粘質沙雷氏菌搖瓶發酵產靈菌紅素的工藝優化

張丹峰，楊培周，操麗麗，姜紹通*

（合肥工業大學生物與食品工程學院，安徽省農產品精深加工重點實驗室，安徽 合肥 230009）

粘質沙雷氏菌搖瓶發酵產靈菌紅素的工藝優化

張丹峰，楊培周，操麗麗，姜紹通*

（合肥工業大學生物與食品工程學院，安徽省農產品精深加工重點實驗室，安徽 合肥 230009）

為提高靈菌紅素產率，本研究通過單因素試驗和正交試驗優化粘質沙雷氏菌發酵培養基組分和發酵條件，結果表明，最佳培養基配方為：一級大豆油、蛋白胨、NaCl和K2HPO4的添加量分別為4 mL/100 g、1.5%、0.15%和0.15%；最佳發酵條件為：溫度30 ℃、接種量1%、裝液量70 mL/250 mL三角瓶、振蕩培養轉速200 r/min，發酵36 h后，靈菌紅素的產量最大，為2.98 g/L。粘質沙雷氏菌的胞外脂肪酶活力為15 U/mL。

粘質沙雷氏菌；靈菌紅素；單因素試驗；正交試驗

靈菌紅素是由粘質沙雷氏菌（Serratia marcescens）產生的一種次級代謝產物，具有對綠色的反光性的脂溶性色素，易溶于氯仿、甲醇、苯和正己烷等有機溶劑，難溶于水。在酸性條件下呈現紅色，堿性條件下呈黃色［1］，具有抗細菌、抗真菌、抗瘧疾、免疫抑制和抗腫瘤等功能活性［2-3］。近年來的研究結果表明，該色素對癌細胞具有較強的抑制作用，相比傳統的抗癌藥物，靈菌紅素具有副作用小及針對性強的優點，是極具開發潛力的抗腫瘤藥物［4］。

粘質沙雷氏菌能夠以甘油、乙醇和油料作物種子粉末等為底物，發酵生產靈菌紅素［5］。然而，目前的發酵生產靈菌紅素存在的主要問題為：1）底物的純度，例如甘油等屬于化工加工的中間產物，批次間的純度變化較大，提高作為藥品的靈菌紅素產品純度，避免發酵過程的中間污染是其中的重要環節；2）底物的穩定性，例如乙醇等原料屬于揮發性，在處理和發酵過程中容易揮發損失，不利于工業化穩定生產［6］；3）菌株代謝，例如油料種子粉末等固體底物與菌株的接觸面小，而靈菌紅素屬于典型的次生代謝產物，容易受到外界環境的影響，以固體為底物不利于菌株穩定表達靈菌紅素；4）價格和底物利用率，菌株對揮發性底物等的利用率偏低，增加生產成本，影響靈菌紅素的開發價值。因此，開發能夠降低發酵成本，提高發酵速率的新型發酵底物，對于深度開發具有抗癌抗腫瘤的新型藥物-靈菌紅素具有重要意義［7］。已報道的靈菌紅素的產率大多為500～2 000 mg/L［8］，為提高靈菌紅素的產率，本研究以價格相對較低的一級大豆油為碳源，對粘質沙雷氏菌發酵產靈菌紅素的培養基組分和培養條件參數進行優化，確定最佳培養基和發酵培養參數。

1　材料與方法

1.1菌株、培養基與試劑

供試菌株S. marcescens HFUT-1301由合肥工業大學農產品加工研究院提供，已完成對該菌株的形態學觀察、生理生化鑒定、16S rDNA鑒定。

基礎培養基（g/L）：蛋白胨10、牛肉膏20、NaCl 2、K2HPO42、瓊脂18；種子培養基（g/L）：蛋白胨10、酵母膏20、NaCl 2、K2HPO42；發酵培養基（g/L）：蛋白胨10、大豆油30、NaCl 2、K2HPO42。

一級大豆油 益海嘉里安徽糧油工業有限公司；95%乙醇、NaCl、NaOH、K2HPO4（分析純）、甲醇（色譜純） 無錫市展望化工試劑公司；牛肉膏、蛋白胨（分析純） 北京奧博星公司。

1.2儀器與設備

AL104電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；TU-1901雙光束紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；SW-CJ-1F單人雙面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；HZQ-F160恒溫振蕩培養箱 哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；HC-3018R型高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1菌種的活化

挑取一定量的固體培養基上的菌落，在基礎培養基轉接，置于30 ℃的恒溫培養箱培養3 d后，置于冰箱中保存備用。

1.3.2種子液的制備

挑取S. marcescens單菌落接入滅菌后冷卻后的裝有50 mL種子培養基的250 mL三角瓶中，30 ℃、200 r/min在恒溫振蕩培養箱培養12 h，作為種子液。

1.3.3粘質沙雷氏菌生長曲線的繪制

采用比濁法測定菌體的含量，取適量發酵液進行10 倍稀釋，以未接種的培養基做等量稀釋作對照，在600 nm波長處測定細胞懸浮液的光密度（OD）值 。在3 個250 mL的三角瓶中分別裝50 mL種子培養基，分別加入已活化12 h種子液1 mL，30 ℃、200 r/min培養24 h，每隔1 h測定其OD600nm值，繪制粘質沙雷氏菌的生長曲線［9］。

1.3.4菌體生物量測定

采用比濁法測定生物量。取4 mL發酵一定時間后的發酵液進行10 倍稀釋測定細胞懸浮液的OD600nm值，以未接種的培養基作為等量稀釋作對照［11］。

1.3.5靈菌紅素含量測定

以純化后的靈菌紅素為標準樣品［1］，在酸性（pH 3）條件下，測定OD535nm值，以靈菌紅素酸性甲醇溶液質量濃度為橫坐標，OD535nm值為縱坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程為y=1.856 0x-0.013 4（R2=0.999 8），表明OD535nm值和靈菌紅素質量濃度線性關系明顯［10-11］。

采用比色法測定，通過測定稀釋一定倍數的浸提液的OD535nm值，比較各溶液中的靈菌紅素含量。

1.3.6粘質沙雷氏菌發酵培養基和培養條件的優化

1.3.6.1大豆油添加量對靈菌紅素和菌體生長的影響

在初始發酵培養基的基礎上，分別添加2.5、3、3.5、4、4.5 mL/100 g的大豆油，每個梯度做3 組平行。裝液量為100 mL/250 mL三角瓶，按2%的接種量接入對數期的種子液，置于30 ℃、200 r/min的恒溫振蕩培養箱中培養36 h。測定發酵所產靈菌紅素含量和菌體生物量。

1.3.6.2蛋白胨添加量對靈菌紅素和菌體生長的影響

在初始發酵培養基和已優化的單因素的基礎上，分別添加0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%的蛋白胨，每個梯度做3 組平行。裝液量為100 mL/250 mL三角瓶，按2%的接種量接入對數期的種子液，置于30 ℃、200 r/min的恒溫振蕩培養箱中培養36 h。測定發酵所產靈菌紅素含量和菌體生物量。

1.3.6.3NaCl添加量對靈菌紅素和菌體生長的影響

在初始發酵培養基和已優化的單因素的基礎上，分別添加0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%的NaCl，每個梯度做3 組平行。裝液量為100 mL/250 mL三角瓶，按2%的接種量接入對數期的種子液，置于30 ℃、200 r/min的恒溫振蕩培養箱中培養36 h。測定發酵所產靈菌紅素含量和菌體生物量。

1.3.6.4K2HPO4添加量對靈菌紅素和菌體生長的影響

在初始發酵培養基和已優化的單因素的基礎上，分別添加0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%的K2HPO4，每個梯度濃度做3 組平行。裝液量為100 mL/250 mL三角瓶，按2%的接種量接入對數期的種子液，置于30 ℃、200 r/min的恒溫振蕩培養箱中培養36 h。測定發酵所產靈菌紅素含量和菌體生物量。

1.3.6.5培養溫度對靈菌紅素和菌體生長的影響

在初始發酵培養基和已優化的單因素的基礎上，分別設置24、26、28、30、32 ℃的培養溫度，每種溫度梯度做3 組平行。裝液量為100 mL/250 mL三角瓶，按2%的接種量接入對數期的種子液，置于200 r/min的恒溫振蕩培養箱中培養36 h。測定發酵所產靈菌紅素含量和菌體生物量。

1.3.6.6接種量對靈菌紅素和菌體生長的影響

在初始發酵培養基和已優化的單因素的基礎上，分別按接種量0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%對數期的種子液進行接種，每個梯度做3 組平行。裝液量為100 mL/250 mL三角瓶，200 r/min的恒溫振蕩培養箱中培養36 h。測定發酵所產靈菌紅素含量和菌體生物量。

1.3.6.7裝液量對靈菌紅素和菌體生長的影響

在初始發酵培養基和已優化的單因素的基礎上，分別設定250 mL三角瓶裝液量為50、60、70、80、90 mL，每個梯度做3 組平行。200 r/min的恒溫振蕩培養箱中培養36 h。測定發酵所產靈菌紅素含量和菌體生物量。

1.3.6.8恒溫振蕩培養箱轉速對靈菌紅素和菌體生長的影響

在初始發酵培養基和已優化的單因素的基礎上，分別設定搖床轉速為160、180、200、220、240 r/min，每個梯度做3 組平行。置于恒溫振蕩培養箱中培養36 h。測定發酵所產靈菌紅素含量和菌體生物量。

1.3.6.9正交試驗優化

在單因素試驗的基礎上，以靈菌紅素含量為指標，測定已稀釋5 倍的浸提液的OD535nm值，選擇大豆油添加量、蛋白胨添加量、轉速、培養溫度為主要影響因素，進行L9（34）正交試驗。

1.3.7脂肪酶活力測定

取4 個100 mL的錐形瓶，分別于對照瓶（A）和樣品瓶（B-1、B-2、B-3 3組重復實驗）中分別加入5.0 mL的聚乙烯醇橄欖油乳化液和4 mL的磷酸緩沖液，置于37 ℃水浴中預熱保溫10 min，A瓶中加入10 mL 95%的乙醇和1 mL的粗酶液，在B-1、B-2、B-3瓶中分別加入1 mL酶液，塞上瓶塞充分搖動。保溫30 min，在B-1、B-2、B-3瓶加入10 mL 95%乙醇終止反應。錐形瓶中加入酚酞指示劑2 滴，用0.05 mol/L NaOH溶液滴定至微紅色為終點，記下NaOH消耗體積數。酶活單位定義為在37 ℃條件下，每分鐘從橄欖油中釋放出1 μmol脂肪酸的酶量為一個脂肪酶活力（U）［12］。

2　結果與分析

2.1粘質沙雷氏菌生長曲線

圖1　粘質沙雷氏菌生長曲線Fig.1　Growth curve of Serratia marcescens

細菌的菌齡對其增殖代謝具有重要的影響，必須選擇菌齡處于對數期的種子液進行發酵，由圖1可知，0～5 h為適應期，6～15 h為對數期，16～18 h為穩定期，19 h后進入衰亡期。因此，選擇發酵12 h的種子液進行發酵培養，這種菌種中后期活性大，延滯期短，適應性強［9］。

2.2單因素試驗

2.2.1大豆油添加量對靈菌紅素含量和菌體生長的影響

圖2　大豆油添加量對靈菌紅素和菌體生長的影響Fig.2　Effect of soybean oil concentration on prodigiosin production and cell growth

由圖2可知，在大豆油添加量為3 mL/100 g時，靈菌紅素和菌體生物量均達到最大。碳源不足會影響到菌體的生長繁殖代謝，碳源過多，大豆油漂浮在培養液上方阻礙培養基的氣體交換，影響菌體的繁殖和發酵產靈菌紅素［9］。因此，大豆油的適宜添加量為3 mL/100 g。

2.2.2蛋白胨添加量對靈菌紅素含量和菌體生長的影響

圖3　蛋白胨添加量對靈菌紅素和菌體生長的影響Fig.3　Effect of peptone concentration on prodigiosin production and cell growth

由圖3可知，在蛋白胨添加量為1.5%時，靈菌紅素含量和菌體生物量均達到最大。氮源影響粘質沙雷氏菌的代謝生產靈菌紅素，當氮源過多時，培養基中碳氮比例失調也會對粘質沙雷氏菌的繁殖代謝產生一定影響［9］。因此，氮源適宜添加量為1.5%。

2.2.3NaCl添加量對靈菌紅素含量和菌體生長的影響

圖4　NaCl添加量對靈菌紅素和菌體生長的影響Fig.4　Effect of NaCl concentration on prodigiosin production and cell growth

由圖4可知，在NaCl添加量為0.15%時，靈菌紅素和菌體生物量達到最大值。鈉鹽含量過低，會對微生物正常的代謝造成影響，鈉鹽含量過高，會造成細胞外液滲透壓過高，對粘質沙雷氏菌代謝造成影響［9］。因此，NaCl適宜添加量為0.15%。

2.2.4K2HPO4添加量對靈菌紅素含量和菌體生長的影響

圖5　K 5 K2HPOHPO4添加量對靈菌紅素和菌體生長的影響Fig.5　Effect of K2HPO4concentration on prodigiosin production and cell growth

由圖5可知，在K2HPO4添加量為0.15%時，靈菌紅素含量達到最大值。鉀鹽含量過低，不能滿足微生物正常代謝所需的無機鹽，鉀鹽含量過高，會造成細胞外液滲透壓過高，影響沙雷氏菌的正常代謝。因此，K2HPO4適宜添加量為0.15%。

2.2.5培養溫度對靈菌紅素含量和菌體生長的影響

圖6　培養溫度對靈菌紅素和菌體生長的影響Fig.6　Effect of incubation temperature on prodigiosin production and cell growth

由圖6可知，當溫度從24～30 ℃之間變化時，靈菌紅素的含量和菌體生物量隨著溫度的升高而增加，當溫度超過30 ℃時，靈菌紅素的含量和菌體生物量隨著溫度的降低而減少。因此，粘質沙雷氏菌發酵產靈菌紅素的適宜溫度為30 ℃。這與已報道的靈菌紅素最佳發酵溫度28 ℃保持相近［13-15］。

2.2.6接種量對靈菌紅素含量和菌體生長的影響

由圖7可知，當接種量在1%時，靈菌紅素的含量和菌體生物量達到最大值。接種量過小，菌體生長緩慢，延長了發酵周期。接種量過大，菌體增長過快，對營養物質消耗巨多，影響后期靈菌紅素的生產［9］。因此，粘質沙雷氏菌發酵產靈菌紅素的適宜接種量為1%。

圖7　接種量對靈菌紅素和菌體生長的影響Fig.7　Effect of inoculum amount on prodigiosin production and cell growth

2.2.7裝液量對靈菌紅素含量和菌體生長的影響

圖8　裝液量對靈菌紅素和菌體生長的影響Fig.8　Effect of medium volume on prodigiosin production and cell growth

由圖8可知，當裝液量小于在70 mL/250 mL時，靈菌紅素的含量和菌體生物量隨著裝液量的升高而增加，當接種量超過70 mL/250 mL時，靈菌紅素的含量和菌體生物量隨著裝液量的降低而減少。裝液量過小，色素的產率過低。裝液量過大，發酵液中溶氧不足，影響到粘質沙雷氏菌的快速增殖，進一步影響后期靈菌紅素的生產［9］。因此，粘質沙雷氏菌發酵產靈菌紅素的適宜裝液量為70 mL/250 mL。

2.2.8搖床轉速對靈菌紅素含量和菌體生長的影響

圖9　搖床轉速對靈菌紅素含量和菌體生長的影響Fig.9　Effect of shaking speed on prodigiosin production and cell growth

由圖9可知，在搖床轉速達到220 r/min之前，靈菌紅素的含量和菌體生物量隨著搖床轉速的增加而升高，當轉速超過220 r/min時，靈菌紅素的含量和菌體生物量隨著搖床轉速的降低而保持穩定。轉速過低，發酵液溶氧不足，菌體生長緩慢，延長了發酵周期［16］。因此，粘質沙雷氏菌發酵產靈菌紅素的適宜搖床轉速為220 r/min。

2.3正交試驗

在單因素試驗的基礎上，進行L9（34）正交試驗。試驗因素水平設計及結果如表1所示。由極差分析結果可知，影響因素由大到小依次為：大豆油添加量＞蛋白胨添加量＞轉速＞培養溫度。主要因素取最佳水平，次要因素考慮實際情況取值，最佳組合為A3B2C1D2。

表1　正交試驗設計及結果Table1　Results of orthogonal array design

表2　正交試驗方差分析Table2　Analysis of variance of the results of orthogonal array design

方差分析結果如表2所示，大豆油添加量對色素產量影響顯著，蛋白胨添加量、轉速、培養溫度的影響較弱。綜合極差分析和方差分析并結合實際情況［17-20］，取最佳發酵條件為：大豆油添加量為4 mL/100 g、蛋白胨添加量1.5%，轉速200 r/min、培養溫度30 ℃。根據正交試驗結果，對最佳發酵條件進行驗證，重復3 次實驗取平均值，在此最佳工藝條件下靈菌紅素產量為2.98 g/L，菌體生物量測定指數OD600nm為1.752。

2.4最佳發酵條件下的脂肪酶活力

表3　最佳發酵條件下的脂肪酶活力Table3　Lipase activity under optimized fermentation conditions

由表3可知，在大豆油添加量為4 mL/100 g、蛋白胨添加量1.5%、轉速200 r/min、培養溫度30 ℃條件下，發酵液中脂肪酶活力平均值達到15 U/mL，脂肪酶活力較高，說明粘質沙雷氏菌能夠快速、高效分解利用大豆油，實現微生物菌體的大量增殖和靈菌紅素的快速大量生產［21］。且以一級大豆油為碳源進行發酵產靈菌紅素，和國外報道的以工業有機廢棄物以及酒精等作為碳源相比，使用大豆油作碳源可以避免重金屬離子污染，從源頭上保證靈菌紅素產品的純度。

3　結論與討論

本研究分別以靈菌紅素含量和菌體生物量為指標，對以大豆油為碳源發酵產靈菌紅素的培養基組分和發酵條件進行單因素和正交試驗優化，結果表明，最佳培養基組分添加量為一級大豆油4 mL/100 g、蛋白胨1.5%、NaCl 0.15%、K2HPO40.15%；最佳發酵條件為培養溫度30 ℃、接種量1%、裝液量70 mL/250 mL、振蕩培養轉速200 r/min，此時脂肪酶活力達到15 U/mL，靈菌紅素產量最高為2.98 g/L。

使靈菌紅素的產率在已報道的基礎500～2 000 mg/L上提高了0.5 倍，對快速、大量的生產靈菌紅素具有重要指導意義。Chen等［22］報道的粘質沙雷氏菌的靈菌紅素的產率高于本研究的結果，主要原因在于其采用的菌株S. marcescens C3是S. marcescens CH-1脂肪酰轉移酶/乙酰轉移酶同源基因（rssC）的突變株，而本研究采用的菌株是S. marcescens野生菌。

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Optimization of Shake Flask Cultivation Conditions for Prodigiosin Production by Serratia marcescen

ZHANG Danfeng， YANG Peizhou， CAO Lili， JIANG Shaotong*
（Key Laboratory for Agricultural Processing of Anhui Province， School of Biotechnology and Food Engineering，Hefei University of Technology， Hefei 230009， China）

This paper reports the optimization of medium components and fermentation conditions for improved production of prodigiosin by Serratia marcescen using single factor and orthogonal array designs. Results indicated that the optimal medium consisted of 4 mL/100 g of soybean oil， 1.5% of peptone， 0.15% of sodium chloride and 0.15% of potassium dihydrogen phosphate， and the optimal fermentation conditions were determined as 30 ℃， an inoculum size of 1%， 70 mL of medium contained in a 250-mL flask， and cultivation with shaking at 200 r/min. The maximum prodigiosin production achieved after 36 h of cultivation under the optimized conditions was 2.98 g/L， and the activity of extracellular lipase from S. marcescens was 15 U/mL.

Serratia marcescens； prodigiosin； single factor method； orthogonal array design

Q939.97

A

1002-6630（2015）13-0119-06

10.7506/spkx1002-6630-201513023

2014-10-05

“十一五”國家科技支撐計劃項目（2010BAD01B07）；安徽省自然科學基金項目（1408085MC67）

張丹峰（1988—），男，碩士研究生，研究方向為油脂生物化學。E-mail：zdf19881024@126.com

姜紹通（1954—），男，教授，本科，研究方向為糧食及油脂蛋白工程。E-mail：jstxsgj@163.com