八角蓮多酚氧化酶的酶學性質

何軍忠，袁家代，李　維，*，何　兵，段輝國

（1.四川師范大學生命科學學院，四川 成都 610101；2.內江師范學院生命科學學院，四川 內江 641000）

八角蓮多酚氧化酶的酶學性質

何軍忠1，袁家代1，李維1，*，何兵1，段輝國2

（1.四川師范大學生命科學學院，四川 成都 610101；2.內江師范學院生命科學學院，四川 內江 641000）

以鄰苯二酚為底物，研究八角蓮多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）粗提液的酶學特性。結果表明，底物鄰苯二酚最適濃度為1.0 mol/L，八角蓮PPO的最適pH值為7.0，最適溫度為30 ℃，90 ℃高溫處理10 min，八角蓮PPO酶活力僅剩11.92%。PPO催化的酶促褐變反應符合米氏動力學方程，相應動力學參數Km和vmax分別為0.230 7 mol/L和769.23 U/min。抗壞血酸、甘氨酸、乙二胺四乙酸、檸檬酸對酶活性具有抑制作用，十二烷基硫酸鈉表現出激活 作用，亞硫酸氫鈉對酶活性的抑制作用強于硫代硫酸鈉，Al3+和Cu2+對酶活性具有一定的激活作用，Ca2+對酶活性有一定的抑制作用，Mg2+、Fe2+和Fe3+對酶活性影響不顯著。

八角蓮；多酚氧化酶；酶學特性

八角蓮（Dysosma versipellis（Hance.）M. Cheng）隸屬小檗科八角蓮屬，為我國特有的瀕危藥用保護植物。其根莖入藥，具有清熱解毒、祛痰散結等功效［1］。在現代醫學中，八角蓮注射液用于治療流行性出血熱、乙型腦炎、腮腺炎、毒蛇咬傷及癌癥等［2］。藥理研究表明，該屬植物中含有鬼臼毒素，具有抗腫瘤、抗病毒以及免疫調節作用，為抗癌藥VP-16和VM-26的原料［3］。八角蓮分布零星，種群數量不大，對生態環境要求較嚴格，生長緩慢，種子繁殖率較低，制約了天然藥物的進一步開發。目前，通過進行無性繁殖擴大種群數量已成為保護該植物的有效途徑之一，前期研究發現，無性繁殖材料中多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活性是影響其成活的關鍵。多酚氧化酶是植物體內普遍存在的一種末端氧化還原酶［4］，在完整的植物組織中，PPO是與內囊體膜結合在一起的，同酚類底物是相互分離的，因此褐變不會發生［5］，更主要的是，由于酚類物質在正常的植物組織中，作為呼吸傳遞體參與了呼吸代謝作用，酚與醌之間的氧化與還原呈動態平衡。當植物細胞受到破壞后，正常的呼吸鏈被打破，氧氣的浸入造成酚類底物在酚酶的作用下迅速氧化成鄰醌，轉而又快速地通過聚合作用形成褐色素或黑色素［6］。本實驗通過研究八角蓮多酚氧化酶的酶活特性，將有效地指導無性繁殖的取材，提高繁殖成活率，擴大種群數量，以保護該物種。

1　材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

八角蓮（Dysosma versipellis（Hance.）M. Cheng）野生植株采摘于四川雅安碧峰峽境內，經四川師范大學何兵副教授鑒定后移栽于四川師范大學生物園內。

聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）、磷酸二氫鈉、鄰苯二酚、抗壞血酸、甘氨酸、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、檸檬酸、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、氯化鋁、硫酸銅、氯化鈣、氯化鎂、氯化亞鐵、氯化鐵（均為分析純） 成都市萇鉦化玻有限公司。

AR224CN型電子天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；HHS1-Ni型電熱恒溫水浴鍋 北京長安科學儀器廠；TU-1901型雙光束紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2方法

1.2.1粗酶液的提取與活力測定

取八角蓮葉柄5.0 g剪碎，加入PVP 0.05 g和少許石英砂［7］，然后加入10 mL磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.0），在冰浴中快速研磨，10 000 r/min離心20 min，上清液轉入20 mL容量瓶，沉淀用5 mL磷酸鹽緩沖液再提取一次，上清液并入容量瓶，冰浴中定容備用［8-9］。

取0.2 mL粗酶液于試管中，加入3 mL磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.0），搖勻，30 ℃水浴10 min，加入0.5 mL鄰苯二酚（1.0 mol/L），在420 nm波長處測定A420nm值，以0.2 mL滅活的粗酶液加磷酸鹽緩沖液作對照，每30 s讀數1 次，測定5 次［10-12］。酶活力的定義為：每分鐘每克鮮樣吸光度增加0.01為1 個酶活力單位（U/mL）。因此PPO酶活力計算見下式。

式中：ΔA420nm為反應時間內吸光度的變化；VT為提取酶液總體積/mL；m為樣品鮮質量/g；VS為測定時用酶液體積/mL；t為反應時間/min。

1.2.2酶促反應進程的測定

取0.2 mL粗酶液于試管中，加入3 mL磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.0），搖勻，30 ℃水浴10 min，加入0.5 mL鄰苯二酚（1.0 mol/L），在420 nm波長處測定A420nm值，以0.2 mL滅活的粗酶液加磷酸鹽緩沖液作對照，每15 s讀數1 次，直至前后連續3 次檢測的A420nm示值差小于1%時，則認定其酶促反應趨于穩定。

1.2.3八角蓮PPO最適pH值、最適溫度和熱穩定性的測定

分別配制不同pH 3.0～11.0的磷酸鹽緩沖液，按照

1.2.1節的方法測定PPO活力，確定八角蓮PPO作用的最適pH值條件。

取3.0 mL最適pH值的磷酸鹽緩沖溶液和0.5 mL鄰苯二酚（1.0 mol/L），分別在不同溫度（20～90 ℃）的水浴中保溫10 min，取出后迅速加入0.2 mL八角蓮PPO粗酶液，按照1.2.1節方法測定PPO活力，確定八角蓮PPO作用的最適溫度。

將八角蓮PPO粗酶液分別在60、70、80、90 ℃的水浴中分別保溫5、10、15、20、25、30 min，迅速冰浴冷卻至30 ℃，按照1.2.1節方法測定八角蓮PPO活力，研究保溫時間和溫度對八角蓮PPO活性的影響。

1.2.4八角蓮PPO最適底物濃度的測定

在最適pH值條件下，分別以不同濃度的鄰苯二酚（0.10～1.50 mol/L）作為底物，按照1.2.1節方法測定PPO活力，確定八角蓮PPO作用的最適底物濃度。根據Lineweaver-Burk作圖法得米氏常數（Km）和最大反應速率（vmax）。

1.2.5有機酸對PPO活性的影響

在加有3 mL磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.0）、0.5 mL鄰苯二酚（1.0 mol/L）和0.2 mL八角蓮PPO粗酶液的反應體系中，分別加入0.2 mL不同質量濃度的抗壞血酸、甘氨酸、EDTA、檸檬酸、SDS溶液，30 ℃保溫10 min，在420 nm波長處測定PPO活力。以不加有機酸所測酶活力為100%，計算PPO相對酶活力。

1.2.6還原劑對PPO活性的影響

在加有3 mL磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.0）、0.5 mL鄰苯二酚（1.0 mol/L）和0.2 mL八角蓮PPO粗酶液的反應體系中，分別加入0.2 mL不同質量濃度的亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉溶液，30 ℃保溫10 min，在420 nm波長處測定PPO活力。以不加還原劑所測酶活力為100%，計算PPO相對酶活力。

1.2.7金屬離子對PPO活性的影響

在加有3 mL磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.0）、0.5 mL鄰苯二酚（1.0 mol/L）和0.2 mL八角蓮PPO粗酶液的反應體系中，分別加入0.2 mL不同質量濃度的CuSO4、CaCl2、MgCl2、FeCl2、FeCl3、AlCl3溶液，30 ℃保溫10 min，在420 nm波長處測定PPO活力。以不加金屬離子所測酶活力為100%，計算PPO相對酶活力。

1.3數據統計與分析

利用Excel 2007統計分析所有數據，計算標準偏差并制圖，結果均平行測定3 次。

2　結果與分析

2.1八角蓮PPO酶促反應進程

圖1　八角蓮PPO酶促反應進程曲線Fig.1　Reaction time course catalyzed by PPO from D. versipellis

由圖1可知，八角蓮PPO酶促反應速率在0～3 min內較快，之后反應變慢，5 min后反應趨于穩定。在反應最初始3 min內吸光度的變化幾乎成線性增加，其線性回歸方程為Y=0.345 9X+0.510 3（R2=0.994 9）。說明八角蓮PPO酶促反應速率較快，產物生成量與時間呈正比關系，隨著時間的延長，曲線斜率逐漸降低并趨于平坦，這可能與酶作用底物的消耗和產物的積累對酶的抑制有關。為了正確測定酶促反應速率，本實驗采用前3 min反應時間內的吸光度的變化以計算酶活力。

2.2pH值對八角蓮PPO活性的影響

圖2　pH值對八角蓮PPO活性的影響Fig.2　Effect of pH on the activity of PPO from D. versipellis

由圖2可知，pH值對八角蓮PPO活性的影響很大，該酶對環境酸堿度較為敏感。在測定的pH值范圍內，八角蓮PPO的活性整體上呈先增大后減小趨勢，當pH值為7.0時，八角蓮PPO活性最強，不同于結球生菜，其PPO活性適宜pH值為8.0，偏堿性［13］。當pH＜3.0時，PPO活性顯著被抑制；pH值在4.0～7.0范圍內，pH值增大，酶活性增加；當pH＞7.0時，pH值升高，酶活性降低；當pH＞9.0時，PPO活性顯著被抑制。這可能是因為PPO是堿性蛋白質，在較強酸性環境下，PPO中的銅解離出來，使酶失活；當pH值大于7.0時，在堿性環境中，PPO中的輔基銅解離，形成不溶性的氫氧化銅，使其活性降低［14］。

2.3溫度對八角蓮PPO活性的影響

圖3　溫度對八角蓮PPO活性的影響Fig.3　Effect of temperature on the PPO activity of D. versipellis

溫度對PPO活性的影響是雙重的。溫度升高能加快酶催化反應速率，同時也能促使酶蛋白質變性，這是兩種對抗效應的綜合反應。因為PPO是蛋白質酶，不適宜的溫度會破壞其活性部位三維結構的完整性和穩定性，從而使PPO失活；而這種結構又是保持PPO活性的關鍵因素［15-16］。由圖3可知，在所測范圍內，隨著溫度的增加，八角蓮PPO活性呈現先升高后降低的趨勢，峰值出現在30 ℃；溫度在30 ℃以下時，PPO活性隨溫度升高而增加；溫度在30 ℃以上時，PPO活性隨著溫度升高而降低；溫度高于60 ℃時，PPO活性迅速下降，到達90 ℃時，PPO活性幾乎消失。

2.4八角蓮PPO的熱穩定性

圖4　八角蓮PPO的熱穩定性Fig.4　Thermostability of PPO from D. versipellis

將粗酶液在60～90 ℃條件下分別處理5～30 min后，測定八角蓮PPO的活性，結果如圖4所示，隨著加熱時間的延長，PPO活性不斷降低。PPO在60 ℃時較穩定，該溫度下加熱30 min仍能保有49.88%的酶活力；70 ℃以上加熱15 min，PPO活性損失嚴重，如90 ℃加熱5 min，酶活力僅剩24.23%，加熱10 min，酶活力僅剩11.92%。

2.5底物濃度對八角蓮PPO活性的影響

分別以0.1～1.5 mol/L的鄰苯二酚溶液為底物，研究底物濃度對八角蓮PPO活性的影響，結果如圖5所示，并以此來研究八角蓮PPO的動力學特性。鄰苯二酚的濃度對酶活力測定有顯著影響。當底物濃度在0.1～1.0 mol/L之間時，酶活力與底物濃度呈正相關，表現為一級反應；當底物濃度大于1.0 mol/L時，酶活力增長變緩，趨于平穩。這是由于底物濃度較低時，并非所有的酶分子都能與底物相結合，隨著底物濃度增加，越來越多的酶分子都與底物結合，使酶促反應進行。在達到一定濃度后，所有的酶活性部位都與底物結合，此時酶被底物飽和，進一步增加底物濃度也不能提高酶的活性，酶活性達到最大值［17］。因此，后期實驗均采用1.0 mol/L的鄰苯二酚作為底物，以確保酶液反應完全。

圖5　底物濃度對八角蓮PPO活性的影響Fig.5　Effect of substrate concentration on the activity of PPO from D. versipellis

圖6　鄰苯二酚為PPO底物的雙倒數曲線圖Fig.6　Lineweaver-Burk curve of PPO using catechol as the substrate

由圖6可知，以鄰苯二酚做為八角蓮PPO底物時，其反應規律符合米氏方程，根據圖中直線斜率和縱軸截距，求得底物的Km和vmax分別為0.230 7 mol/L和769.23 U/min。

2.6有機酸對八角蓮PPO活性的影響

2.6.1抗壞血酸對八角蓮PPO活性的影響

圖7　不同質量濃度抗壞血酸對八角蓮PPO活性的影響Fig.7　Effect of ascorbic acid concentration on PPO activity of D. versipellis

由圖7可知，抗壞血酸能有效抑制八角蓮中PPO的活性，同佛手瓜［18］和芒果［19］PPO活性研究一樣，隨著抗壞血酸質量濃度的增加，酶活性顯著降低。添加質量濃度為2.0 g/100 mL的抗壞血酸時，八角蓮PPO相對酶活力只有16.6%。這可能是因為抗壞血酸既可以作為醌的還原劑，又可以作為酶分子中銅離子的螯合劑，甚至它可以被PPO直接氧化，起到競爭性抑制劑的作用［20］。

2.6.2甘氨酸對八角蓮PPO活性的影響

圖8　不同質量濃度甘氨酸對八角蓮PPO活性的影響Fig.8　Effect of glycine concentration on PPO activity of D. versipellis

由圖8可知，甘氨酸對八角蓮PPO的抑制效果較為顯著，添加質量濃度為0.1 g/100 mL的甘氨酸時，八角蓮PPO相對酶活力為78.2%，添加質量濃度為0.5 g/100 mL的甘氨酸時，相對酶活力降為45.6%，繼續加大甘氨酸質量濃度，酶活力下降不顯著。

2.6.3EDTA對八角蓮PPO活性的影響

圖9　不同質量濃度EDTA對八角蓮PPO活性的影響Fig.9　Effect of EDTA concentration on PPO activity of D. versipellis

由圖9可知，EDTA對八角蓮PPO活性有抑制作用，添加質量濃度為1.0 g/100 mL的EDTA時，相對酶活力為43.2%。這 是因為EDTA具有較強的螯合能力，能螯合多酚氧化酶中Cu2+，從而抑制PPO的活性［21］。

2.6.4檸檬酸對八角蓮PPO活性的影響

圖10　不同質量濃度檸檬酸對八角蓮PPO活性的影響Fig.10　Effect of citric acid concentration on PPO activity of D. versipellis

由圖10可知，隨著檸檬酸質量濃度的增加，八角蓮PPO活性受抑制加強。添加質量濃度為10 g/100 mL的檸檬酸時，八角蓮PPO相對酶活力為45.6%，說明八角蓮PPO活性對檸檬酸具有較強的適應性。有別于榆黃菇PPO特性［22］，檸檬酸在低質量濃度時對酶活性有一定的促進作用，高質量濃度才有一定的抗褐變效果。這可能是由于檸檬酸對PPO的銅離子有較強的螯合作用，同時檸檬酸的酸性使體系偏離PPO最適pH值，酸性溶液中氧氣溶解度較小而兼有抗氧化作用，從而抑制酶的活性。

2.6.5SDS對八角蓮PPO活性的影響

圖11　不同質量濃度SDS對八角蓮PPO活性的影響Fig.11　Effect of SDS concentration on PPO activity of D. versipellis

由圖11可知，隨著SDS質量濃度的增加，八角蓮PPO活性逐漸增強。添加質量濃度為0.5 g/100 mL的SDS時，相對酶活力增強121%；添加質量濃度為2.0 g/100 mL的SDS時，PPO活性增加到221%；繼續加大SDS的質量濃度，PPO活性增強不顯著。同目前對多種果蔬的研究結果類似，SDS可以使PPO的構象發生輕微變化，從而顯著增強PPO的活性，研究發現0.5 mmol/L或12.5 mmol/L SDS分別使紅熟番茄果實PPO活性增加67.8%或120%［23］；12.5 mmol/L SDS使菜花PPO活性增加280.0%［24］；25 mmol/L的SDS可以使鴨梨果實PPO活性增強435%［25］。

2.7還原劑對八角蓮PPO活性的影響

2.7.1亞硫酸氫鈉對八角蓮PPO活性的影響

圖12　不同質量濃度亞硫酸氫鈉對八角蓮PPO活性的影響Fig.12　Effects of NaHSO3concentration on PPO activity of D. versipellis

由圖12可知，亞硫酸氫鈉能有效抑制八角蓮中PPO的活性，隨著亞硫酸氫鈉質量濃度的增加，酶活性顯著降低。添加質量濃度為0.5 g/100 mL的亞硫酸氫鈉時，相對酶活力只有16.2%。這可能是因為亞硫酸氫鈉主要通過與醌生成無色的加成產物，降低了PPO對一元酚和二羥基酚作用的活力，同時與氨基酸等反應生成雙硫鍵化合物，從而抑制PPO的活性。同徐芹等［26］關于碭山酥梨PPO活性的研究類似，亞硫酸氫鈉濃度為6 mmol/L時，PPO活性的受抑制程度達到74.47%。

2.7.2硫代硫酸鈉對八角蓮PPO活性的影響

圖13　不同質量濃度硫代硫酸鈉對八角蓮PPO活性的影響Fig.13　Effect of Na2S2O3concentration on PPO activity of D. versipellis

由圖13可知，硫代硫酸鈉對八角蓮PPO活性具有一定的抑制作用，隨著硫代硫酸鈉質量濃度的增大，對PPO活性的抑制作用增強，當硫代硫酸鈉達到0.5 g/100 mL時，PPO的相對酶活力降到34.2%，原因應該與硫代硫酸鈉的還原性有關，主要通過不可逆地與醌生成無色的加成產物，降低了酶作用于一元酚和二羥基酚的活力［27］。

2.8金屬離子對八角蓮PPO活性的影響

圖14　不同質量濃度金屬離子對八角蓮PPO活性的影響Fig.14　Effect of metal ion concentration on PPO activity of D. versipellis

由圖14可知，在所測范圍內，各金屬離子對八角蓮PPO活性的影響為：Al3+質量濃度在0.08 g/100 mL以內時，對PPO的酶活力具有一定的激活作用［28］，隨著質量濃度的增大對酶活性逐漸表現為抑制作用；Cu2+質量濃度在0.04 g/100 mL以內時，對PPO的酶活力具有一定的激活作用［29］，隨著質量濃度的增大其酶活性逐漸降低，這可能是因為PPO酶是一種含銅離子的酶，適當的銅離子質量濃度有助于提高PPO的活性，同時銅離子可以靜電穩定、屏蔽負電荷等途徑參加到氧化還原反應中，從而增強PPO的催化能力［21，30］；Ca2+對八角蓮的酶活力具有一定抑制作用，Ca2+質量濃度為0.1 g/100 mL時，八角蓮PPO相對酶活力降為67.2%；Mg2+、Fe2+和Fe3+對八角蓮PPO的酶活性幾乎沒有作用。

3　結 論

目前對于PPO活性的研究多集中在果蔬類，如菜花、番茄、梨、絲瓜等，其目的在于有效控制酶促褐變反應的發生，以便更好地保存和加工。關于八角蓮中PPO的酶學特性的研究，僅見于秦小波［31］對峨眉八角蓮PPO活性研究的報道，他初步考察了不同pH值、不同溫度和不同底物濃度對PPO活性的影響。但關于八角蓮PPO是否存在同工酶，尚未見到相關研究報道，由于本實驗的酶活力檢測是以鄰苯二酚為底物，分析八角蓮PPO粗提液的酶學特性，如果存在同工酶，所獲得的酶學特性即為多種同工酶的綜合表現。

本實驗在熱穩定性、酶反應動力學、激活劑和抑制劑等方面更為全面地開展了有關八角蓮PPO特性的相關研究，結果表明，以鄰苯二酚為底物，其最適緩沖液pH值為7.0，最適反應溫度為30 ℃，70 ℃以上加熱15 min，PPO活性損失嚴重，90 ℃加熱10 min，酶活力僅剩11.92%，底物鄰苯二酚最適濃度為1.0 mol/L，Km和vmax分別為0.230 7 mol/L和769.23 U/min。

有機酸對PPO活性的影響結果表明，抗壞血酸、甘氨酸、EDTA、檸檬酸對酶活性有抑制作用；SDS表現出激活作用。還原劑對PPO活性的影響結果表明，亞硫酸氫鈉對酶活性的抑制作用強于硫代硫酸鈉。金屬離子對八角蓮PPO活性的影響結果表明，在所測范圍內，Al3+和Cu2+在低質量濃度時對酶活性有一定的激活作用，隨著質量濃度的增大其酶活性逐漸降低；Ca2+對酶活性具有一定的抑制作用；Mg2+、Fe2+和Fe3+對酶活性幾乎沒有作用。

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Enzymatic Properties of Polyphenol Oxidase from Dysosma versipellis （Hance.） M. Cheng

HE Junzhong1， YUAN Jiadai1， LI Wei1，*， HE Bing1， DUAN Huiguo2
（1. College of Life Science， Sichuan Normal University， Chengdu 610101， China；2. College of Life Science， Neijiang Normal University， Neijiang 641000， China）

Enzymatic characterization of polyphenol oxidase （PPO） from the leaves of Dysosma versipellis （Hance.） M. Cheng was investigated using catechol as the reaction substrate. The results showed that the optimal substrate was catechol at a concentration of 1.0 mol/L， and the optimal pH and temperature for this enzyme were 7.0 and 30 ℃， respectively. The remaining activity of PPO was 11.92% after thermal treatment at 90 ℃ for 10 min. The kinetics of PPO reaction was fit to the Michaelis-Menten equation， with Kmand vmaxvalue of 0.230 7 mol/L and 769.23 U/min， respectively. Different inhibitory effects on PPO among ascorbic acid， glycine， EDTA and citric acid were observed. NaHSO3showed stronger inhibitory effect on PPO than Na2S2O3. The PPO could be activated by Al3+， Cu2+and SDS. Ca2+had certain inhibitory effect on the PPO enzyme. In contrast， Mg2+， Fe2+and Fe3+had no significant effect on the enzyme activity （P ＜ 0.05）.

Dysosma versipellis （Hance.） M. Cheng； polyphenol oxidase； enzymatic properties

Q814.1

A

1002-6630（2015）13-0137-06

10.7506/spkx1002-6630-201513026

2014-07-06

四川省科技支撐計劃項目（2012SZ0074）；四川省教育廳重點項目（13ZA0145）；四川師范大學校級重點科研基金項目（2013-12）

何軍忠（1989—），男，碩士研究生，研究方向為生物化學與分子生物學。E-mail：799243209@qq.com

李維（1972—），男，教授，博士，研究方向為天然藥物的微生物轉化。E-mail：weelee201@aliyun.com