋放出具有免疫活性的小分子肽和游離氨基酸，暴露出能夠參與反應(yīng)的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)，從而使其免疫活性得以表現(xiàn)。但肽段的免疫活性與氨基酸的排列順序、空間結(jié)構(gòu)和數(shù)量有關(guān)，當(dāng)進(jìn)一步水解，具有免疫活性的肽段被水解成更小的肽段或游離氨基酸，從而使該肽段喪失了免疫活性。

2.4Ⅱ型膠原酶解復(fù)合物質(zhì)量濃度對(duì)淋巴細(xì)胞增殖能力的影響

圖8　Ⅱ型膠原酶解復(fù)合物的質(zhì)量濃度對(duì)促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖能力的影響Fig.8　Effect of enzymatic hydrolysate concentration from type II collagen on the proliferation of lymphocytes

由圖8可知，淋巴細(xì)胞增殖能力隨Ⅱ型膠原酶解復(fù)合物質(zhì)量濃度的增加呈顯著增強(qiáng)的趨勢(shì)（P＜0.01）。當(dāng)酶解復(fù)合物質(zhì)量濃度達(dá)到1 mg/mL時(shí)，淋巴細(xì)胞增殖率趨于穩(wěn)定，達(dá)到59.93%。這可能是因?yàn)檩^高質(zhì)量濃度的Ⅱ型膠原酶解復(fù)合物有利于其抗原表位與APC表面的HLAⅡ類分子相結(jié)合，并形成HLA-抗原肽復(fù)合物，該復(fù)合物可與T細(xì)胞表面受體分子發(fā)生特異性結(jié)合，進(jìn)而激活自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的免疫應(yīng)答，使其活化并促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖。

2.5Ⅱ型膠原酶解復(fù)合物分子質(zhì)量的分布

采用高效凝膠過濾色譜法對(duì)淋巴細(xì)胞增殖能力在最低（水解度5%）和最高（水解度18%）時(shí)的Ⅱ型膠原酶解復(fù)合物的分子質(zhì)量分布進(jìn)行測(cè)定，其洗脫曲線如圖9、10所示，酶解復(fù)合物分子質(zhì)量分布如表1所示。

圖9　水解度為55%時(shí)Ⅱ型膠原酶解復(fù)合物分子質(zhì)量分布Fig.9　Molecular weight distribution profile of enzymatic hydrolysates with 5% DH from type II collagen

圖10　水解度為18%時(shí)Ⅱ型膠原酶解復(fù)合物分子質(zhì)量分布Fig.10　Molecular weight distribution profile of enzymatic hydrolysates with 18% DH from type II collagen

表1　水解度5%和18%Ⅱ型膠原酶解復(fù)合物的分子質(zhì)量分布百分比Table1　Molecular weight distribution of enzymatic hydrolysates with 5% and 18 d 18% DH from type II collagen %

如圖9和圖10所示，隨著水解度的增大，Ⅱ型膠原酶解復(fù)合物的分子質(zhì)量分布總體表現(xiàn)為大分子質(zhì)量肽的含量逐漸減少，小分子質(zhì)量肽的含量逐漸增加。由表1可知，水解度為18%時(shí)肽段的分子質(zhì)量主要分布于1 000～180 D，含量達(dá)75.21%，而水解度為5%時(shí)分布于1 000～180 D的肽段僅占61.61%。結(jié)合淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知水解度為18%時(shí)Ⅱ型膠原酶解復(fù)合物促淋巴細(xì)胞增殖的能力最強(qiáng)，由此可以初步推斷Ⅱ型膠原酶解復(fù)合物的免疫活性與其分子質(zhì)量有一定的相關(guān)性，分子質(zhì)量在1 000～180 D的肽類物質(zhì)可能是Ⅱ型膠原酶解復(fù)合物促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖的主要活性來源。由于氨基酸的平均分子質(zhì)量大約為120 D，因此對(duì)于分子質(zhì)量為1 000～180 D的Ⅱ型膠原酶解復(fù)合物而言，大約2～8 個(gè)氨基酸組成的多肽可能對(duì)Ⅱ型膠原酶解復(fù)合物的免疫活性貢獻(xiàn)較大。Sakanaka等［16］研究也發(fā)現(xiàn)免疫活性較高的肽段主要分布于分子質(zhì)量小于1 000 D的范圍內(nèi)；Wang Jinshui等［17］從小麥面筋酶解復(fù)合物中篩選到分子質(zhì)量小于4 200 D的免疫活性肽；徐明生［18］探討了卵白蛋白酶解復(fù)合物中不同分子質(zhì)量肽段的免疫活性，發(fā)現(xiàn)小于3 000 D的肽段免疫活性最強(qiáng)；程云輝［19］篩選出具有較強(qiáng)免疫活性的麥胚蛋白酶解復(fù)合物，其分子質(zhì)量小于1 000 D的組分比例為53.01%。這些研究都表明了分子質(zhì)量較小的肽段具有較高的免疫活性。

3　結(jié) 論

中性蛋白酶對(duì)雞胸軟骨Ⅱ型膠原具有較高的水解能力，其最佳酶解條件為：酶解溫度50 ℃、pH 7.5、底物質(zhì)量濃度25 mg/mL、加酶量40 U/mg、酶解時(shí)間150 min。Ⅱ型膠原在水解度為18%時(shí)對(duì)淋巴細(xì)胞的增殖能力達(dá)到最高，為58.69%。Ⅱ型膠原酶解產(chǎn)物濃度對(duì)淋巴細(xì)胞增殖能力也有顯著影響，當(dāng)其質(zhì)量濃度達(dá)到1 mg/mL時(shí)，對(duì)淋巴細(xì)胞增殖能力達(dá)到59.93%。淋巴細(xì)胞增殖能力較強(qiáng)的Ⅱ型膠原酶解復(fù)合物的分子質(zhì)量主要分布于1 000～180 D范圍內(nèi)，占總含量的75.21%。在今后的工作中，將利用各種分離技術(shù)對(duì)酶解復(fù)合物進(jìn)行分離純化，以期獲得目標(biāo)活性組分，并對(duì)其構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行研究。

［1］ 譚劉欣， 奚永志. Ⅱ型膠原免疫活性肽研究的進(jìn)展［J］. 中華風(fēng)濕病學(xué)雜志， 2009， 13（5）： 341-343.

［2］ 陸雪芹， 許時(shí)嬰， 曹慧. 雞胸軟骨粉中Ⅱ型膠原的提取及結(jié)構(gòu)分析［J］.食品科學(xué)， 2009， 30（4）： 76-80.

［3］ MERISEL H. Overview on milk protein-derived peptides［J］. International Dairy Journal， 1989， 8（5/6）： 363-373.

［4］ HOLM L， BOCKERMANN R， WELLNER E， et al. Side-chain and backbone amide bond requirements for glycopeptide stimulation of T-cells obtained in a mouse model for rheumatoid arthritis［J］. Bioorganic and Medicinal Chemistry， 2006， 14（17）： 5921-5932.

［5］ 曹慧， 張忠慧， 許時(shí)嬰. 雞胸軟骨酶解產(chǎn)物的表征及對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠的免疫調(diào)節(jié)作用［J］. 食品科學(xué)， 2012， 33（3）： 243-247.

［6］ TANG Bo， DAVID D B， MA Zhijun， et al. Pathogenesis of collageninduced arthritis： modulation of disease by arthritogenic T-cell epitope location［J］. Immunology， 2004， 113（3）： 384-391.

［7］ 程永靜， 周強(qiáng)， 栗占國(guó). HLA-DRB1特異性II型膠原多肽序列中氨基酸替換對(duì)T淋巴細(xì)胞免疫的影響［J］. 中華風(fēng)濕病學(xué)雜志， 2004（8）：210-214.

［8］ ROSLONIEC E F， WHITTINGTON K B， ZALLER D M， et al. HLA-DR1 and DR4 use the same anchor residues for binding an immunodominant peptide derived from human type II collagen［J］. The Journal of Immunology： Offi cial Journal of the American Association of Immunologists， 2002， 168（1）： 253-259.

［9］ 李茹， 李霞， 栗占國(guó). 利用Ⅱ型膠原變構(gòu)肽抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者T細(xì)胞活化的研究［J］. 現(xiàn)代免疫學(xué)， 2006， 26（3）： 217-221.

［10］ 王宏坤， 朱平， 李曉燕. 重組人Ⅱ型膠原250-270多肽對(duì)特異性體液免疫的抑制作用［J］. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志， 2006， 22： 742-744.

［11］ MYERS L K， TANG Bo， ROSLONIEC E F， et al. An altered peptide ligand of type II collagen suppresses autoimmune arthritis［J］. Critical Reviews in Food Science and Nutrition， 2007， 27（4）： 345-356.

［12］ TADASHI Y， ELENA T， KUNITAKA O， et al. Peptides of type II collagen can induce the cleavage of type II collagen and aggrecan in articular cartilage［J］. Matrix Biology， 2006， 25（7）： 419-429.

［13］ 石服鑫， 曹慧， 徐斐. 不同來源的Ⅱ型膠原結(jié)構(gòu)及其免疫活性［J］. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2014， 40（2）： 22-26.

［14］ NISSAN J A. Enzymatic hydrolysis of food proteins［M］. London：Elsevier Applied Science Publishers， 1986： 132.

［15］ 朱玉冰， 曹慧， 徐斐， 等. 豬皮膠原酶解產(chǎn)物的制備及其熱滯活性的研究［J］. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2014， 40（2）： 10-15.

［16］ SAKANAKA S， TACHIBANA Y， ISHIHARA N， et al. Antioxidant activity of egg-yolk protein hydrolysates in a linoleic acid oxidation system［J］. Food Chemistry， 2004， 86（1）： 99-103.

［17］ WANG Jinshui， ZHAO Mouming， ZHAO Qiangzhong， et al. Antioxidant properties of papain hydrolysates of wheat gluten in different oxidation systems［J］. Food Chemistry， 2007， 101（4）：1658-1663.

［18］ 徐明生. 雞蛋卵白蛋白酶解物抗氧化肽研究［D］. 西安： 陜西師范大學(xué)， 2006.

［19］ 程云輝. 麥胚蛋白酶解物的制備、結(jié)構(gòu)及其活性功能的研究［D］. 無錫： 江南大學(xué)， 2006.

Preparation and Properties of Immunologically Active Peptide from Type II Collagen from Chicken Sternal Cartilage

LIU Lulu， CAO Hui*， XU Fei， YU Jinsong， YUAN Min
（School of Medical Instrument and Food Engineering， University of Shanghai for Science and Technology， Shanghai 200093， China）

The hydrolysis conditions of type II collagen from chicken sternal cartilage were optimized to obtain increased degree of hydrolysis （DH）. Based on the optimal hydrolysis parameters， enzymatic hydrolysates with different DHs were prepared， and then lymphocyte proliferation test was utilized to evaluate their immunological activ ity. The results showed that neutral protease was the most suitable enzyme for hydrolyzing type II collagen and the optimal hydrolysis conditions were hydrolysis temperature of 50 ℃， hydrolysis pH of 7.5， collagen concentration of 25 mg/mL， enzyme dosage of 40 U/mg，and hydrolysis time of 150 min. The hydrolysates with a DH of 18% could result in proliferation of lymphocytes by up to 58.69%， and the maximal proliferative activity of lymphocytes was found at a concentration of 1 mg/mL. The molecular weight distribution of collagen hydrolysates with higher immunological activity was 1 000-180 D （accounting for 75.21% of the total hydrolysates）.

type II collagen； immunologically active peptide； neutral protease； lymphocyte proliferation

TS202.3

A

1002-6630（2015）13-0084-05

10.7506/spkx1002-6630-201513017

2014-08-31

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2013AA102207）；國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31201421）

劉露露（1991—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)楣δ苄耘淞霞疤砑觿-mail：liululu511@126.com

曹慧（1976—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)楣δ苄耘淞霞疤砑觿-mail：caohuian@126.com